‹#› 1 Reaktivní formy kyslíku Doc. RNDr. Jiří Dostál, CSc. Biochemický ústav LF MU ‹#› 2 Reaktivní formy kyslíku v organismu Radikály Neutrální, anionty, kationty Superoxid ·O2- Hydroxylový radikál ·OH Peroxylový radikál* ROO· Alkoxylový radikál RO· Hydroperoxylový radikál HOO· Oxid dusnatý NO· Peroxid vodíku HOOH Hydroperoxidy* ROOH Kyselina chlorná HClO Singletový kyslík 1O2 Peroxynitrit ONOO- Nitronium NO2+ * Deriváty fosfolipidů během lipoperoxidace: PUFA-OO·, PUFA-OOH ‹#› 3 Superoxidový anion-radikál ·O2- •vzniká jednoelektronovou redukcí dikyslíku •relativně málo reaktivní • O2 + e- ® ·O2- [toto není reakce, pouze jeden redoxní pár] ‹#› 4 Vznik superoxidu v organismu •tzv. respirační vzplanutí (NADPH oxidasa, fagocytující leukocyty) 2 O2 + NADPH ¾® 2 ·O2- + NADP+ + H+ •spontánní oxidace hemoproteinů hem-Fe2+ + O2 ¾® hem-Fe3+ + ·O2- [toto jsou reakce, tedy kombinace dvou redoxních párů] ‹#› 5 Vysoce reaktivní hydroxylový radikál •OH vzniká ze superoxidu ·O2- + H2O2 ¾® O2 + OH- + ·OH Reakci katalyzují redukované ionty kovů (Fe2+, Cu+) (tzv. Fentonova reakce) ‹#› 6 Jazyková poznámka Název Význam Hydroxid anion OH- Hydroxyl radikál ·OH nebo skupina -OH Hydroxy předpona v názvech organických sloučenin: 2-hydroxypropanová kyselina (mléčná) Hydroxo předpona ligandu OH- v komplexech: Na[Al(OH)4] tetrahydroxohlinitan sodný ‹#› 7 Singletový kyslík 1O2 •excitovaný stav tripletového dikyslíku •vzniká mj. po absorpci světla některými pigmenty (porfyriny) 3O2 ® 1O2 ‹#› 8 Peroxid vodíku H2O2 •poměrně nestálá sloučenina, snadno se rozkládá se na vodu a kyslík •vzniká v organismu při deaminaci AK - dvouelektronová redukce O2 •ve Fentonově reakci produkuje •OH •může oxidovat -SH skupiny enzymů ‹#› 9 Oxidační deaminace aminokyselin poskytne amoniak, oxokyselinu a peroxid vodíku H2O + ½ O2 ‹#› 10 Srovnejte: redukce dikyslíku Typ redukce Dílčí reakce (redoxní pár) Čtyřelektronová O2 + 4 e- + 4 H+ ® 2 H2O Jednoelektronová O2 + e- ® ·O2- Dvouelektronová O2 + 2 e- + 2 H+ ® H2O2 ‹#› 11 Kyselina chlorná HClO •vzniká v neutrofilních granulocytech z peroxidu vodíku a chloridového aniontu •reakci katalyzuje myeloperoxidasa •HClO má silné oxidační a baktericidní účinky H2O2 + Cl- + H+ ® HClO + H2O ‹#› 12 savo_original ‹#› 13 Oxid dusnatý NO· vzniká z argininu •exogenní zdroje: léčiva, vazodilatancia •NO· se váže na guanylátcyklasu Þ cGMP Þ relaxace hladké svaloviny (hlavně cév) •NO· je radikál a poskytuje další reaktivní metabolity: • NO· + ·O2- ® O=N-O-O- ® O=N-O-O-H (kys. peroxodusitá) H+ NO2+ + OH- ·NO2 + ·OH nitrace tyrosinu NO3- (plazma, moč) peroxonitrit nitrosylace ‹#› 14 Sloučeniny uvolňující NO Na2[Fe(CN)5NO] nitroprusid sodný (natrii nitroprussias) pentakyanonitrosylželezitan disodný rubínově červené krystaly extrémně účinný, i.v. infuze glycerol trinitrát (glyceroli trinitras) nažloutlá olejovitá kapalina klasické léčivo, působí rychle sublinguální tablety, sprej, náplast isosorbid dinitrát (isosorbidi dinitras) výhodnější farmakokinetické vlastnosti amyl-nitrit (amylis nitris) těkavá kapalina, inhalační aplikace isobutyl-nitrit těkavá kapalina, nová droga poppers, rush, liquid aroma … ‹#› 15 Pozitivní účinky kyslíkových radikálů •meziprodukty oxidasových a oxygenasových reakcí (cyt P-450), během reakcí jsou radikály vázané na enzym, takže nepoškozují okolní struktury •baktericidní účinek fagocytů, respirační vzplanutí (NADPH-oxidasa) •signální molekuly (první poslové), zatím jasně prokázáno u NO·, u některých dalších radikálů se předpokládá podobné působení • ‹#› 16 Negativní účinky kyslíkových radikálů Sloučenina Poškození Následky PUFA ztráta dvojných vazeb tvorba aldehydů a ROO· změna propustnosti membrán poškození membr. enzymů Proteiny agregace a síťování fragmentace + štěpení modifikace -SH a fenylu změny v transportu iontů vstup Ca2+ do cytosolu změny v aktivitě enzymů DNA štěpení deoxyribosy modifikace bází zlomy řetězce mutace translační chyby inhibice proteosyntézy ‹#› 17 Antioxidační systémy organismu • 1. Enzymy (endogenní) superoxiddismutasa, katalasa, glutathionperoxidasa • 2. Vysokomolekulární antioxidanty (endogenní) transferrin, ferritin, ceruloplazmin aj., vážou volné ionty kovů • 3. Nízkomolekulární antioxidanty (exogenní, endogenní) •redukující látky s fenolovým -OH (tokoferol, flavonoidy, urát) •redukující látky s enolovým -OH (askorbát) •redukující látky s -SH skupinou (glutathion, dihydrolipoát) •látky s rozsáhlým systémem konjugovaných dvojných vazeb (karotenoidy) • ‹#› 18 Superoxiddismutasa •obsažena v každé buňce, •fylogeneticky velmi starý enzym •katalyzuje dismutaci superoxidu 2 ·O2- + 2 H+ ® O2 + H2O2 •oxidační čísla kyslíku v reakci: •dvě izoformy: SOD1 (Cu, Zn, cytosol), SOD2 (Mn, mitochondrie) (-½) ® (0) + (-I) ‹#› 19 Eliminace H2O2 v organismu •katalasa - disproporcionace H2O2, obsažena v erytrocytech H2O2 ® ½ O2 + H2O •glutathionperoxidasa •obsahuje selenocystein, druhý substrát - glutathion (G-SH) • redukuje H2O2 a hydroperoxidy fosfolipidů (ROOH) • 2 G-SH + H-O-O-H ® G-S-S-G + 2 H2O • 2 G-SH + R-O-O-H ® G-S-S-G + R-OH + H2O neškodný derivát Proč šumí H2O2 při aplikaci na ránu? ‹#› 20 Nízkomolekulární antioxidanty Lipofilní Hydrofilní Tokoferol Karoteny - lykopen - lutein, zeaxanthin Ubichinola L-askorbát Flavonoidy Dihydrolipoáta Glutathiona Močová kyselinaa a Endogenní sloučeniny. ‹#› 21 Tokoferol •Lipofilní antioxidant buněčných membrán a lipoproteinů •Redukuje peroxylové radikály fosfolipidů na hydroperoxidy, které jsou dále redukovány GSH, tokoferol se oxiduje na stabilní radikál •PUFA-O-O· + Toc-OH ® PUFA-O-O-H + Toc-O· •Toc-O· se částečně redukuje na Toc-OH askorbátem n. GSH (fázové rozhraní) •Toc-O· + askorbát ® Toc-OH + semidehydroaskorbát ‹#› 22 Karotenoidy •Karotenoidy jsou polyisoprenoidní uhlovodíky (tetraterpeny) •Odstraňují peroxylové radikály, samy se při tom mění na stabilní karotenový radikál •Mají schopnost zhášet (deexcitovat) singletový kyslík •Zdroje v potravě: listová zelenina, žlutě, oranžově a červeně zbarvená zelenina a ovoce •Nejúčinnější antioxidant je lykopen, vyskytuje se pouze v některých potravinách, hlavně rajčata a výrobky z nich (kečupy, protlaky) – je termicky stabilní •Vysoký příjem lykopenu ve středomoří • ‹#› 23 images untitled imagesCATB0W20 kale imagesCAQ80LH4 imagesCAPW2TKL ‹#› 24 Obsah lykopenu v potravinách (mg/100 g) Rajský protlak Kečup Rajská štáva/omáčka Meloun Papaja čerstvá Rajčata čerstvá Meruňky kompot Meruňky čerstvé 10-150 10-14 5-12 2-7 2-5 1-4 ~ 0,06 ~ 0,01 Pro efektivní uvolnění a vstřebání lykopenu je třeba rajčata: • mechanicky rozmělnit • rozvařit • přidat olej ! ‹#› 25 Lykopen není prekurzor retinolu, nemá β-jononový kruh ‹#› 26 Lutein a zeaxanthin • patří mezi xanthofyly – kyslíkaté deriváty karotenoidů • vyskytují se zejména