‹#› 1 Enzymy Doc. RNDr. Jiří Dostál, CSc. Biochemický ústav LF MU ‹#› 2 Obecné vlastnosti enzymů • •biokatalyzátory •různé proteiny / také RNA (ribozym) • s kovalentně vázanou prostetickou skupinou (kovem) • oligomerní / multienzymové komplexy / asociované s membránami atd. •tvoří izoformy - různá distribuce v těle i v buňce •specifické, vysoce účinné •fungují za mírných podmínek •in vivo - mohou být regulovány •in vitro - citlivé na vnější podmínky POZOR: peptidyltransferasa je ribozym (AK)n-tRNA1 + AK-tRNA2 ® tRNA1 + (AK)n+1-tRNA2 rRNA ‹#› 3 Enzymy jsou vysoce účinné katalyzátory •snižují aktivační energii Þ urychlují reakce •účinnost o mnoho řádů vyšší než u jiných katalyzátorů •reakce s enzymem jsou o 106-1014 rychlejší než bez enzymu •nemají vliv na rovnovážnou konstantu K •z reakce vycházejí nezměněny •poměrně málo stabilní • Kdyby reakce v biol. systémech nebyly katalyzovány enzymy, byly by tak pomalé, že by nemohly zajistit existenci živé hmoty ‹#› 4 V lidském těle jsou enzymy regulovány •Aktivita enzymu •aktivátory •inhibitory •kovalentní modifikace (fosforylace) •Množství enzymu •regulace proteosyntézy a proteolýzy enzymu •některé hormony – induktory × represory • ‹#› 5 Specifičnost enzymů je dvojí •Účinková •z možných reakcí substrátu katalyzují pouze jedinou • • •Substrátová •z možných substrátů pro určitou reakci si vybírají jediný (nebo jedinou skupinu substrátů) •často stereospecifické ‹#› 6 Enzymy jsou stereospecifické katalyzátory •existují dva typy přeměn: •achirální substrát ® chirální produkt(jeden enantiomer) • např. pyruvát ® L-laktát, fumarát ® L-malát •chirální substrát(jeden enantiomer) ® produkt • L-alanin ® pyruvát (D-alanin nereaguje) • D-glukosa ® ® pyruvát (L-glukosa nereaguje) • chirální signální molekula ® komplex s receptorem ® biologická odpověď • chirální léčivo(ant)agonista ® komplex s receptorem ® farmakologická odpověď ‹#› 7 Názvy enzymů jsou dvojí •Doporučené triviální •zjednodušené •některé historické • (pepsin, amylasa, lipasa) • • •Systematické •přípona -asa •obsahují informaci o substrátu a typu reakce •číselný kód EC EC (Enzyme Commission) of International Union of Biochemistry (IUB) major class number . subclass number . sub-subclass number . enzyme number http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/ ‹#› 8 Příklady názvů •Doporučený triviální název: alkoholdehydrogenasa •Systematický název: EC 1.1.1.1 ethanol:NAD+-oxidoreduktasa •Reakce: ethanol + NAD+ ® acetaldehyd + NADH + H+ •Doporučený triviální název: alaninaminotransferasa (ALT) •Systematický název: EC 2.6.1.2 L-alanin:2-oxoglutarát-aminotransferasa •Reakce: L-alanin + 2-oxoglutarát ® pyruvát + L-glutamát ‹#› 9 Klasifikace enzymů: šest tříd podle typu reakce [každá třída má další podtřídy] Třída enzymu Obecné schéma reakce 1. Oxidoreduktasy Ared + Box D Aox + Bred 2. Transferasy A-B + C ® A + C-B 