Genetika v ZL cvičení jaro 2013 Mgr. Petra Bořilová Linhartová peta.linhartova@gmail.com Doporučená literatura • Vašků A., Izakovičová Hollá L., Gaillyová R.: Genetika v zubním lékařství (http://www.med.muni.cz/patfyz/) • Nussbaum R.L., McInnes R.R., Willard H.F.: Klinická genetika. 2004. • Šmarda J. a kol.: Metody molekulární biologie. Brno, 2005 • Aktivní účast na cvičení • Protokol a přeložený abstrakt odborné publikace • 70% úspěšnost v testu Požadavky na ukončení předmětu Obsah cvičení Teoretická část 1. cvičení - význam DNA diagnostiky v patogenezi parodontitidy Praktická část • Detekce polymorfismu v genu pro interleukin-1 1. cvičení – polymerázová řetězová reakce a restrikční štěpení 2. cvičení – elektroforéza na agarózovém gelu Parodontitida • destruktivní zánětlivé onemocnění postihující podpůrné tkáně zubů (ztráta závěsného aparátu, alveolární kosti, zubů) • multifaktoriální choroba – faktory exogenní i endogenní Parodontitida Etiologie • mikrobiální povlak - anaerobní G- bakterie (P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans, T. forsythia. T. denticola, P. intermedia aj.) • poškození parodonotu způsobeno: - produkty bakterií (např. toxiny, enzymy, LPS,...) - látky vznikající během zánětu (např. prozánětlivý TNF , IL-1 , , R) Parodontitida Kandidátní geny • Geny pro imunoregulační faktory – interleukiny (IL-1, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL- 18 a další) • Metaloproteinasy (MMP1, MMP3, MMP9, MMP12 a další) • Produkty kostní remodelace (VDR, RAGE, SFTPD a další) Cytokiny • široká škála signálních peptidů, některé mají i hormonální účinky • slouží ke komunikaci nejen leu, ale i b. kostní dřeně endotelu a dalších…řídí proliferaci, diferenciaci a funkci buněk IS • podílí na procesech zánětu a na neuronálním, krvetvorném a embryonálním vývoji organismu • nejsou uloženy v žlázách (oproti hormonům), jsou rychle syntetizované a vylučované různými buňkami většinou po stimulaci • jsou pleiotropní • působení jiných cytokinů aditivním, synergickým nebo protichůdným způsobem Interleukin-1 • prozánětlivý mediátor - cytokin • uvolňován monocyty, makrofágy, fibroblasty a dendritickými buňkami • stimuluje resorpci kosti a reguluje proliferaci fibroblastů gingiválního i ligamentálního původu Interleukin-1 Biochemické parametry • hladiny IL-1α a IL-1β (prozánětlivé cytokiny) a poměr IL- 1 s antagonistou IL-receptoru (protizánětlivý cytokin) -↑ u chorob parodontálních tkání Gen pro IL-1 • na chromozomu 2q13-q21 • recesivní alely IL-1A -889 a IL-1B +3953 - ↑ genové transkripce a produkce proteinů (↑ prozánětlivá odpověď) • recesivní alely IL-1RN VNTR - ↓ genové transkripce… Salivary biomarkers of existing periodontal disease: a cross-sectional study. J Am Dent Assoc. 