1 Kompartmentace metabolických dějů v buňce Biochemický ústav LF MU E.T. 2013 2 Buňky prokaryontů a eukaryontů Charakteristika prokaryont eukaryont Velikost buňky (nm) 1-10 >10 Jádro (karyon) není je DNA obnažená,kruhová v chromosomech, asociována s proteiny Organely nejsou jsou Cytoskelet není je Komunikace s prostředím získávají živiny z prostředí, které je obklopuje nachází se v konstantním prostředí Specializace nízká diferenciace Dělení přehrádečné (binární) mitosa 3 Živočišná eukaryontní buňka a její kompartmenty 4 Buněčné kompartmenty •Organely v buňce jsou obklopeny membránami, které oddělují vnitřní prostředí organely od cytosolu •V membránách se nachází transportní bílkoviny a receptory, které regulují obsah přicházejících a odcházejících látek a udržují tak stálé složení vnitřního prostředí organely •Každá organela tak má charakteristické vnitřní prostředí a je vybavena pro určité metabolické pochody •V různých typech buněk může být zastoupení látek v organelách různé • 5 Složení: Fosfolipidy (fosfatidylcholin, fosfatidylethanolamin, fosfatidylserin, fosfatidylinositol,sfingomyelin) Glykolipidy Cholesterol Proteiny (periferní a integrální) Fluidně-mozaikový model: dvojvrstva fosfolipidů, v níž jsou zabudovány membránové proteiny. Polární „hlavy“ fosfolipidů jsou vystaveny na obou površích membrány, nepolární zbytky mastných kyselin jsou orientovány do vnitřní části membrány. Buněčné membrány 6 Buněčné membrány •Membrány - brání volnému průchodu látek z prostředí do buňky a naopak, nebo mezi jednotlivými kompartmenty. •Selektivní permabilita: některé látky nesmějí procházet vůbec, jiné jsou propouštěny snadno a jiné jsou transportovány i proti koncentračnímu spádu Další funkce membrán: Ømetabolické (podmíněné obsahem enzymů), Øregulační (vážou regulující látky prostřednictvím receptorů) Ø imunologické (rozpoznávání cizorodých struktur). 7 Složení membrán •Zastoupení složek je různé v různých typech membrán: • • Typ membrány Lipidy Proteiny Sacharidy Cytoplazmatická savčí 43 49 8 Cytoplazmatická bakteriální 30 70 - Myelinová 75 22 - Vnější mitochondriální 48 52 stopy Vnitřní mitochondriální 24 76 stopy Endoplazmatické retikulum 44 54 2 8 Glycerofosfolipid Sfingofosfolipid Polární hlava dva nepolární řetezce Fosfolipidy mají charakter tenzidu tvoří dvojvrstvu v buněčných membránách 9 C H 2 C H O C O C H 2 O C O O P O O O X cholin ethanolamin serin inositol glycerol fosfatidylglycerol diester kyseliny fosforečné při fyziologickém pH disociovaná Struktura glycerofosfolipidu Mastná kyselina Mastná kyselina 10 Proteiny v membránách Membrána Integrální a periferní membránové proteiny Proteiny v membránách: enzymy, transportéry, receptory, kanály. Často glykoproteiny. 11 Transport přes buněčné membrány Mechanismy transportů jsou závislé na povaze látek, které mají být přes membrány přenášeny. transportní mechanismy: specifické a nespecifické podle potřeby energie: pasivní a aktivní Membránový transport I. Nespecifický transport (prostá difuze) II. Přenašečový transport (pasivní, aktivní) III. Endocytóza Exocytóza 12 •Lipidová dvojvrstva - volně prostupná pouze pro vodu a malé nenabité molekuly jako O2, CO2, NO, CO, N2. •Přes membránu snadno prochází také menší hydrofobní molekuly, které nereagují s vodou, např. steroidní hormony. •V některých membránách, např. ve vnější mitochondriální membráně, jsou obsaženy póry tvořené bílkovinami a těmi mohou procházet malé polární molekuly. Pro většinu membrán je však pasivní difuze limitována jen na malé hydrofobní molekuly. Prostá difuze 13 •Integrální proteiny v membránách mohou vytvářet kanály a póry usnadňují translokaci molekul nebo iontů přes membránu. •Látky se pohybují kanálkem ve