3. Hydrolasy A-B + H2O ® A-H + B-OH 4. Lyasy A-B D A + B (opačný směr: synthasy) 5. Isomerasy A-B-C D A-C-B 6. Ligasy (synthetasy) A + B + ATP ® A-B + ADP + Pi ‹#› 10 1 Oxidoreduktasy •katalyzují oxidaci nebo redukci substrátu • podtřídy: •dehydrogenasy katalyzují transfer 2 H atomů •oxygenasy katalyzují zabudování jednoho nebo dvou O atomů do substrátu (monooxygenasy, dioxygenasy) •oxidasy katalyzují transfer elektronů mezi substráty • (cytochrom-c-oxidasa, ferroxidasa) •peroxidasy katalyzují rozklad peroxidů Příklad: laktát + NAD+ D pyruvát + NADH + H+ Doporučený název: laktátdehydrogenasa Systematický název: (S)-laktát:NAD+ oxidoreduktasa ‹#› 11 2 Transferasy •katalyzují transfer skupiny za jednoho substrátu na druhý •Podtřídy: •aminotransferasy, methyltransferasy, glukosyltransferasy •kinasy - fosforylace substrátů = transfer fosforylu PO32– z ATP na substrát (hexokinasy, proteinkinasy) Příklad: glukosa + ATP ® glukosa-6-P + ADP Doporučený název: glukokinasa Systematický název: ATP:D-glukosa fosfotransferasa ‹#› 12 Příklad: glukosa-6-P + H2O ® glukosa + Pi Doporučený název: glukosa-6-fosfatasa Systematický název: glukosa-6-fosfát fosfohydrolasa 3 Hydrolasy •katalyzují hydrolytické štěpení esterů, glykosidů, amidů, peptidů apod. podtřídy: •esterasy (lipasy, fosfolipasy, ribonukleasy, fosfatasy) •glykosidasy (sacharasa, maltasa, laktasa, amylasa) •proteinasy a peptidasy (pepsin, trypsin, kathepsiny, kaspasy, dipeptidasy, karboxypeptidasy, aminopeptidasy) •amidasy (glutaminasa, asparaginasa) •ATPasy (štěpí anhydridové vazby v ATP) ‹#› 13 Jazyková poznámka: lysozym × lyzosom •Lysozym je enzym •složenina, lyso (řec. lysis štěpit) + zym (od enzym) •hydrolasa, glykosidasa, štěpí β-1,4-glykosidovou vazbu v bakteriálních mukopolysacharidech •ve slinách, slzách, sekretech apod. • •Lyzosom (lysosom) je organela •složenina, z řečtiny, lysis – štěpit, soma – tělo •typická pro živočišné buňky •kyselé pH, obsahuje četné kyselé hydrolasy ‹#› 14 4 Lyasy katalyzují nehydrolytické štěpení nebo vznik vazeb C–C, C–O, C–N, C–S odstraněním nebo přidáním malé molekuly jako H2O, CO2, NH3 • amoniak lyasy (histidinamoniaklyasa: histidin ® urokanát + NH3) • dekarboxylasy aminokyselin (aminokyselina ® amin + CO2) • aldolasy (štěpení nebo vznik aldolu) • dehydratasy/hydratasy (karbonátdehydratasa: CO2 + H2O D H2CO3) Příklad: fumarát + H2O D L-malát Doporučený název: fumaráthydratasa Systematický název: (S)-maláthydrolyasa ‹#› 15 5 Isomerasy •katalyzují intramolekulární přesmyky, příklady: •epimerasy •racemasy •mutasy Příklad: UDP-glukosa ® UDP-galaktosa Doporučený název: UDP-glukosa 4-epimerasa Systematický název: UDP-glukosa 4-epimerasa ‹#› 16 6 Ligasy •katalyzují vznik vazeb C–C, C–O, C–N za současného štěpení ATP •karboxylasy •synthetasy • (glutaminsynthetasa: glutamát + ATP + NH3 ® glutamin + ADP + Pi) • • Příklad: pyruvát + CO2 + ATP + H2O ® oxalacetát + ADP + Pi Doporučený název: pyruvátkarboxylasa Systematický název: pyruvát:CO2 ligasa ‹#› 17 Tři enzymy „mají něco“ s fosfátem Enzym (Třída) Schéma reakce / Typ reakce Kinasa (Transferasa) substrát-OH + ATP ® substrát-O-P + ADP fosforylace = transfer fosforylu z ATP na substrát Fosfatasa (Hydrolasa) substrát-O-P + H2O ® substrát-OH + Pi hydrolýza fosfoesterové vazby Fosforylasa (Transferasa) (glykogen)n + Pi ® (glykogen)n-1 + glukosa-1-P fosforolýza = štěpení O-glykosidové vazby fosfátem = transfer glukosylu na anorganický fosfát ‹#› 18 Tři různé složky v enzymové reakci kofaktormodif enzym substrát kofaktor D produkt + + 1.substrát(y) 2.kofaktor 3.enzym katalyzuje (= koordinuje + urychluje) reakci přímo spolu reagují Poznámky: • substrát může být jeden nebo dva (dehydrogenace × transaminace) • substrát může být nízko / vysokomolekulární (hexokinasa × proteinkinasa) • některé reakce probíhají bez kofaktoru (např. hydrolýzy) • reakce může vratná i nevratná (dehydrogenace × dekarboxylace) ‹#› 19 Kofaktory enzymů jsou deriváty vitaminů •nízkomolekulární neproteinové sloučeniny •přenášejí 2 H nebo e- ® oxidoreduktasy •přenášejí skupiny ® transferasy •pevně vázané - prostetická skupina •volně vázané - koenzymy (kosubstráty) ‹#› 20 Oxidovaná forma Redukovaná forma Funkce kofaktoru NAD+ (niacin) NADP+ (niacin) FAD (riboflavin) Dihydrobiopterin (BH2) Molybdopterinoxid Lipoát (-S-S-) Ubichinon (Q) Hem-Fe3+ Nehem-S-Fe3+ Glutathionoxid (G-S-S-G) NADH+H+ NADPH+H+ FADH2 tetrahydrobiopterin (BH4) molybdopterinred dihydrolipoát (2 -SH) ubichinol (QH2) hem-Fe2+ nehem-S-Fe2+ glutathionred (GSH) NAD+ akceptor 2 H NADPH+H+ donor 2 H FAD akceptor 2 H BH4 donor 2 H přenos elektronů antioxidant / přenos acylu přenos 2 elektronů a 2 H+ přenos 1 elektronu přenos 1 elektronu 2 GSH donorem 2 H Kofaktory oxidoreduktas ‹#› 21 Nikotinamid (niacin, vitamin B3) (pyridin-3-karboxylová) játra, maso, kvasnice, částečně vzniká z tryptofanu ‹#› 22 Struktura NAD+ odvozen od vitaminu niacinu ‹#› 23 NAD+ je dehydrogenační činidlo •nikotinamidadenindinukleotid •kofaktor dehydrogenas •odnímá 2H ze substrátu •jeden se jako hydridový anion H- aduje do p-polohy pyridiniového kruhu •druhý se jako proton H+ váže na enzym 2 H = H– + H+ ‹#› 24 Redoxní pár kofaktoru oxidovaná forma NAD+ redukovaná forma NADH aromatický kruh aromaticita zcela porušena čtyřvazný dusík trojvazný dusík kladný náboj na dusíku neutrální sloučenina vysoký obsah energie ‹#› 25 Typické NAD+ dehydrogenace Substrát Produkt primární alkohol sekundární alkohol aldehyd hydrát hemiacetal cyklický hemiacetal hydroxykyselina aminokyselina aldehyd keton karboxylová kys. ester lakton oxokyselina iminokyselina ‹#› 26 Redukovaný kofaktor NADPH+H+ je hydrogenační činidlo •donor 2H při hydrogenaci •kofaktor redukčních syntéz (mastné kyseliny, cholesterol) •regenerace