Novorozenecký screening MUDr.Hana Vinohradská OKB FN Brno Definice NS • Aktivní celoplošné vyhledávání choroby v populaci všech novorozenců v jejím preklinickém stadiu • Vyhledávání pomocí laboratorní metody – princip analýzy tzv. suché kapky krve na filtračním papírku odebrané standardním způsobem Kriteria pro NS • vyšetřovaná choroba je jasně definována • představuje významný zdravotně sociální problém (incidence 1: 50 – 100 000) • existuje obecně uznaný screeningový test s jasně definovanými parametry ( cut off, recall…) • včasná diagnóza umožňuje takovou léčbu, která zásadně pozitivně ovlivní průběh nemoci • společnost je schopna zabezpečit NS a následnou péči o zachycené pacienty po stránce organizační a ekonomické Historie NS • Robert Guthrie (1916 – 1995) – americký mikrobiolog, zakladatel NS, který v souvislosti s hledáním vhodného testu pro screeningové vyšetřování novorozenců na fenylketonurii poprvé použil papírek nasáknutý krví ( r.1960). • kolem r.1963 – rychlé rozšiřování screeningu PKU v USA, později i jinde . NS Evropa-2010 34 44 44 45 50 53 35 51 50 32 41 47 46 37 29 29 41 48 40 DC 51 13 31 45 35 33 36 29 50 41 48 31 45 33 45 48 52 31 31 35 54 49 32 50 49 24 31 31 46 49 51 52 32 5252 31 30 NS USA-2009 Historie NS v ČR • Fenylketonurie/hyperfenylalanin. – od r.1975 • Kongenitální hypotyreóza – od r. 1985 • Kongenitální adrenální hyperplázie – od r.2006 • Cystická fibróza – od podzimu 2009 • DPM dalších aminokyselin - od podzimu 2009 • DPM mastných kyselin - od podzimu 2009 • Některé organické acidurie – od podzimu 2009 Organizace NS v ČR • Věstník MZ ČR, částka 6, vydán 12.8.2009 • Metodický návod k zajištění novorozeneckého celoplošného laboratorního screeningu a následné péče Rozdělení NS dle metodiky vyšetřování • Fluoroimunoanalytická metoda DELFIA - kongenitální hypotyreóza - kongenitální adrenální hyperplázie - cystická fibróza • Tandemová hmotnostní spektrometrie MS/MS - fenylketonurie a další poruchy metabolismu AMK - DPM mastných kyselin - některé organické acidurie Laboratoře NS v ČR • Pro imunoanalytické metody: 1) FN KV Praha, laboratoř NS 2) FN Brno, OKB PDM, laboratoř NS • Pro metody MS/MS: 1) VFN Praha, ÚDPM 2) FN Olomouc, laboratoř DPM Odběr krve pro novorozenecký screening Odběrová kartička pro novorozenecký screening Odběr krve • Odběr kapilární krve provést mezi 48-72 hod. po narození • Vybrat vhodnou kartičku - t.č.používán typ Whatman 903 • Kartičku před odběrem řádně popsat potřebnými identifikačními údaji • Desinfikovat alkoholem, nechat zaschnout • Pro odběr použít kopíčko-lancetu (ne jehlu) • První kapku krve setřít (pro odběr nepoužít) • Odebrat dostatečné množství krve, vyznačené kruhové zóny nechat nasáknout z jedné strany, volně prosáknout na druhou stranu Manipulace s kartičkou • Krev po odběru nechat dobře zaschnout volně při pokojové teplotě, nevystavovat vysokým teplotám (slunce, topení, nesušit fénem) • Zabránit kontaminaci odběrových zón ( krev z jiné kartičky, prach, polití…) • Odeslat do příslušné laboratoře – dle typu požadovaného vyšetření SKS - výhody • Snadná dostupnost BM – jednoduchý odběr kapikární krve • Snadná transportovatelnost (možnost zasílání poštou i na značné vzdálenosti bez ohrožení preanalytiky) • Snadná manipulace s materiálem v laboratoři • Dlouhodobá skladovatelnost ( stabilita jednotlivých analytů však musí být vždy ověřena) Důležité: dodržení požadavků v preanalytické fázi ( odběr, transport) a podmínek pro skladování! Získávání krevních terčíků Krevní terčíky získáváme pomocí jednoduchých nástrojů až po složitá zařízení • Kleště • Jednoduché razičky • Automatické razičky Velikost terčíků: obvykle o průměru 1-6 mm Odběrová kartička s terčíkem Stanovované analyty v rámci NS • Substráty, metabolity (aminokyseliny, acylkarnitiny, TSH, T4, 17 OHP…) • Enzymy (galaktóza-1-fosfát, glukóza-6fosfátdehydrogenáza, biotinidáza, imunoreaktivní trypsin…) • Protilátky ( IgM, IgG proti Toxoplazmóze) • DNA, RNA • ??? Mikrotitrační destička Princip stanovení imunochemických metod • Analyt se měří ze suché krevní skvrny tzv.metodou DELFIA =Dissociation Enhancement Lanthanide Fluoroimmunoassay (systém finského výrobce firmy Wallac) • Princip stanovení je založen na imunochemické reakci mezi protilátkou a antigenem. Analyt ze SKS vystupuje v reakci jako antigen. • Reakce probíhá na mikrotitračních destičkách o 8x12 ti jamkách • Na stěnách jamek je navázána příslušná protilátka • Do jamky je vyražen terčík filtračního papírku nasáklý krví novorozence, která obsahuje stanovovaný analyt Princip stanovení imunochemických metod • Dále je do