2006 Mar;137(3):322-9. Miller CS, King CP Jr, Langub MC, Kryscio RJ, Thomas MV. BACKGROUND: The authors conducted a study to determine if salivary biomarkers specific for three aspects of periodontitis inflammation, collagen degradation and bone turnover correlate with clinica features of periodontal disease. METHODS: The relationship between periodontal disease and the levels of interleukin-1 beta (IL- 1beta), matrix metalloproteinase (MMP)-8, and osteoprotegerin (OPG) in whole saliva of 57 adults (28 "case" subjects with moderate-to-severe periodontal disease and 29 healthy control subjects) was examined in a case-control trial. RESULTS: Mean levels of IL-1beta and MMP-8 in saliva were significantly higher in case subjects than in controls. Both analytes correlated with periodontal indexes, whereas, after adjustment for confounders, OPG did not. Elevated salivary levels of MMP-8 or IL-1beta (more than two standard deviations above the mean of the controls) significantly increased the risk of periodontal disease (odds ratios in the 11.3-15.4 range). Combined elevated salivary levels of MMP-8 and IL-1beta increased the risk of experiencing periodontal disease 45-fold, and elevations in all three biomarkers correlated with individual clinical parameters indicative of periodontal disease. CONCLUSION: Salivary levels of MMP-8 and IL-1beta appear to serve as biomarkers of periodontitis. CLINICAL IMPLICATIONS: Qualitative changes in the composition of salivary biomarkers could have significance in the diagnosis and treatment of periodontal disease. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ Komerčně dostupné testy testují přítomnost: • mikrobiálních patogenů • specif. s parodontitidou asociovaného IL-1 genotypu GenoType™ PST test od Dentalyse™ GenoType PST® test od HAIN Diagnostics ™ PCR • popsal v r. 1983 Kary B. Mullis, 1993 NP • princip: enzymatická amplifikace DNA in vitro syntézou mnoha kopií vybrané sekvence DNA v cyklické reakci o třech teplotních fázích (denaturace, annealing, extenze) • výsledek: počet kopií dané sekvence DNA- 2n (n-počet cyklů) PCR • komponenty reakční směsi pro PCR: – voda – pufr – dNTP (dATP+dTTP+dCTP+dGT) – MgCl2 – termostabilní DNA polymeráza (např. Taq z bakterie Thermus aquaticus) – oligonukleotidové sondy (“primery”) - specifická Ta – templátová DNA PCR • teplotní režim (v termocycleru): 1) 95ºC 2„ iniciální denaturace 2) 96ºC 30„„denaturace 3) 40-72ºC 20„„ annealing 4) 72ºC 30„„ elongace • kroky 2 – 4 celkem 30x 5) 72ºC 5„ závěrečná elongace 6) 4ºC 10„ zchlazení http://www.youtube.com/watch?v=2KoLnIwoZKU&featu re=related Detekce polymorfismu v genu pro interleukin-1 Detekce SNP rs1143634 IL-1β +3953C/T PCR - postup 1) popsat mikrozkumavky 2) rozmrazit a promíchat chemikálie, Taq polymerázu udržovat v chladu 3) přípravit MasterMix (viz. rozpis), protřepat, centrifugovat zkumavky, rozpipetovat MM do mikrozkumavek 4) rozpipetovat DNA do mikrozkumavek 5) zakápnout minerálním olejem 6) vložit mikrozkumavky do termocykleru 7) nastavit program v termocykleru a zapnout běh Detekce polymorfismu v genu pro interleukin-1 PCR – reakční směs Tm = 4(G+C)+2(A+T) Ta = (0,3Tm)+28,7 (%GC/100)–(472,5/PCR produktu v bp)+27 Master Mix (MM) roztok Množství v µl na 1 vzorek Množství v µl na vzorků PCR voda 12,5 Pufr bez MgCl2 2,5 MgCl2 (25 mM) 4,0 Primer forward IL-1β 1,25 Primer reverse IL-1β 1,25 dNTP 0,5 Taq polymeráza (1 Uµl-1) 1,0 23,0 µl MM + 2,0 µl templátové DNA (50 ngµl-1) + 1 kapka minerálního oleje na 1 vzorek SNP rs1143634 IL-1β +3953C/T Sekvence TAGTGGAAAC TATTCTTAAA GAAGATCTTG ATGGCTACTG ACATTTGCAA CTCCCTCACT CTTTCTCAGG GGCCTTTCAC TTACATTGTC ACCAGAGGTT CGTAACCTCC