Genetika zubním lékařství (18.2.2013) ■L Petra Bořilová Linhartová peta.linharto va @ gmail.com Doporučená študijní literatúra Skripta: http://www.med.muni.cz/patfyz/gzl.pdf Essential genetics: a genomics perspective. Edited by Daniel L. Hartl - Elizabeth W. Jones. 2002. METODY MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE Nussbaum R.L., Mclnnes R.R., Willard H.F.: Klinická genetika. 2004. Šmarda J. a kol.: Metody molekulární biologie. Brno, 2005 Alberts B. et kol.: Essential cell biology: An Introduction to the Molecular Biology of the Cell. Essential Cell Biology r Rosypal S.: Uvod do molekulární biologie Rosypal S. a kol.: Terminologie molekulární biologie. Brno, 2001. Mazura I. a kol.: Speciální metody molekulární biologie. Praha, 2001. Odborné články: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ Obsah přednášky • Struktura lidského genomu • Reakce lidského genomu na vlivy prostředí. Exonové, intronové a promotorové mutace. • Monogenní a polygenní choroby a vztah multigenních nemocí a prostředí. • Genetické studie a klinická genetika. Genetika brněnský kněz a středoškolský profesor Johann Gregor Mendel se zabýval křížením různobarevných odrůd hrachu Genotypové zákony: Zákon o samostatnosti alel Genotyp je soubor samostatných genů určujících znaky. Každý znak je určen dvojicí samostatných alel. Zákon o segregaci alel Dvojice samostatných alel se při zrání rozcházejí a do každé gamety přechází jedna z obou alel. Zákon o nezávislé kombinaci alel Fenotypové zákony Zákon o uniformitě hybridů Křížíme-\i dominantního homozygota s homozygotem recesivním, jsou jejich potomci Fl generace v sledovaném znaku všichni stejní. Reciproká křížení u jakýchkoliv jedinců Fl generace dávají shodné výsledky. Zákon o štěpení v potomstvu hybridů Při křížení heterozygotů lze genotypy a fenotypy vzniklých jedinců vyjádřit poměrem malých celých čísel. Vzniká genotypový a fenotypový štěpný poměr. 1. Mendelův zákon Zákon o uniformitě Fl (1. filiální = první generace potomků) generace. Při vzájemném křížení 2 homozygotů vznikají potomci genotypově i fenotypově jednotní. Pokud jde o 2 různé homozygoty jsou potomci vždy heterozygotními hybridy. Při křížení dvou homozygotů (dominantního - AA a recesivního - aa) vzniká jednotná generace potomků - heterozygotů se stejným genotypem (Aa) i fenotypem. WĚĚĚĚĚ, A A a Aa Aa a Aa Aa 2. Mendelův zákon Zákon o náhodné segregaci genů do gamet. Při křížení 2 heterozygotů může být potomkovi předána každá ze dvou alel (dominantní i recesivní) se stejnou pravděpodobností. Dochází tedy ke genotypovému a tím pádem i fenotypovému štěpení = segregaci. Pravděpodobnost pro potomka je tedy 25% (homozygotně dominantní jedinec): 50% (heterozygot): 25% (homozygotně recesivní jedinec). Tudíž genotypový štěpný poměr 1:2:1. Fenotypový štěpný poměr je 3:1, pokud j e mezi alelami vztah kodominance, odpovídá fenotypový štěpný poměr štěpnému poměru genotypovému (tj. 1:2:1). IIIIIIIIIIIP A a ^^^^^^^^^^ u. A AA Aa a Aa aa 3. Mendelův zákon • Zákon o nezávislé kombinovatelnosti alel. Při zkoumání 2 alel současně dochází k téže pravidelné segregaci. Máme-li 2 dihybridy AaBb může každý tvořit 4 různé gamety (AB, Ab, aB, ab). Při vzájemném křížení tedy z těchto 2 gamet vzniká 16 různých zygotických kombinací. Některé kombinace se ovšem opakují, takže nakonec vzniká pouze 9 různých genotypů (poměr 1:2:1:2:4:2:1:2:1. Fenotypový štěpný poměr je 9:3:3:1. Tento zákon platí pouze v případě, že sledované geny se nachází na různých chromozomech, nebo je jejich genová vazba natolik slabá, že nebrání jejich volné kombinovatelnosti. Rozdělení genotypu AB Ab aB ab AB AABB | AaBB AaBb Ab AaBB AAbb AaBb Aabb aB AaBb aaBB aaBb ab AaBb Aabb aaBb aabb 