směru koncentračního spádu. •Kanálové proteiny nevážou ani nevyčleňují molekuly nebo ionty, které jsou přenášeny. •Jejich specifita je omezena na velikost a náboj látek. Průtok kanálem může být inhibován a může být regulován řadou mechanismů. Iontové kanály 14 V excitabilních buňkách, jako jsou nervové a svalové buňky, jsou kanály pro ionty, které se otvírají na základě změny membránového potenciálu Kanály otvírané změnou napětí 15 Kanál se otevírá po navázání malé signální molekuly (ligandu). Některé kanály jsou otevírány extracelulárními ligandy, jiné intracelulárními ligandy. Ligand není kanálem transportován. Př.: acetylcholinový receptor nikotinového typu. Po navázání acetylcholinu se otevírá kanál pro sodné ionty. Ligandem otvírané kanály 16 Aquaporiny Průřez akvaporinového kanálu •Membránové kanály pro vodu •jsou rozhodující pro obsah vody v buňkách. •malé hydrofobní integrální membránové proteiny. •nepropustné pro nabité molekuly, včetně protonů. •Specifičnost kanálů k vodě je dále ovlivněna kladně nabitými zbytky argininových molekul v místě zúžení, které vytváří bariéru pro průchod kationtů 17 •Umožňují přenos molekul nebo iontů přes membránu navázáním a fyzikálním transportem přes membránu. •Rychlost transportu je vyšší než při prosté difuzi. •transport vykazuje saturační kinetiku. Pro transportér může být stanovena Vmax i Km. •Většina transportérů má vysoký stupeň strukturní specifity k substrátu. Proces transportu je charakterizován čtyřmi fázemi: Ørozpoznání solutu transportérem Øtranslokace solutu přes membránu Øuvolnění solutu transportérem Ønávrat transportéru do původního stavu Ø Membránové transportní proteiny 18 Pasivní transport (usnadněná difuze) Transport glukosy do buňky pomocí transportéru GLUT 19 •Transportovaná látka přenášena proti koncentračnímu gradientu •Je potřebný zdroj energie. • •U živočišných buněk je to nejčastěji ATP. Transportéry jsou pak také nazývány ATPasy (ATP je během translokace hydrolyzováno). • •Transportní protein je dočasně fosforylován, tím dochází ke změně jeho konfirmace, která umožní translokaci látek. • •Při nepřímém (sekundárním) aktivním transportu je vytvořen koncentrační gradient iontu aktivním transportem a jiný transportér využívá energii tohoto gradientu k přenosu další látky. Aktivní transport 20 Ca2+-ATPasa sarkoplazmatického retikula V kosterním svalu je Ca2+-ATPasa sarkoplazmatického retikula (SERCA) zapojena do cyklu kontrakce a relaxace a tvoří 1/3 povrchu membrány. Je tvořena jediným proteinem, který obsahuje 10 transmembránových helixů. Po navázání vápníku se na transportér váže ATP, bílkovina je fosforylována a mění konformaci. Vazebné místo má malou afinitu k Ca2+ a je otevřeno opačným směrem (do lumen ER nebo extracelulárně). 21 Typ ATPasy Příklad Lokalizace Funkce F (faktor spřažení) H+-ATPasa mitochondriální membrána syntéza ATP V (vakuolární) H+-ATPasa lyzosomální membrána transport H+, acidifikace prostředí P (aktivované fosforylací) Ca2+-ATPasa plazmatická membrána transport Ca2+ Na+/K+-ATPasa plazmatická membrána tvorba elektrochemického gradientu Na+ a K+ H+/K+-ATPasa plazmatická membrána acidifikace lumen žaludku ABC (ATP-binding cassette) P-glykoprotein plazmatická membrána export hydrofóbních xenobiotik/léků z buňky ven ABCA1 plazmatická membrána transport cholesterolu z buněk do HDL CFTR plazmatická membrána transport Cl− TAP endoplazmatické retikulum transport antigenu z cytoplazmy do ER Příklady ATPas 22 Endocytóza fagocytóza pinocytóza receptorem zprostředkovaná endocyóza Korpuskulární částice Kapalina Molekula nebo částice receptor klathrin endosom vezikl fagosom Probíhá jen ve specializovaných buňkách (makrofágy, dendritické buňky a neutrofily) všechny