v zelené listové zelenině • obsažené ve žluté skvrně (macula lutea) a chrání ji před degenerací • četné preparáty na trhu ‹#› 27 Zeaxanthin and lutein se liší v poloze dvojné vazby a počtu chirálních center zeaxanthin (dvě chirální centra) lutein (tři chirální centra) ‹#› 28 Ubichinol (QH2) •Vyskytuje se ve všech membránách •Endogenní syntéza střevní mikroflórou z tyrosinu a farnesyldifosfátu (odbočka při biosyntéze cholesterolu) •Exogenní zdroje: klíčkový olej, játra, maso •Redukovaná forma QH2 pomáhá při regeneraci tokoferolu •Toc-O· + QH2 ® Toc-OH + ·QH • • • ‹#› 29 L-Askorbát (vitamin C) •Kofaktor hydroxylace prolinu (syntéza kolagenu) •Kofaktor (reduktant) hydroxylace dopaminu na noradrenalin •Silné redukční činidlo (Fe3+® Fe2+, Cu2+ ® Cu+) •Umožňuje vstřebávání železa z potravy •Redukuje radikály ·OH, ·O2-, HO2·, ROO· aj. •Regeneruje radikál tokoferolu •Odbourává se na oxalát !! •Nadbytek askorbátu má prooxidační účinky !! • neužívat velké dávky ‹#› 30 L-Askorbová je dvojsytná kyselina Dva konjugované páry: askorbová kys. / hydrogenaskorbát hydrogenaskorbát / askorbát dva enolové hydroxyly pKA1 = 4,2 pKA2 = 11,6 ‹#› 31 L-Askorbová kyselina má redukční účinky askorbová kys. dehydroaskorbová kys. (redukovaná forma) (oxidovaná forma) ‹#› 32 Flavonoidy a ostatní polyfenoly •Ubikvitárně rozšířené v rostlinách, nejhojnější redukční sloučeniny v naší stravě •Celkový příjem je cca 1 g (mnohem vyšší než u vitaminů) •Deriváty chromanu (benzopyranu), obsahují mnoho fenolových hydroxylů •Hlavní představitel kvercetin •Redukují volné radikály a samy jsou přeměněny na málo reaktivní fenoxylové radikály •Chelatují ionty kovů (Fe2+, Cu+) a zabraňují tak jejich účasti ve Fentonově reakci • • ‹#› 33 Hlavní zdroje flavonoidů a jiných polyfenolů •zelenina (nejvíc cibule) •ovoce (jablka, citrusy, hrozny) •zelený čaj, černý čaj •kakao, čokoláda •olivový olej (Extra Virgin) •červené víno • kvercetin 99_cacao ‹#› 34 Glutathion (GSH) •tripeptid •γ-glutamylcysteinylglycin •tvoří se ve všech buňkách •redukční činidlo (-SH) •redukuje H2O2 a ROOH (glutathionperoxidasa) •redukuje různé kyslíkové radikály •regeneruje -SH skupiny proteinů a koenzymu A •podílí se na regeneraci tokoferolu a askorbátu • ‹#› 35 Regenerace redukované formy GSH •musí být zajištěna plynulá regenerace redukované formy glutathionu (GSH) •glutathionreduktasa, významná v erytrocytech •GSSG + NADPH + H+ ® 2 GSH + NADP+ • pentosový cyklus ‹#› 36 Dihydrolipoát •kofaktor oxidační dekarboxylace pyruvátu a 2-oxoglutarátu •redukuje mnoho radikálů (mechanismus není znám) •podílí se na regeneraci tokoferolu •terapeutické použití (acidum thiocticum) – diabetické neuropatie • dihydrolipoát (redukovaná forma) lipoát (oxidovaná forma) ‹#› 37 Kyselina močová •Konečný katabolit purinových bází, dvojsytná kyselina •V tubulech se z 90 % resorbuje •Nejhojnější antioxidant krevní plazmy (150-400 μmol/l) •Má výrazné redukční účinky, redukuje radikály RO·, •Váže kationty železa a mědi • • ‹#› 38 Laktimová forma kys. močové je dvojsytná kyselina kys. močová hydrogenurát urát pKA1 = 5,4 pKA2 = 10,3 2,6,8-trihydroxypurin ‹#› 39 Redukční účinky kyseliny močové Různé přeměny radikál (oxidovaná forma) hydrogenurát odštěpí jeden elektron R· je např. ·OH, superoxid aj. hydrogenurát (redukovaná forma) Srovnejte koncentrace v krevní plazmě: Askorbát: 10 - 100 μmol/l Urát: 200 - 420 μmol/l