1:2:1:2:4:2:1:2:1 Rozdělení fenotypu íSSSSSSSSSSSSSSSS AB Ab aB ab AB AABB AABb AaBB AaBb Ab AABb AAbb AaBb Aabb aB AaBB AaBb aaBB aaBb ab AaBb Aabb aaBb aabb 9:3:3:1 Genetika specializovaný biologický obor zabývající se variabilitou (proměnlivostí) a dědičností o klinická genetika • zabývá se diagnostikou, léčením a prevencí genetických nemocí (u celé rodiny!) • genetické poradenství o lidská genetika • studuje variabilitu a dědičnost u člověka o cytogenetika • studium chromozomů o molekulární genetika • studium struktury a funkce jednotlivých genů o populační genetika • studium proměnlivosti populací o komparativní a evoluční genetika • mezidruhové srovnání a studium evoluce druhů Genomika studuje strukturu a funkci genomů pomocí genetického mapování, sekvenování a funkční analýzy genů snaží se o pochopení veškeré informace obsažené v DNA živých organizmů o strukturní genomika = pochopení struktury genomu — konstrukce detailních genetických, fyzických a transkripčních map genomů příslušných organizmů — reprezentovala zejména iniciální fázi analýzy genomů; konečným cílem byla kompletní znalost DNA sekvence (např. HUGO projekt) o bioinformatika = shromažďování, analýza a vizualizace biologických souborů dat — využívá metod výpočetní techniky, tvorba databází a softwarů o funkční genomika = studium funkce genů a ostatních částí genomu W^V — využívá poznatků strukturní genomiky a snaží se o poznání funkce genů; velmi ^^^m^, často k tomu využívá modelové organizmy (kvasinka, nematoda, Drosophila melanogaster, Mus musculus, Rattus norvegicus, Mesocricetus auratus aj.) jako časově a finančně výhodnou alternativu vyšších živočichů (zejm. pro možnost studovat mnoho generací v relativně krátkém čase) DNA • molekula DNA jako taková byla objevena v roce 1869, kdy se švýcarskému lékaři Friedrich Miescherovi podařilo vyizolovat DNA z bílých krvinek 1962 obdrželi společně Francis Crick, James Watson a Maurice Wilkins Nobelovu cenu za fyziologii a lékařství. Rosalyn Franklin se pro tragické úmrtí této ceny nedočkala. DNA NH2 0-P=0 Níŕ^YH NH2 I H Cytoslri (C) H N^VH H^isi^H Pyrimidin I O i H Thymi n [T) o nATh I H Uracil (U) H2N N N H H Guanin (G| N N H i H Adenin (A) Gen = konkrétní úsek molekuly DNA nesoucí informaci pro tvorbu proteinu nebo NA (rRNA, tRNA...). geny strukturní geny pro RNA geny regulační exony = funkční úseky genu, které jsou přepisovány do mRNA a dále translantovány při proteosyntéze introny = úseky genu, jejichž funkce dosud nebyla zcela objasněna a které nejsou využívány pro translaci Dle jejich obsahu geny dělíme na: jednoduché - obsahují pouze exony složené - obsahují i introny genové rodiny = sekvenčně podobné geny, které vznikly zřejmě duplikací během evoluce, např. geny pro (hemo)globiny, imunoglobuliny, ... Struktura genu a jeho transkripce Genová translace Genetický kód určuje pořadí aminokyselin v proteinu - univerzální • podobný princip u většiny živých organizmů - tripletový • trojkombinace 4 nukleotidů (A, C, G, T) - degenerovaný • 43 = 64, ale aminokyselin jen 21 1. pozice 2. pozice 3. pozice u uuu Phe ucu Ser UAU Tyr UGU Cys U uuc Phe ucc Ser UAC Tyr UGC Cys C UUA Leu UCA Ser UAA Stop UGA Stop A UUG Leu UCG Ser (JAG Stop UGG Trp G CUU Leu CCU Pro CAU His CGU Arg U CUC Leu CCC Pro CAC His CGC Arg C CUA Leu CCA Pro CAA Gin CGA Arg A CUG Leu CCG Pro CAG Gin CGG Arg G AUU lle ACU Thr AAU As n AGU Ser U AUC lle ACC Thr AAC As n AGC Ser C AUA lle ACA Thr AAA Lys AGA Arg A AUG Met ACG Thr AAG Lys AGG Arg G GUU Val GCU Ala GAU Asp GGU Gly U GUC Val GCC Ala GAC As p GGC Gly C GUA Val GCA Ala GAA Glu GGA Gly A GUG Val GCG Ala GAG Glu GGG Gly G Základní genetické pojmy • chromozom • lokus • alely - dominantní - recesivní • homozygot • heterozygot • genotyp • fenotyp Gene Alleles _Gene Locus Homologous Chromosomes centromere region DNA-histone fiber DNA Gene Gene DNA and proteins are multi-folded Homologous chromosomes Mitóza a meióza Mitóza = 2 dceřinné buňky s diploidním počtem chromozomů, 1 cyklus DNA replikace následuje rozdělení chromozomů a jádra (profáze —> prometafáze —> metafáze —>■ anafáze —> telofáze) a násl. celé buňky (cytokineze) Meióza = 1 cyklus replikace následován 2 cykly segregace chromozomů a buněčného dělení 1. meiotické (redukční) dělení - rozdělení homologních chromozomů významné - odehrává se zde meiotický crossing over (rekombinace) - žádná z gamet není identická! poruchy rozestupu - např. trisomie 2. meiotické dělení - rozestup sesterských chromatid 2 dceřinné buňky s haploidním počtem chromozomů vznik pohlavních buněk (spermie, vajíčko) dodatečné promíchání genetického materiálu crossing-overem MEIOSIS paternal homolog maternal homolog I DNA REPLICATION PAIRING OF DUPLICATED HOMOLOGOUS CHROMOSOMES BIVALENTS LINE UP ON THE SPINDLE DNA REPLICATION | MITOSIS DUPLICATED CHROMOSOMES LINE UP INDIVIDUALLY ON THE SPINDLE CELL DIVISION DIOIOICMQia gametes Lidský génom • Human Genome Project (HUGO) vs. Celera Genomics Inc. - v r. 2001 zveřejnění prvních výsledků, genom Jamesa D. Watsona (2008) • gen = konkrétní úsek molekuly DNA nesoucí informaci pro tvorbu proteinu nebo NA (rRNA, tRNA...). ~ 21 tisíc genů (2011) pseudogen = sekvence DNA, která je podobná genu, ale nedochází k jejímu přepisování v RNA (transkripci). ~ 20 tisíc pseudogenů genom = soubor všech genů v jedné buňce, genom jaderný a mitochondriální (mtDNA) v jádru diploidní lidské buňky 22 párů chromozomů (autozomy) a pár pohlavních chromozomů X/Y (gonozomy) = karyotyp = soubor všech chromozomů v jádře b., zjišťuje se na základě cytogenetického barvení, kt. využívá různé barvitelnosti sekvencí bohatých na AT páry a GC páry nukleotidů hustota genů na jednotlivých chromozomech dost heterogenní - pouze ~ 10 % kódující sekvence - ~ 75 % se skládá z jedinečné (neopakující se) sekvence - zbytek repetitivní sekvence Lidský génom Repetitivní sekvence = DNA s vysokým množstvím kopií - se podílí na formování vyšších nukleoproteinových struktur, jako jsou telomery nebo centromery - při chromozómových přestavbách, mají vliv na regulaci genové exprese při procesu zvaném RNA interference, zajišťují ochranu konců lineárních chromozomů, řídí správný průběh mitotického i meiotického dělení buňky - zřejmě udržují strukturu chromozomů, možná jsou "evoluční" rezervou o o o o rozptýlené DNA transpozony (př. „Sleeping Beauty" - vektor pro genové terapie) retrotranspozony endogenní retro vity = LTR autonomní - LINE - LI-repetice neautomní - SINE - Alu-repetice Microsalellile or Short Tandem Repeal (STR) • Disperved ttraighcu! genaue • Core repeal length 2 - 7 bp ' Up IB ^repeats per locus • Döecttd by PCR »jnplificaüco Minisatellite or Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) • Coaaody wbteloroenc • Core repeal length t-10 bp •Vmibletoullenphof -0 5» JO kb ■ DrtecwJb) Saámtyišaám tandemové = za sebou jdoucí identické repetice, VNTR mikro satelity - opakování 1- 5 bp minisatelity - v rozsahu kilobazí, které se více vyskytují v subtelomerických oblastech chromozomů genetické markery ■ Lidský génom Huntingtonova chorea, fatální neurologické onemocnění s nástupem v dospělosti, projevující se jako demence s extrapyramidovou poruchou motoriky. V genu pro huntingtin je repetitivní sekvence (CAG)n, která kóduje úsek bílkoviny tvořený zbytky glutaminu (polyglutaminový úsek, polyglutamine tract). Za normálních okolností mají lidé méně než 20 trinukleotidů CAG a tedy i glutaminu v huntingtinu, kde tyto tvoří důležitou