jamek přidána další značená protilátka či antigen značený chelátem lanthanoidového kovu Europia. • Následuje inkubace přes noc, během které dojde k reakci za vzniku komplexu. • Po proběhlé reakci a promytí se přidá zesilovací činidlo, tzv. enhancement, které uvolní značkující látku tj. ion Europia. Ta vytvoří se složkami zesilujícího roztoku silně fluoreskující chelát. • Fluorescenece se měří přímo na mikrotitrační destičce Princip DELFIA - graficky Autodelfia – automaticlý imunoanalyzátor Tandemová hmotnostní spektrometrie • Moderní analytická metoda • Možnost stanovení více analytů v rámci jednoho vyšetření • Široké spektrum metabolitů ( AMK, acylkarnitiny, enzymy…) • Vysoká specifita,citlivost a rychlost Tandemový hmotnostní spektrometr (MS/MS) suchá krevní kapka 200 µl methanolu se standardy odstranění terčíku25 min extrakce vyražení 3 mm terčíku odpaření methanolu butylace 30 min při 60 °C odpaření derivatizačního činidla analýza 1 vzorku 2,5 min 100µl derivatizačního činidla Postup MS/MS metody 200 µl 1:1 acetonitril a voda + 0,02 % kys. mravenčí • 6 Kongenitální hypotyreóza Příčiny: • ageneze či dysgeneze štítné žlázy • defekty hormonogeneze v důsledku snížené aktivity některých enzymatických systémů ve štítné žláze (peroxidázy, dejodázy…) • blokáda štítné žlázy autoimunitními procesy • transitorní hypotyreóza Důsledek: při nedostatku T3,T4→zpětnovazebně zvýšení TSH Terapie: p.o.hormony štítné žlázy Kongenitální adrenální hyperplázie Charakteristika: potenciálně fatální dědičné endokrinní onemocnění způsobené defektem steroidogeneze. Příčina: deficit některého enzymu steroidogeneze, nejčastěji P450c21 (dříve 21-hydroxylázy) Důsledek: nedostatek glukokortikoidů, případně mineralokortikoidů, nadbytek androgenů → krátce po narození dojde k metabolickému rozvratu, u děvčátek po narození různý stupeň virilizace genitálu Terapie: • Akutně - hydrokortison i.v., mineralokortikoidy, glukóza, úprava vnitřního prostředí. • Kortikoidy celoživotně. • Chirurgická úprava genitálu u dívek s malformacemi. Novorozenec ženského pohlaví s CAH Cystická fibróza (CF) • Charakteristika: autosomálně recesívně dědičné onemocnění, závažná choroba, chronicky progredující,Incidence: 1 : 3000 v indoevropské populaci • Příčina: mutace v CFTR genu, CFTR gen (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) objeven v r.1989 Přenašečem jedné z mutací CFTR genu je 1 z 25 Evropanů a 1 z 90 Asiatů Nejčastější mutace: F508del, dnes známo asi 1800 CFTR gen (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) objeven v r.1989 Primárně postižené orgány Dýchací cesty Hustý hlen vede k obstrukci; infekce a sekundární zánětlivý proces k progresivní destrukci plic Reprodukční trakt Absence vas deferens, 95% mužů s cystickou fibrózou je infertilních. U žen vzácněji abnormální vazkost cervikál. hlenu Pankreas Pankreatická insuficience, proteinoenergetická malabsorbce Kůže Malfunkce potních žláz způsobuje zvýšený obsah soli v potu. Játra, střevo Jaterní léze, fokální biliarní cirhóza Mekoniový ileus u novorozenců Cystická fibróza (CF)- pokračování • Diagnostika dříve: - Klinika - Koncentrace chloridů v potu (potní test) - Genetické vyšetření - Pomocná vyšetření Zobrazovací ( RTG plic, břicha, snonografie, CT…) Biochemická vyšetření: zbytky tuků, elastáza, ABR, markery zánětu Mikrobiologické vyšetření sputa (Pseudomonas aeruginosa, Burgholderia cepacia, Stafylococcus aureus, Hemophilus influenzae) Funkční vyšetření plic • Diagnostika dnes: - NS – stanovení IRT fluoroimonometodou DELFIA Cystická fibróza (CF)- pokračování • Terapie: − Symtomatická (komplexní, intenzivní,tým odborníků + rodina) Respirační projevy: boj proti infekci, péče o dobrou průchodnost dýchacích cest- ATB,dech.cvičení, masáže, domácí kyslíková léčba, transplantace plic) Zažívací ústrojí: substituční terapie pankreatické insuficience, energetické výživové přípravky, vitamíny rozpustné v tucích − Kauzální (genová) užití virových a nevirových vektorů Poruchy metabolismu AMK • obecný patogenetický mechanismus: akumulace toxického substrátu – chronická toxicita: např. Phe – akutní toxicita: větvené oxokyseliny či isovalerát • cíle léčby: snížený přívod příslušné aminokyseliny v potravě + suplementace ostatních AMK preparátem Poruchy beta-oxidace • základní patogenetický mechanismus: • nedostatečná tvorba ketolátek při hladovění • akumulace toxických acylCoA • klinické projevy: • obecně-hypoglykémie při hladovění • u některých nemocí-myopathie (zvláště při delší námaze), kardiomyopathie • léčba: prevence hypoglykémie při katabolických stavech Děkuji za pozornost