CTGTGGGCTA GTGTTATGAC CATCACCATT TTACCTAAGT AGCTCTGTTG CTCGGCCACA GTGAGCAGTA ATAGACCTGA AGCTGGAACC CATGTCTAAT AGTGTCAGGT CCAGTGTTCT TAGCCACCCC ACTCCCAGCT TCATCCCTAC TGGTGTTGTC ATCAGACTTT GACCGTATAT GCTCAGGTGT CCTCCAAGAA ATCAAATTTT GCCGCCTCGC CTCACGAGGC CTGCCCTTCT GATTTTATAC CTAAACAACA TGTGCTCCAC ATTTCAGAAC CTATCTTCTT Y (C/T) GACACATGGG ATAACGAGGC TTATGTGCAC GATGCACCTG TACGATCACT GAACTGCACG CTCCGGGACT CACAGCAAAA AAGCTTGGTG ATGTCTGGTC CATATGAACT GAAAGCTCTC CACCTCCAGG GACAGGATAT GGAGCAACAA GGTAAATGGA AACATCCTGG TTTCCCTGCC TGGCCTCCTG GCAGCTTGCT AATTCTCCAT GTTTTAAACA AAGTAGAAAG TTAATTTAAG GCAAATGATC AACACAAGTG AAAAAAAATA TTAAAAAGGA ATATACAAAC TTTGGTCCTA GAAATGGCAC ATTTGATTGC ACTGGCCAGT GCATTTGTTA ACAGGAGTGT GACCCTGAGA AATTAGACGG CTCAAGCACT CCCAGGACCA TGTCCACCCA IL-1BF CTC AGG TGT CCT CGA AGA AAT CAA A IL-1BR GCT TTT TTG CTG TGA GTC CCG Detekce polymorfismu v genu pro interleukin-1 PCR - průběh • v termocykleru Sensoquest labcycler (Schoeller) 1. 95°C 5 minut 2. 95°C 1 minuta 3. 60°C 1 minuta 4. 72°C 1 minuta krok 2.- 4. – cyklus 35x 5. 72°C 7 minut 6. 10°C 10 minut PCR PCR RFLP = analýza délky restrikčních fragmentů • analýza DNA pomocí specifického štěpení restrikčními endonukleázami (RE) RE • enzymy bakterií vyvinuté během evoluce k štěpení cizí DNA • název odvozen dle jejich původce - např. EcoRI (E.coli) • rozpoznávací specif. oblast (palindrom) 5 -CCT G AATTC AGG-3 3 -GGA CTTAA G TCC-5 • štěpí vnitřní fosfodiesterové vazby • schopny rozpoznat a štěpit JEN specifické sekvence (zamezení bakt. narušení vlastní DNA) • mají specifickou teplotu, při které štěpení probíhá optimálně • využití - při detekci určité mutace (SNP) Detekce polymorfismu v genu pro interleukin-1 RA - postup 1) popsat mikrozkumavky 2) rozmrazit a promíchat chemikálie 3) přípravit MasterMix (viz. rozpis), protřepat, centrifugovat zkumavky, rozpipetovat MM do mikrozkumavek 4) rozpipetovat amplikon do mikrozkumavek 5) zakápnout minerálním olejem 6) vložit mikrozkumavky do termostatu na 65°C a inkubovat min. 4 hodiny Detekce polymorfismu v genu pro interleukin-1 RA – reakční směs • enzym TaqI 5 -T CGA- 3 3 -AGC T- 5 Velikost produktů • CC 99 bp + 77 bp • CT 176 bp + 99 bp + 77 bp • TT 176 bp Master Mix (MM) roztok Množství v µl na 1 vzorek Množství v µl na vzorků RA voda 1,0 Pufr pro TaqI 1,7 Enzym TaqI 0,3 3,0 µl MM + 15,0 µl amplikonu + 1 kapka minerálního oleje na 1 vzorek SNP rs1143634 IL-1β +3953C/T Sekvence TAGTGGAAAC TATTCTTAAA GAAGATCTTG ATGGCTACTG ACATTTGCAA CTCCCTCACT CTTTCTCAGG GGCCTTTCAC TTACATTGTC ACCAGAGGTT CGTAACCTCC CTGTGGGCTA GTGTTATGAC CATCACCATT TTACCTAAGT AGCTCTGTTG CTCGGCCACA GTGAGCAGTA ATAGACCTGA AGCTGGAACC CATGTCTAAT AGTGTCAGGT CCAGTGTTCT TAGCCACCCC ACTCCCAGCT TCATCCCTAC TGGTGTTGTC ATCAGACTTT GACCGTATAT GCTCAGGTGT CCTCCAAGAA ATCAAATTTT GCCGCCTCGC CTCACGAGGC CTGCCCTTCT GATTTTATAC CTAAACAACA TGTGCTCCAC ATTTCAGAAC CTATCTTCTT Y (C/T) GACACATGGG ATAACGAGGC TTATGTGCAC GATGCACCTG TACGATCACT GAACTGCACG CTCCGGGACT CACAGCAAAA AAGCTTGGTG ATGTCTGGTC CATATGAACT GAAAGCTCTC CACCTCCAGG GACAGGATAT GGAGCAACAA GGTAAATGGA AACATCCTGG TTTCCCTGCC TGGCCTCCTG GCAGCTTGCT AATTCTCCAT GTTTTAAACA AAGTAGAAAG TTAATTTAAG GCAAATGATC AACACAAGTG AAAAAAAATA TTAAAAAGGA ATATACAAAC TTTGGTCCTA