doménu pro interakce s jinými proteiny. Pokud se však mutací toto množství zvětší nad 30 glutaminu, protein nepracuje správně s výsledným progresivním odumíráním neuronů v nucleus caudatus. myotonické dytrofie (svalová dystrofie se svalovou slabostí provázenou paradoxně zvýšeným svalovým tonem) se nachází patologická expanze trinukleotidů CTG v 3' nepřekládané oblasti genu DMPK (dystrophia myotonica protein kinase). Mutantní mRNA má sama o sobě patogenní potenciál. i—i_A B^^^^^BH expanze trinukleotidových repetic autosomálně dominantní choroby Lidský génom ■tO 4rD l-rO i T 3 ^ s T t s a io 12 3 t 5 6 7 8 5 10 11 12 13 14 15 mtDNA • původ: alfaproteobakterie pohlcena eukaryotickou buňkou • mnoho genů během evoluce bylo z mtDNA horizontálně přeneseno do buněčného jádra (geny v jádře kódující různé mitochondriální proteiny silně připomínají bakteriální proteiny) ~ 16,5 tisíce bp kóduje 37 genů o 24 genů pro různou nekódující RNA o 13 genů kóduje vlastní mitochondriální polypeptidy zapojené v mitochondriálních procesech (využívány během oxidatívni fosforylace) maternální dědičnost genetické analýzy: na základě mtDNA určena migrace lidstva - „mitochondriální Eva", která žila ~ před 140 000 lety v místech dnešní Etiopie, Keni nebo Tanzanie Control |rag ion Obsah přednášky • Struktura lidského genomu • Reakce lidského genomu na vlivy prostředí. Exonové, intronové a promotorové mutace. • Monogenní a polygenní choroby a vztah multigenních nemocí a prostředí. • Genetické studie a klinická genetika. Evoluční biologie výběr neboli selekci (přírodní, pohlavní, rodičovský, umělý) migraci neboli genový tok evoluční tahy (mutační, reparační, molekulární - těmi se rozšiřuje tzv. sobecká DNA, tj. zpravidla vysoce repetitivní nekódující DNA v genomu eukaryotických organismů) příbuzenské křížení (inbreeding) genetický drift (posun) = náhodné posuny ve frekvenci jednotlivých alel populaci, které nejsou způsobené přirozeným výběrem, důvodem vzniku j nesoulad mezi teoretickou kombinovatelností a praktickou může evoluci urychlovat i zpomalovat (hod kostkou) Genetická uniformita O'Brien SJ, Wildt DE, Goldman D, Merril CR, Bush M. The cheetah is depauperate in genetic variation. Science.1983 Jul 29;221(4609):459-62. • A sample of 55 South African cheetahs (Acinonyx jubatus jubatus) from two geographically isolated populations in South Africa were found to be genetically monomorphic at each of 47 allozyme (allelic isozyme) loci. Two-dimensional gel electrophoresis of 155 abundant soluble proteins from cheetah fibroblasts also revealed a low frequency of polymorphism (average heterozygosity, 0.013). Both estimates are dramatically lower than levels of variation reported in other cats and mammals in general. The extreme monomorphism may be a consequence of a demographic contraction of the cheetah (a population bottleneck) in association with a reduced rate of increase in the recent natural history of this endangered species. Populační genetika Hardy-Weinbergův zákon p2 + 2pq + q2 = 1 Godfrey Hardy Wilhelm Weinberg Umožňuje odhadnout frekvence a lei v populaci, když známe frekvence genotypů a naopak. p ...... frekvence alely A q ...... frekvence alely a p2 ...... frekvence genotypu AA q2 ...... frekvence genotypu aa 2pq...... frekvence genotypu Aa Grafické znázornění Hardy-Weinbergova zákona 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 Allele frequency (p) H-W zákon ukazuje, že se v případě ideální populace z generace na generaci nemění frekvence alel v populaci. Populační genetika H-W zákon platí za následujících předpokladů: • efektivně nekonečně velká populace • náhodné křížení mezi jedinci (panmiktická populace) • všichni jedinci stejnou fitness • populace