glutathionu (GSH) v erytrocytech •kofaktor hydroxylačních reakcí: • cholesterol ® ® žlučové kyseliny • kalciol ® ® kalcitriol • xenobiotikum ® hydroxylované xenobiotikum •obecné schéma hydroxylace: R-H + O2 + NADPH+H+ ® R-OH + H2O + NADP+ ‹#› 27 Riboflavin obsahuje ribitol navázaný na flavin (dimethylisoalloxazin) ‹#› 28 Struktura FAD dimethylisoalloxazin ribitol adenin ribosa difosfát odvozen od vitaminu riboflavinu ‹#› 29 FAD je dehydrogenační činidlo •flavinadenindinukleotid •kofaktor flavinových dehydrogenas •dehydrogenace -CH2-CH2- skupiny •2H se vážou na dva dusíky riboflavinu •příklad: dehydrogenace sukcinátu na fumarát (CC) • ‹#› 30 Vitamin Kofaktor Přenášená skupina Pyridoxin (Vzniká v těle) (Vzniká v těle) Biotin Pantothenová kys. (Vzniká v těle) (Methionin) Listová kys. (folát) Kyanokobalamin Thiamin pyridoxalfosfát ATP PAPS karboxybiotin CoA-SH dihydrolipoát SAM tetrahydrofolát methylkobalamin thiamindifosfát -NH2 (transaminace) -PO32- (fosforyl) -SO32- CO2 acyl acyl -CH3 C1 skupiny -CH3 zbytek některých oxokyselin Vitaminy a kofaktory transferas ‹#› 31 Pyridoxalfosfát je kofaktor transaminace a dekarboxylace aminokyselin vzniká aldimin (Schiffova báze) ‹#› 32 Karboxybiotin je kofaktor karboxylačních reakcí + ‹#› 33 Rozlišujte: Dekarboxylace vs. Karboxylace Kofaktor Dekarboxylace Thiamin-diP pyruvát ® acetyl-CoA + CO2 2-oxoglutarát ® sukcinyl-CoA + CO2 Pyridoxal-P aminokyselina ® amin + CO2 Žádný acetoacetát ® aceton + CO2 (neenzymová, spontánní) Kofaktor Karboxylace Biotin pyruvát + CO2 + ATP ® oxalacetát acetyl-CoA + CO2 + ATP ® malonyl-CoA propionyl-CoA + CO2 + ATP ® methylmalonyl-CoA ® sukcinyl-CoA karboxylace (+ ATP) během katabolismu Val, Leu, Ile Fylochinon (vitamin K ) protein-Glu + O2 + fylochinonred + CO2 ® protein-γ-karboxyGlu posttranslační karboxylace glutamátu, srážení krve Žádný Hb-NH2 + CO2 ® Hb-NH-COOH (nestabilní Hb-karbamát, spontánně) ‹#› 34 Koenzym A (CoA-SH) přenáší acyly pantoová kyselina ‹#› 35 S-Adenosylmethionin (SAM) •„aktivní methyl“, trojvazná síra Þ sulfoniový kation •kofaktor methylačních reakcí: • ethanolamin → cholin • guanidinacetát → kreatin • noradrenalin → adrenalin •z methioninu vzniká homocystein •pro remethylaci homocysteinu je nutný methyl-FH4 a B12 kofaktor ‹#› 36 Kyselina listová je vitamin. V těle je hydrogenována na 5,6,7,8-tetrahydrofolát (FH4) amid 5 6 7 8 Tetrahydrofolát (FH4) je kofaktor pro transfer C1 skupin ‹#› 37 b12 B12 vitamin je kyano nebo hydroxokobalamin R = CN nebo OH korinový cyklus hydroxokobalamin - terapie otravy kyanidy váže kyanidové anionty na netoxický kyanokobalamin ‹#› 38 B12 kofaktor je methyl nebo deoxyadenosylkobalamin, je nutný pro dvě reakce v těle •homocystein ® methionin • •homocystein ®® propionyl-CoA ®® sukcinyl-CoA • • • B12 B12 ‹#› 39 Thiamindifosfát (TDP) je kofaktorem oxidační dekarboxylace pyruvátu glukosa ® pyruvát ® acetyl-CoA CC TDP vazba pyruvátu a jeho dekarboxylace ‹#› 40 Metaloenzymy •obsahují funkční kovové ionty, které se přímo účastní katalyzované reakce, ionty kovu vázány poměrně pevně (Enz-M) •některé enzymy potřebují ionty kovů pouze k aktivaci, v tom případě jsou vázány slabě (Enz …M), ionty dvojmocných kovů, Ca2+ (koagulační faktory), Mg2+ (kinasy) ‹#› 41 Molybden •Součást některých oxidoreduktas •Součást kofaktoru – molybdopterin •Xanthinoxidasa (xanthin ® kys. močová) •Sulfitoxidasa (HSO3- ® SO42-) • Zdroje Mo: luštěniny, celozrnné obilniny ‹#› 42 Zinek •Mnoho enzymů •Alkoholdehydrogenasa (ethanol + NAD+ ® acetaldehyd + NADH+H+) •Karbonátdehydratasa (H2O + CO2 D H2CO3) •Karboxypeptidasy (štěpení polypeptidů od C-konce) •Cu, Zn-superoxiddismutasa (cytosolová izoforma) (2 •O2- + 2 H+ ® O2 + H2O2) • Zdroje Zn: červené maso, korýši, luštěniny, slunečnicová a dýňová semínka, celozrnné obilniny ‹#› 43 Měď •Četné oxidoreduktasy •Ceruloplazmin (ferrooxidasa) (Fe2+ ® Fe3+) •Cytochrom-c-oxidasa (DŘ, přenos el. na O2) •Monoaminooxidasy (MAO, inaktivace biogenních aminů) •Dopaminhydroxylasa (dopamin ® noradrenalin) •Lysyloxidasa (vyzrávání kolagenu, Lys ® alLys) Zdroje Cu: játra, maso, kakao, luštěniny, ořechy ‹#› 44 Mangan •Četné hydrolasy, dekarboxylasy, transferasy •Mn-superoxiddismutasa (mitochondriální izoforma) •Arginasa (Arg ® močovina + ornithin) •Syntéza proteoglykanů + glykoproteinů • Zdroje Mn: luštěniny, celozrnné obilniny, ořechy ‹#› 45 Železo •Hemové enzymy, nehemové přenašeče •Katalasa (hem, H2O2 ® H2O + ½O2) •Myeloperoxidasa (hem, neutrofily) H2O2 + Cl- + H+ ® HClO + H2O •Cytochromy (hem, přenašeče elektronů v DŘ) •Fe-S proteiny (nehem, přenos elektronů v DŘ) Zdroje Fe: výrobky z vepřové, husí, kachní krve, (červené) maso, játra, žloutek, ořechy ‹#› 46 Faktory ovlivňující enzymové reakce ‹#› 47 Vazba substrátu na enzym •vazba substrátu do aktivního místa vyvolá odpovídající konformační změnu molekuly enzymu (indukované přizpůsobení) •vytvoří se komplex enzym-substrát (ES), který se rozpadne na produkt a enzym ‹#› 48 Faktory ovlivňující rychlost enzymové reakce Teplota S rostoucí teplotou rychlost reakce vzrůstá, optimální je kolem 40 °C, při vyšších teplotách rychlost klesá – denaturace enzymu pH Ovlivňuje stav ionizace skupin v aktivním místě enzymu a jeho okolí konstatní pH v tělesných tekutinách udržují pufrační systémy každý enzym má pH optimum, intracelulární enzymy kolem pH 7 trávicí enzymy mají odlišné: pepsin pH 2 Aktivátory Umožňují nebo urychlují enzymovou reakci Často ionty dvojmocných kovů: Ca2+, Mg2+, Zn2+, Mn2+ Inhibitory Zpomalují nebo zastavují enzymovou reakci Kompetitivní: podobné substrátu, soutěží o aktivní místo Jiné: např. ionty těžkých kovů, pevně se vážou na důležité skupiny Koncentrace substrátu Při vysoké koncentraci substrátu je enzym nasycen, reakce probíhá maximální rychlostí, graficky