GAAATGGCAC ATTTGATTGC ACTGGCCAGT GCATTTGTTA ACAGGAGTGT GACCCTGAGA AATTAGACGG CTCAAGCACT CCCAGGACCA TGTCCACCCA IL-1BF CTC AGG TGT CCT CGA AGA AAT CAA A IL-1BR GCT TTT TTG CTG TGA GTC CCG Statistika CT CC st CT CC OR • Odds Ratio - poměr šancí • míra velikosti účinku, popisující sílu asociací nebo nezávislosti mezi dvěma hodnotami binárních dat • používá se pro účely deskriptivní statistiky a hraje důležitou úlohu v logistické regresi P • Pravděpodobnost náhodného jevu je číslo, které je mírou očekávatelnosti výskytu jevu. • Náhodným jevem rozumíme opakovatelnou činnost prováděnou za stejných (nebo přibližně stejných) podmínek, jejíž výsledek je nejistý a závisí na náhodě. • Pravděpodobnost události se obecně označuje reálným číslem od 0 do 1. CI • Confidence interval = interval spolehlivosti • známý jen jeden výběr z populace a jeho aritmetický průměr • zajímá nás v jakém pásmu kolem zjištěného aritmetického průměru se s předem stanovenou pravděpodobností nachází skutečná střední hodnota Elektroforéza CT CC st CT CC • separace NA v elektrickém poli v gelu (molekulární síto) na základě rozdílného náboje (amino či fosfátových skupin) a velikosti – gel z agarózy (horizontálně) – lineární polymer z řasy Agar agar • elektroforetická pohyblivost vzorků je srovnána se standardy o známé velikosti • Loading buffer – nanášecí pufr: - Ficoll - hustý, drží vzorek na dně - bromfenolová modř - vizualizace D-galaktosa 3,6-anhydro L-galaktosa Ficoll Elektoroforéza CT CC st CT CC • DNA nutno vizualizovat • fluorescenční barviva x interkalační barvivo (EtBr UV světlo 590nm, kancerogen, mutagen, teratogen!) Elektoroforéza CT CC st CT CC Elektroforéza CT CC st CT CC 1) příprava nalévací misky (olepit páskou nebo umístit do „formičky“, nasadit hřebínek a zkontrolovat jeho vzdálenost ode dna) 2) umístění vaničky na vodorovnou podložku 3) příprava gelu: • navážit agarózu a přenést do Erlenmayerovy baňky (5x větší objem než je objem připravovaného gelu) • Přidat TBE pufr 1x koncentrovaný • Přivést roztok 3x k varu v mikrovlnné troubě, doplnit dest. vodou 4) Přidat EtBr k roztoku, nalití agarózy do vaničky o teplotě cca 40 ºC • EtBr - teplotně labilní, při přidání do vroucí agarózy dochází k jeho degradaci !! + některé vaničky jsou citlivé na vysoké teploty 5) chladnutí gelu 6) odstranění hřebínku a pásek kolem, vložení do vany s pufrem Elektroforéza CT CC st CT CC 1) na gel nanést velikostní standard (do 2. jamky od kraje) 2) připravit si na parafinový papír kapku (2μl) nanášecího pufru 3) vzorek smíchat na parafínu s nanášecím pufrem 4) vzorek nanést na gel 5) zkontrolovat ponoření všech jamek pod pufrem 6) zapnout elektrický obvod (nastavit konstantní napětí) – ve vaně se začnou tvořit bublinky 7) sledovat postup vzorku na gelu 8) odpojit od zdroje 9) vyhodnotit pod UV světlem 10) vyfotit gel Výsledek genotypizace PCR VNTR IL-1RN intron 2 86bp repetice PCR RFLP IL-1α -889C/T T 99bp C 16bp + 83bp 1. 4 repetice – 412bp 2. 2 repetice – 240bp 3. 3 repetice – 326bp 4. 5 repetic – 498bp 5. 