je homogenní, tzn. frekvence alel stejné v různých místech populace • nulový model = ukazuje jak budou vypadat frekvence alel a genotypů v případě nekonečně velké panmiktické populace, na kterou nepůsobí žádné evoluční síly jako jsou drift, migrace nebo selekce Populační genetika • H-W rovnováha nevypovídá mnoho o daleké historii populace, protože může nastat již po jedné generaci náhodného křížení. • Panmiktická populace je mendelistická populace, ve které se dva genotypy párují s takou frekvencí (pravděpodobností), v jaké frekvenci se oba genotypy nachází v populaci. • Příklad: genotypové frekvence AA25%, Aa 50% a aa 25% —► Pravděpodobnost, že AAse spáruje s Aa je 0,25 0,5 = 0,125 (12,5%) Vliv prostředí na lidský genom Genetická výbava jedince je sice osudově zadána v okamžiku zplození, ale není pro další život konečná, protože v průběhu života se může měnit jak pod vlivem četných faktorů epigenetických (vlivy prostředí), tak pod vlivem dalších faktorů genetických (např. mutacemi somatických buněk v průběhu maligní transformace). Biologické mutageny: onkogenní viry: adenoviry, herpes viry, virus Epsteina-Barrové, Rousův sarkomální virus a Rauscherův virus leukémie Fyzikální mutageny: záření (rentgenové, gama, U V - tvorba thymidinových dimerů) Chemické mutageny: organické, alky lační činidla (ATB), anorganické látky, alkaloidy, kationty těžkých kovů, peroxidy, dusitany, aromatické chlorované deriváty, volné radikály (O) Genes Environment Genetická proměnlivost je zdrojem individuální variability (vytváří se nové kombinace alel): - segregace alel při vzniku gamet - rekombinace při crossing-overu - vznik náhodných kombinací alel při oplození Mutace procesy, při kterých se mění počet alel (mění se kvalita a kvantita genů) mutageneze = proces vzniku mutací • mutace = náhodné změny genotypu, změna genetické informace, poměrně vzácné Typy mutací (indukované nebo spontánní, ty mají četnost -10 7, oprava polymerázou a proteinem p53): Genové mutace Chromozómové mutace = aberace Genomové mutace Vzácné mutace a polymorfismus vzácné mutace - jsou výrazně patologické a tudíž jsou z populace odstraňovány selekcí, nebo vznikly nedávno a nestačily se v populaci rozšířit), vyskytuje se v populaci méně než v 1 % polymorfismus - častá mutace, tyto mutace jsou základem interindividuální variability jedinců, v jediném genu je často mnoho polymorfizmů, jejich kombinace tvoří haplotypy, vyskytuje se v populaci více než v 1 % - SNP = jednonukleotidový polymorfismus - bialelické - mi ii isatelitn í a mikrosatelitní polymorfismy - multialelické Germinativní a somatická mutace germinativní mutace - přenášeny na potomstvo (často příčinou zániku plodu), u potomka přítomny ve všech buňkách, mají vliv na vývoj druhu, „úspěšnost" germinativní mutace 1:100000 somatické mutace - vznikají v somatických buňkách v průběhu života (maligní transformace x žádný fyziologický vliv) Polymorfismus alkoholdehydrogenáza (ADH) a aldehyddehydrogenáza (ALDH) - mají mnoho polymorfních forem napříč lidskými rasami. isoformy vykazují rozdíly v aktivitě a rychlosti zpracování a odbourávání substrátu nositelé určitých kombinací funkčních variant více náchylní k propadnutí alkoholizmu než jedinci s jinými kombinacemi alelová kombinace, která může svého nositele uchránit před závislostí, se zdá být ADH1B*2 a ALDH2*2 (Chen a kol., 2008). ADH1B*1 převládá u kavkazské populace a populace severoamerických indiánů ADH1B*2 u obyvatelů východní asie ADH1B*3 se pak hojně vyskytuje u černošské populace ADH1C*1 převládá u východoasijské populace, zatímco u kavkazské a u amerických indiánů je přibližně stejně distribuována jako alela ADH1C*2 Významnou alelickou variantou je ALDH2*2 se záměnou kyseliny