buňky 23 Jádro •Největší subcelulární organela •Obsahuje jadérko •Jaderný obal se skládá ze dvou membrán, v nichž jsou jaderné póry •Pomocí pórů se do jádra dostávají proteiny syntetizované v cytoplazmě a opačným směrem RNA a ribosomy •Vnější membrána navazuje na ER •Jádro obsahuje hlavně chromatin (DNA + bílkoviny histony) •Jádro: replikace DNA, transkripce a posttranskripční úpravy mRNA a tRNA •Jadérko: syntéza rRNA a ribosomů 24 Mitochondrie – energetické centrum buňky kristy Vnější membrána Vnitřní membrána Původ mitochondrií v buňce Pochází z bakterií, které byly dávno pohlceny eukaryontní buňkou. V buňce přežily a vytvořily s ní symbiotický vztah. Mají vlastní DNA 25 Procesy v mitochondriích •Zajišťují převážnou část produkce energie, využívají kyslík, redukují jej na vodu •Vnější membrána – dobře propustná pro většinu molekul, obsahuje bílkovinu porin, která tvoří propustné póry •Vnitřní membrána – velmi nepropustná, obsahuje řadu bílkovinných transportérů a enzymy a kofaktory dýchacího řetězce, ATP-asa syntetizující ATP •Matrix – citrátový cyklus, b-oxidace, replikace DNA, proteosyntéza (13 proteinů dýchacího řetězce a oxidační fosforylace), v játrech část močovinového cyklu, některé transaminace, oxidační dekarboxylace pyruvátu ad. •Mitochondrie se mohou dělit •Mitochondriální DNA – cirkulární, méně než 1% buněčné DNA, celkem 37 genů, pouze 13 kóduje bílkoviny 26 Vnitřní mitochondriální membrána • kristy • semipermeabilní • není propustná pro ionty • není propustná pro protony ! • obsahuje enzymové komplexy dýchacího řetězce, kofaktory • obsahuje transportní proteiny 27 vnitřní mitochondriální membrána NADH+H+ NAD+ FADH2 FAD Þ 2e- ½O2+2H+ H2O n H+ n H+ n H+ Živiny CO2 Redukované kofaktory ATP matrix ……e-………. Katabolické děje P r o t o n o v ý g r a d i e n t ADP+Pi 28 Syntéza ATP aerobní fosforylací Protonový gradient H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ ATP ADP + Pi ATP-synthasa F0 F1 F1 Protonmotivní síla Vnitřní mitochondriální membrána matrix 29 Mitochondriální disfunkce •Způsobeny mutacemi mtDNA •Obvykle nejvíce postiženy svaly a nervová tkáň •Např.MELAS (myopatie, encefalopatie, laktátová acidosa, stroke-like episodes) – způsobena bodovými mutacemi pro t-RNALEU – jsou poškozeny všechny komplexy respiračního řetězce s výjimkou komplexu II, který je kompletně kódován v jádře http://jcb.rupress.org/content/193/5/809/F1.large.jpg Published May 30, 2011 // JCB vol. 193 no. 5 809-818 The Rockefeller University Press, doi: 10.1083/jcb.201010024 30 Lyzosomy •Intracelulární organely zodpovědné za buněčné trávení. •Mají jednoduchou membránu, která zabraňuje tomu, aby lyzosomální enzymy unikaly do cytoplazmy. •Role lyzosomů: rozklad látek přijatých endocytosou,pinocytosou, fagocytosou nebo autofagií. •Obsahují hydrolytické enzymy (nukleasy, fosfatasy, glykosidasy, esterasy, proteasy) •Štěpí složité molekuly na jednoduché produkty, které se vrací do cytoplazmy •pH v lyzosomech je kolem 5,5 •Lyzosomální choroby – deficit některého enzymu, dochází k akumulaci nerozložených substrátů v lyzosomech (např.Gaucherova choroba – ukládání glukocerebrosidů v mozku, játrech, kostní dření a slezině) 31 Peroxisomy •Velikostí se podobají lyzosomům, mají jednoduchou membránu •Využívají molekulární kyslík k oxidačním reakcím •Odbourávají delší mastné kyseliny (>20 C) na kratší, metabolizují cholesterol na žlučové kyseliny, syntetizují plazmalogeny •Při jejich metabolismu vzniká H2O2, který je štěpen pomocí enzymů katalasy a peroxidasy •Mohou se dělit Peroxizomální disfunkce nejméně 16 klinicky a biochemicky odlišných heterogenních poruch (poruchy peroxizomální biogeneze nebo syntézy jednotlivých proteinů spojených s