6 repetic – 584bp IL-1β +3953C/T exon 5 T 182bp +12bp C 97bp + 85bp +12bp st 12 11 11 22 24 CT CC st CT CC ABO systém • na membránách ery se vyskytují různé antigeny bílkovinné podstaty zvané aglutinogeny • reakce s těmito antigeny způsobují shlukování - aglutinaci – krve • nejvýznamnější jsou právě aglutinogen A a aglutinogen B • podle toho, které z těchto aglutinogenů jsou přítomny, se určuje krevní skupina: • Skupina A - tvoří se pouze aglutinogen A • Skupina B - tvoří se pouze aglutinogen B • Skupina AB - tvoří se oba aglutinogeny • Skupina 0 - netvoří se aglutinogen (antigen) A nebo B • kromě systému antigenů AB0 se rozlišuje ještě velké množství dalších systémů (Rh, MNSs, Lewis, P atd.) Krevní skupiny Krevní skupiny Dědičnost - kodominance • uplatňují se různé alely jednoho genu (AB0 gen; 9q34). • alely podmiňující tvorbu aglutinogenu (buď A nebo B) jsou dominantní vůči alele, která nepodmiňuje tvorbu žádného aglutinogenu Alelické vztahy: • A k B – kodominance • A k 0 a B k 0 - dominance • 0 - recesivní • Fenotyp - krevní skupina A - Genotyp AA nebo A0 • Fenotyp - krevní skupina B - Genotyp BB nebo B0 • Fenotyp - krevní skupina AB - Genotyp AB • Fenotyp - krevní skupina 0 - Genotyp 00 Krevní skupiny Rh faktor • systém Rh, objevený Wienerem na základě pokusu s krví opice druhu Maccacus Rhesus. • Rh pozitivní (Rh+) a Rh negativní (Rh-) • význam zde mají zejména antigeny C, D, E / c, d, e • Rh pozitivní - u jedince je přítomen antigen D • Rh negativní - u jedince bez přítomnosti D (značeno d) • protilátky proti Rh pozitivní skupině (anti-D protilátky) se u Rh negativného jedince nevyskytují přirozeně (narozdíl od AB0 systému), ale objeví se až v případě imunizace jedince Rh+ krví (např. při nevhodné transfuzi nebo při inkompatibilním těhotenství - viz dále) • v ČR jsou přibližně čtyři pětiny obyvatelstva Rh+ Krevní skupiny Rh faktor - Inkompatibilní gravidita • první těhotenství ženy (i přerušené) - během porodu se Rh+ krvinky dítěte dostanou do Rh- krve matky → vytvoří protilátky. • při dalším těhotenství, je-li dítě opět Rh+, pronikají matčiny protilátky do krevního oběhu plodu, napadají a rozkládají tu krvinky, dochází k hemolýze (chudokrevnost, těžká novorozenecká žloutenka, poškození některých vnitřních orgánů včetně mozku). Řešením krevní transfúze. • do 72 hodin od narození dítěte nitrosvalová injekce lidského imunoglobulinu antiRhO. Tím jsou odstraněny díky imunoglobulinům z krevního oběhu matky ty červené krvinky, které obsahují Rh+ faktor plodu, tak je odrušen podnět tvorby mateřských protilátek proti Rh faktoru dítěte. Krevní skupiny Rh+Rh- Rh+ Dědičnost - Rh faktor • Na dědičnosti Rh systému se podílí dva geny: RHD (1p36.2p34), který určuje přítomnost / nepřítomnost antigenu D, a RHCE (1p36.2-p34), který určuje antigeny C/c a E/e. Jak již bylo řečeno, pro Rh+ fenotyp je rozhodující přítomnost antigenu D. • můžeme tedy zjednodušeně říci, že Rh+ se dědí dominantně a osoby Rh negativní jsou recesivní homozygoti: • Rodiče Rh+ X Rh+ = Dítě Rh+ nebo Rh• Rodiče Rh+ X Rh- = Dítě Rh+ nebo Rh• Rodiče Rh- X Rh- = Dítě pouze RhKrevní skupiny Dědičnost vázaná na pohlavní chromozomy • Vlastnosti pohlavím ovládané (Sex-limited) • Vlastnosti pohlavím ovlivněné (Sex-influenced) • Vlastnosti vázané na pohlaví Sex-linked) Vlastnosti pohlavím ovládané (Sex-limited) • podmíněny autozomálními geny, ale jejich fenotypový projev