glutamové na pozici 487 za lysin (SNP G>A). Zatímco ve východoasijské populaci je jeho četnost mezi 16-24%, u ostatních se objevuje jenom zřídka. Varianta ALDH2*2 odbourává acetaldehyd pomalu a tím tyto účinky prodlužuje. Genové mutace • mění j ednotlivé geny (alely), většinou j sou indukované • podstata je molekulární, mění se struktura DNA, ale nenarušuje se celistvost stavby chromozomu • v somatických nebo v pohlavních buňkách • mutace v regulačních genech pro množení a diferenciaci—^nádorového onemocnění • bodové mutace - substituce = záměna páru nukleotidu za jiný (—>změna AA sekvence, změna v regulaci, ovlivnění transkripce a translace... nebo tvorba STOP kodonu), transverze/tranzice, spíše v exonech • posunové mutace - delece/inzerce = ztráta/zařazení nukleotidů (zmožný posun čtecího rámce), spíše v intronech Genové mutace Srpkovitá anemie • missense mutace (transverze T>A) genu pro hemoglobin na 6. pozici v B-řetězci (hydrofóbní valin místo hydrofilní glutamové kyseliny, tvorba shluků Hb a tím změna tvaru ery) —► HbS • autosomálně recesivní ancestral mutant DNA -CTC- -CAC- mRNA -GAG- -GUG- AA -glu- -val- • Srpkovité červené krvinky mnohem hůř přenášejí kyslík. Lidé se srpkovitou anémií mají proto ve srovnání s obyčejnými lidmi červených krvinek víc. To jim dává proti malárii velkou výhodu, díky níž mají lepší šanci přežít. Genové mutace P° thalasemie • nonsense mutace pro Hb - chybná syntéza jednoho z řetězců globinu • autozomálně recesivní ancestral mutant DNA -AGT- -ACT- mRNA -UCA- -UGA- AA -ser- -STOP Huntingtonova choroba trinukleotidová expanze ancestral mutant DNA ...TAC-GTC-... ... TAC-(GTC-GTC-GTC)20-GTC-... mRNA ...-AUG-CAG-... ... - AUG-(CAG-CAG-CAG)20-CAG-... AA ...-met-gin-... ... -met-(gln-gln-gln)20-gln-... Genové mutace Hemofílie A = nedostatek srážecího faktoru VIII • inzerce 3000 bp - snížení tvorby proteinu • gonozomálně recesivní - vazba na X chromozom • žena j e přenašečka Genová mutace Cystická fíbróza • deleční mutací genu produkujícího protein CFTR (chloridový ABC transportér na buň. membráně) —► nefunkční protein • delece 3 bp v pozici 1652 až 1655 v exonu 10 (delece phe v kodonu 508) • autozomálně recesivní Normal CFTR Channel Outside cell Mucus Mutant CFTR Channel ancestral mutant DNA -TAG-AAA-CCA- -TAA-CCA- mRNA -AUC-UUU-GGU- -AUU-GGU- AA -ile-phe-gly- -ile-gly- Genová mutace Duchennova svalová dystrofíe • „frameshift" mutace = posun čtecího rámce v genu pro protein dystrofin • gonozomálně recesivní - vazba na X chromozom ancestral mutant DNA -CAC-TGT -CAC-TTG-T..- mRNA -GUG-ACA- -GUG-AAC-U..- AA -val-thr- -val-gly- Extracellular matrix Chromozómové mutace - aberace • nemění strukturu samotných genů, ale mění strukturu chromozomů. • dají pozorovat ve světelném mikroskopu • mohou být překážkou normálního průběhu meiózy a jimi postižené gamety mohou být sterilní nebo mohou po splynutí vznikat neživota schopné zygoty. Strukturní chromozómové aberace • následkem chromozómových zlomů, na které navazuje určitá přestavba. Primární je tedy porucha struktury, přičemž původní množství genetického materiálu může - ale nemusí - být zachováno. Dělíme je na balancované (kdy je zachováno původní množství genetického materiálu) a nebalancované (kdy část genetického materiálu chybí či přebývá). • defícience = ztráta koncové části chromozomu, oddělený kousek se rozpadne v cytoplazmě, dochází ke ztrátě genů, ztráta důležitých genů vede ke smrti • delece = ztráta vnitřní části chromozomu. • duplikace = zdvojení některých částí chromozomů • inverze = převrácení části chromozomu o 180° • translokace = přesun části chromozomu na jiný chromozom, může vést k vytvoření nového znaku fragmentace = rozpad na malé části Genomové mutace