vyjadřuje saturační křivka ‹#› 49 Příklady denaturace bílkovin/enzymů Denaturační faktor Přerušené interakce Příklad Zahřívání nad 50 °C H-vazby, hydrofobní interakce vaření, pečení jídla, autoklávování chirurgických nástrojů Kyseliny H-vazby, solné můstky kyselina mléčná z Lactobacillus sp. sráží mléčnou bílkovinu na jogurt Organické sloučeniny H-vazby, hydrofobní interakce ethanol a isopropylalkohol dezinfikují kůži Ionty těžkých kovů (Pb2+, Hg2+) disulfidové vazby inhibice enzymů, otrava těžkými kovy Třepání, šlehání apod. H-vazby, hydrofobní interakce příprava sněhu z vaječného bílku ‹#› 50 Konstantní pH tělesných tekutin udržují pufry Pufrační systém Pufrační báze Pufrační kyselina Zastoupení v krvi pKA Poměr [báze] : [kys] Ideální Ideální Ideální 100 % 7,4 1 : 1 Hydrogen uhličitanový HCO3- H2CO3 + CO2 50 % 6,1 20 : 1 Proteinovýa Protein-His Protein-His-H+ 45 % 6,0–8,0b ? Hydrogen fosfátový HPO42- H2PO4- 5 % 6,8 4 : 1 a V krevní plazmě hlavně albumin, v erytrocytech hemoglobin. b Hodnoty pKA protonizovaného histidinu (His-H+) závisejí na typu bílkoviny a strukturním okolí histidinu. ‹#› 51 Inhibice enzymů •Ireverzibilní •inhibitor pevně vázán na enzym (akt. místo) •organofosfáty •ionty těžkých kovů •kyanidy • • • •Reverzibilní •inhibitor volně vázán •rovnováha E+I Û E-I •inhibitor lze odstranit (dialýza, gel. filtrace) •dva základní typy: kompetitivní, nekompetitivní ‹#› 52 Přirozený substrát vs. kompetitivní inhibitor malonát je inhibitorem sukcinátdehydrogenasy ‹#› 53 Otrava methanolem se léčí ethanolem Vznik toxických produktů je inhibován ethanolem, který vytěsní methanol z vazebného místa enzymu – kompetitivní inhibice dehydrogenace methanolu ‹#› 54 Mnohá léčiva jsou inhibitory enzymů •Acetylsalicylová kyselina (cyklooxygenasa) •Ibuprofen (cyklooxygenasa) •Statiny (HMG-CoA reduktasa) – hypolipidemika, snižují syntézu cholesterolu (lovastatin) •Inhibitory ACE (angiotensin konvertující enzym) – léčba hypertenze (enalapril) •Reverzibilní inhibitory acetylcholinesterasy (neostigmin) – nervosvalové choroby, pooperační atonie střev •Selektivní inhibitory mozkové acetylcholinesterasy (rivastigmin, galantamin) - Alzheimerova choroba • ‹#› 55 Antibiotika inhibují enzymy nutné pro určitý životní děj bakterií •Peniciliny – inhibují transpeptidasy (výstavba buněčné stěny) •Tetracykliny, makrolidy, chloramfenikol – inhibice proteosyntézy •Fluorované chinolony (ciprofloxacin) – inhibice bakteriální gyrasy (topoisomerasy II) (rozplétání DNA během replikace) ‹#› 56 Závislost na koncentraci substrátu •rovnice Michaelise a Mentenové •vo je počáteční rychlost (nejvyšší hodnota) • Vmax = maximální rychlost (pro danou koncentraci enzymu) Km = Michaelisova konstanta ‹#› 57 Grafickým vyjádřením předchozí rovnice je saturační křivka ‹#› 58 Jak zjistit množství enzymu v biologickém materiálu? ‹#› 59 Množství enzymu