je kontrolován vnitřním prostředím, zejména pohlavními hormony • v průběhu ontogenetického vývinu se projevují zpravidla u jednoho pohlaví, ale genetická informace pro tyto znaky a vlastnosti je u obou pohlaví. • typickými znaky pohlavím ovládanými jsou všechny sekundární pohlavní znaky (produkce mléka nebo produkce vajec) Vlastnosti pohlavím ovládané (Sex-limited) • zbarvení u rybek paví očko • Zebrus barevná kresba pouze u samčích homozygotů ZeZe a heterozygotů Zeze Vlastnosti pohlavím ovlivněné (Sex-influenced) • vlastnost, která je přítomná u obou pohlaví, ale je nejlépe projevena u jednoho pohlaví než u druhého • exprese heterozygotního genotypu některých znaků je ovlivněna pohlavím svého nositele • jedná se o lokusy umístěné v autozomech, ale pohlaví způsobuje "změnu dominance" a projev recesivní alely heterozygotního genotypu (Mahagonové zbarvení ayrshirského skotu, předčasná plešatost u lidí, ženský typ hlasového projevu a intenzita ochlupení těla) Vlastnosti pohlavím ovlivněné (Sex-influenced) • zbarvení srsti ayshirského skotu • M - mahagonové zbarvení srsti • m - zbarvení červené • • homozygoti MM - krávy i býci • heterozygoti Mm - mahagonoví jen býci, protože kravám chybí faktory vnitřního prostředí pro projev dominantní alely v heterozygotní konstituci • homozygoti mm - červené zbarvení bez ohledu na pohlaví Vlastnosti vázané na pohlaví (Sex-linked) • vlastnosti, které jsou neseny pohlavními chromozomy, obvykle na diferenciálním úseku X a Y chromozomu • u zvířat s XY pohlaví určujícím mechanizmem je na X chromozomu uloženo mnoho lokusů, z nichž mnohé nemusí být ve spojení s určením pohlaví • chromozom Y je obvykle menší a obsahuje méně lokusů, které nejsou stejné jako na chromozomu X • samice se stejnými alelami v lokusu na X chromozomu jsou homozygotní, s různými heterozygotní • samci, protože mají jen jeden X chromozom, jsou hemizygotní a mohou mít jen jednu alelu v lokusu. Stačí jedna recesivní alela, aby se projevila ve fenotypu samce. Vlastnosti vázané na pohlaví (Sex-linked) 1. Dědičnost znaků neúplně vázaných na pohlaví • geny jsou umístěny na homologních úsecích pohlavních chromozomů, takže může docházet ke crossing-overům • alely těchto znaků se dědí jako geny na autozomech 2. Dědičnost znaků úplně vázaných na pohlaví • geny jsou umístěny na nehomologních (heterologních) úsecích pohlavních chromozomů, takže nemůže docházet ke crossing-overům • odchylky od Mendelova pravidla segregace Vlastnosti vázané na pohlaví (Sex-linked) Alely lokalizované na nehomologním úseku X (Z) chromozomu • gen je lokalizován na nehomologním (nepárovém) úseku chromozomu X (Z) • na chromozomu Y (W) se tento gen nevyskytuje stav hemizygotní • v tomto případě lokalizace genetické informace mluvíme o dědičnosti křížem. • prakticky se využívá při autosexingu kuřat Vlastnosti vázané na pohlaví (Sex-linked) Alely umístěny na nehomologních úsecích Y (W) • geny lokalizované na nehomologních úsecích chromozomu Y (W) vykazují tzv. dědičnost přímou • tyto geny se nazývají jako holandrické • na chromozomu X (Z) není tento gen lokalizován • jsou přenášeny z otce na syna (Y) u savců, nebo z matky na dceru (W) u drůbeže Vlastnosti vázané na pohlaví (Sex-linked)