peroxisomální dysfunkcí Těžké symptomy již v dětství 32 Ribosomy http://www.pdb.org/pdb/static.do?p=education_discussion/molecule_of_the_month/pdb10_1.html Komplexy proteinů a rRNA nejsou - ohraničené membránou •až 80 % celkové RNA v buňce • typy ribosomů u eukaryontů a prokaryontů jsou rozdílné •Větší a menší podjednotka (u eukaryontů 60S a 40S) Probíhá zde syntéza proteinů Jsou buď volně v cytoplazmě nebo vázané na ER 33 Endoplazmatické retikulum •Síť membránových tubulů •Hladké a hrubé ER •Hladké ER: syntéza triacylglycerolů, desaturace a elongace mastných kyselin, metabolismus cizorodých látek pomocí P450, metabolismus steroidních hormonů •Hrubé ER – spojené s ribosomy •Probíhá zde posttranslační úprava bílkovin a jejich transport do dalších částí buňky 34 Golgiho komplex •Membránové váčky navazující na ER •Cis-Golgi – přivrácené k jádru •Trans-Golgi – přivrácené směrem k plazmatické membráně •Modifikace proteinů transportovaných z hrubého ER a sorting 35 Transport proteinů syntetizovaných na RER Lyzosomy Sekreční váčky Cis Golgi Trans Golgi http://vcell.ndsu.nodak.edu/animations/proteintrafficking/first.htm Hrubé ER Golgi 36 Cytoskelet Vlákno Hlavní protein Hlavní funkce Aktinová filamenta (mikrofilamenta) aktin Udržování tvaru buňky, pohyb chromozomů a dalších subcelulárních komponent, migrace buněk... Mikrotubuly tubulin Buněčné dělení, endocytosa, exocytosa, udržování tvaru buňky, umístění organel, transport vesiklů … Intermediární filamenta Desmin (svalové buňky) Vismetin (fibroblasty) Keratin (epitelové buňky) Neurofilamenta (neurony) Tvoří podpůrnou strukturu v buňce. 37 Cytosol •Největší oddíl v buňce •Charakter vodného gelu s mnoha rozpuštěnými látkami •Řada enzymů a dalších proteinů •V cytosolu probíhá řada chemických pochodů – první kroky metabolismu molekul vstupujících do buńky, metabolismus glukosy, syntéza proteinů ad. 38 Enzymové markery subcelulárních frakcí Frakce Enzym Plasmatická membrána Na+/K+-ATPasa Jádro DNA-polymerasa RNA-polymerasa Endoplasmatické retikulum Glukosa-6-fosfatasa Cytochrom-b5-reduktasa Golgiho aparát Galaktosyltransferasa Lyzosomy Kyselá fosfatasa β-Glukuronidasa Mitochondrie Sukcinátdehydrogenasa Cytochrom-c-oxidasa Peroxisomy Katalasa Cytosol Laktátdehydrogenasa Glukosa-6-fosfátdehydrogenasa [USEMAP] 39 Frakcionace buněk •Homogenizované bunky jsou centrifugovány pri různých otáčkách a délce centrifugace •Homogenát obsahuje směs organel, úlomků membrán, molekul Pomalá centrifugace způsobí, že sedimentují pouze velké složky v homogenátu Supernatant je dekantován a opět zcentrifugován při vyšších otáčkách •Čistota frakcí je testována pomocí „markerů“ •Nověji též pomocí průtokové cytometrie, imunoizolace ad. • http://images.freewebs.com/Members/Generationz/NewStyles/OrangeGear/trans.gif http://images.freewebs.com/Members/Generationz/NewStyles/OrangeGear/trans.gif http://images.freewebs.com/Members/Generationz/NewStyles/OrangeGear/trans.gif http://www.freewebs.com/ltaing/chpt7.3Cellfractionation.gif 40 Hlavní buněčné kompartmenty a jejich funkce Kompartment Metabolický proces Lyzosom Intracelulární trávení Mitochondrie Dýchací řetězec, citrátový cyklus, b-oxidace, syntéza ketolátek (játra), částečná syntéza DNA, částečná transkripce a replikace Peroxisomy Odbourání delších mastných kyselin na kratší, přeměna cholesterolu na žlučové kyseliny, syntéza plazmalogenů, metabolismus peroxidu vodíku Jádro Největší organela. Syntéza DNA a RNA. Jadérko Syntéza a úprava rRNA, Endoplazmatické retikulum Hladké: syntéza triacylglycerolů, fosfolipidů, metabolismus cizorodých látek, steroidních hormonů Hrubé: posttranslační modifikace proteinů Golgiho aparát Modifikace proteinů (sulfatace, fosforylace, glykosylace)