v biologickém materiálu lze stanovit dvojím způsobem •katalytická koncentrace •μkat/l •stanoví se produkt enzymové reakce •většina klinicky významných enzymů •hmotnostní koncentrace •μg/l •stanoví se enzym (jako antigen, imunochemicky) •jen některé, např. tumorové markery ‹#› 60 Katalytická aktivita enzymu •zavedena jednotka katal, 1 kat = mol/s •jeden katal je katalytická aktivita enzymu, při které se v reakci přemění jeden mol substrátu za sekundu • • mezinárodní jednotka IU (international unit) 1 IU = μmol/min Převodní vztahy: 1 μkat = 60 IU 1 IU = 16,6 nkat ‹#› 61 Katalytická koncentrace enzymu •aktivita je vztažena na objem biologické tekutiny (krevní sérum) •jednotky mkat/l, mkat/l • ‹#› 62 Koncentrace substrátu během reakce klesá Þ kinetická křivka z kinetické křivky se zjišťuje rychlost ‹#› 63 Příklad: Metodika stanovení ALT (všechny složky jsou bezbarvé) optický test ‹#› 64 Stanovení katalytické koncentrace v laboratoři •optimální podmínky (teplota, pH, kofaktory) •měří se D[S] nebo D[P] v určitém časovém intervalu •kinetika 0. řádu, [S] >> Km Þ nasycený enzym, rychlost je konstantní, blíží se Vmax ‹#› 65 Dvě metody pro zjištění katalytické koncentrace Charakteristika Kinetická metoda Metoda konstantního času Co se měří [S] nebo [P] [P] Jak kontinuálně (např. po 10 s) po urč. čase (např. 10 min) je reakce inhibována Kinetická křivka hodnocena ano ne Co se stanoví počáteční rychlost vo průměrná rychlost Zhodnocení metody přesná méně přesná ‹#› 66 Uvědomte si, že katal. koncentrace enzymu = rychlost chemické reakce [kat/l] = [mol/l.s] ‹#› 67 Dělení enzymů podle místa vzniku •Buněčné (intracelulární) enzymy •mají svou funkci uvnitř buňky, v místě vzniku •při poškození buňky se uvolní a dostanou se do krve, kde lze zjistit jejich zvýšenou aktivitu •příklady: ALT, AST, CK, GMT, LD ... •Sekreční enzymy •působí jinde •enzymy velkých žláz (pankreas) – lipasa, amylasa ... •jaterní enzymy na export: koagulační faktory ‹#› 68 Intracelulární lokalizace enzymů Organela Enzym Cytoplazma Mitochondrie Golgi komplex, ER Lyzosom Membrána LD, ALT, cAST (30 %) mAST (70 %) CHS, AMS ACP GMT, ALP Různé typy poškození buňky vedou k tomu, že se do krve uvolňují jen enzymy z učité subcelulární struktury. lehké poškození jater: AST/ALT < 1 těžší poškození jater: AST/ALT > 1 ‹#› 69 Izoenzymy (izoformy) a makroenzymy •katalyzují stejnou reakci •ale liší se primární strukturou a/nebo posttranslačními úpravami (glykosylace), tedy fyz.-chem. a kinetickými vlastnostmi •mají často různou subcelulární / tkáňovou distribuci •stanovují se elektroforézou, afinitní chromatografií, imunochem. metodami •makroenzymy – komplexy enzymů a imunoglobulinů, mají dlouhý poločas • ‹#› 70 Kreatinkinasa (CK) je dimer a tvoří tři izoenzymy Izoenzym Výskyt Procento celk. aktivity Zvýšení CK-MM CK-MB CK-BB svaly srdce mozek 94-96 % do 6 % stopy svalové trauma infarkt poranění mozku ‹#› 71 Trojí využití enzymů v lékařství 1.enzymy jako indikátory patologického stavu 2.enzymy jako analytická činidla v klin. biochemii 3.enzymy jako léčiva ‹#› 72 Příklady enzymů v klinické diagnostice Enzym Referenční hodnoty Interpretace zvýšení ALT CK PSA do 0,9 mkat/l do 4 mkat/l do 4 μg/l hepatopatie myopatie, infarkt myokardu karcinom prostaty ALT alaninaminotransferasa, CK kreatinkinasa, PSA prostatický specifický antigen Při poškození buněk se zvyšuje aktivita intracelulárních enzymů v extracelulární tekutině ‹#› 73 Enzymy jako analytická činidla Enzym Původ enzymu Stanovení Glukosaoxidasa Peroxidasa Lipasa Cholesteroloxidasa Urikasa Bilirubinoxidasa Ureasa Laktátdehydrogenasa Taq polymerasa Aspergillus niger křen (Armoracia sp.) Candida sp. Pseudomonas sp. Candida sp. Myrothecium sp. bob (Canavalia sp.) Pediocus sp. Thermus aquaticus glukosa glukosa triacylglyceroly cholesterol kyselina močová bilirubin močovina ALT, AST PCR metoda ‹#› 74 Enzymové stanovení glukosy glukosa + O2 ¾¾® glukonolakton + H2O2 H2O2 + H2A ¾¾® 2 H2O + A glukosaoxidasa peroxidasa bezbarvý chromogen barevný produkt (měří se absorbance) Princip stanovení glukosy v analyzátorech ‹#› 75 Osobní glukometry •určené pro osobní kontrolu u diabetiků •glukosaoxidasa je zakotvena na pevné fázi •vznikající H2O2 se stanovuje jiným způsobem (pomocí Pt-elektrody) •na displeji se ukáže koncentrace glukosy (mmol/l) • ‹#› 76 Glucometer ‹#› 77 Pankreatické enzymy v terapii •směs enzymů (lipasy, amylasy, proteinasy) získaná z vepřových pankreatů •indikace: sekreční nedostatečnost pankreatu různé etiologie, cystická fibróza •užívání: 3 × denně při jídle •řada přípravků volně prodejných acidorezistentní tobolky, rozpadají se až v duodenu ‹#› 78 Asparaginasa v terapii leukémie •Katalyzuje hydrolýzu amidové skupiny asparaginu •Asn + H2O ® Asp + NH3 •L-asparagin je nezbytný pro proteosyntézu některých nádorových buněk, Hydrolýza Asp vede k omezení proliferace •Indikace: akutní lymfoblastické leukemie • Enzymová fibrinolytika •léčiva, která rozpouštějí krevní sraženiny v cévách •urokinasa (lidská) •štěpí plazminogen na plazmin – ten vyvolá degradaci fibrinu a trombolýzu •indikace: žilní trombóza, plicní embolie, akutní IM ‹#› 79 Proteasy v terapii •Lokální působení: •fibrinolyzin, chymotrypsin, kolagenasa •po lokální aplikaci vedou k lýze nekrotické tkáně, nepoškozují zdravé buňky (obsahují inhibitory proteas) •hnisavé rány, bércové vředy, diabetické gangrény, dekubity apod. •Celkové působení: •trypsin, chymotrypsin, rostlinné proteasy - papain (papaya), bromelain (ananas) •některé studie naznačují protizánětlivý účinek, ovlivnění imunity u autoimunitních onemocnění •indikace: pomocná léčiva při revmatoidní artritidě, traumatické záněty a otoky, lymfedémy, apod., volně prodejné přípravky (Wobenzym, Phlogenzym aj.) ananas papaja