Numerické chromozómové aberace • způsobeny abnormálním počtem chromozomů v karyotypu struktura chromozomů je neporušená, patologicky se uplatňuje nestandardní množství genů • vznikají díky chybě při rozchodu chromozomů do dceřiných buněk během buněčného dělení (nondisjunkce) nebo abnormalitami fertilizace či časné embryogenéze • aneuplodie - numerická odchylka se týká pouze určitého chromozomu nebo chromozomů, ne však celé sady. Konkrétní chromozom může být buď znásoben - trisomie (3x - tři kopie chromozomu), tetrasomie (4x - čtyři kopie chromozomu), nebo naopak ztracen -monosomie (lx - jedna kopie chromozomu), nulisomie (Ox - žádná kopie chromozomu) Polyploidie - znásobena je celá chromozómová sada - porucha rozdělení celých sad nebo oplození spermiemi (dispermie]), u člověka přichází v úvahu zejména triploidie (3n = 69 chromozomů) a tetraploidie (4n = 92 chromozomů), většinou ale: • těhotenství je potraceno • zásněť hroznová (mola hydatidosa) je edématózní hroznovitý útvar vznikající v děloze patologickým bujením embryonálního trofoblastu Genomové mutace Aneuploidie (změna počtu chromozomů v sadě) o monosomie • gonozomální - Turnérův sy. (45, XO) o trisomie • autozomální - Downův sy. (47, XX/XY + 21) - Edwardsův sy. (47, XX/XY +18) - Patauův sy. (47, XX/XY +13) • gonozomální - Klinefelterův sy. (47, XXY - XXX sy. - XYY sy. Short stature Low hairline Shield-shaped thorax Widely spaced nipples Shortened metacarpal IV Small finger nails — Brown spots (nevl) Characteristic facial features Fold of skin Constriction of aorta Poor breast development Elbow deformity Rudimentary ovaries Gonadal streak (underdeveloped gonadal structures) No menstruation Obsah přednášky • Struktura lidského genomu • Reakce lidského genomu na vlivy prostředí. Exonové, intronové a promotorové mutace. • Monogenní a polygenní choroby a vztah multigenních nemocí a prostředí. • Genetické studie a klinická genetika. Monogenní nemoci • Rozvoj molekulárně biologických metod umožnil detailní analýzu genetického podkladu mnoha mendelisticky děděných, tzv. monogenních nemocí. • U těchto chorob se dědičný podklad uplatňuje jako velký faktor, tj. je přítomen prakticky u všech nemocných a jedná se prokazatelně o faktor příčinný (např. defekty v dystrofinovém genu u muskulárních dystrofií), k němuž se přidávají jen jako přídatné další faktory genetické i faktory zevního prostředí. Příčinou těchto nemocí bývají především tzv. vzácné alely. • je determinována alelami v jednom lokusu • variantní alela, která vznikla mutací někdy v nedávné nebo vzdálené minulosti a je většinou relativně málo častá, nahrazuje původní „divokou" alelu na jednom nebo obou chromozomech • mají charakteristický způsob přenosu v rodinách Monogenní nemoci • choroby dětského věku • méně než 10% z nich se manifestuje po pubertě a pouhé 1% se objeví po skončení reprodukčního věku • často výrazně patologické • V populační studii na 1 milionu živě narozených dětí byla incidence vážných monogenních chorob odhadnuta na 0,36 %, u 6-8 % hospitalizovaných dětí se uvažuje o monogenních chorobách. • doposud známé shrnuje OMIM (On-line Mendelian Inheritance in Man) -6000 klinicky významných fenotypu • čtyři základní typy dědičnosti: dominantní recesivní autosomální autosomálně dominantní (AD) autosomálně recesivní (AR) X-vázaný X-dominantní (XD) X-recesivní (XR) Monogenní nemoci typy přenosu - autozomální • geny na obou autozomech aktivní - gonozomální (X-chromozom vázané) • muži hemizygotní • u žen 1 X-chromozom inaktivován! - jiné • imprinting, mozaicizmus, ... Pedigree -fó O ô m mo Kay podle projevu genotypu ve fenotypu - recesivní • nemoc jen u mutovaného homozygota - dominantní • nemoc stejná u heterozygota a mutovaného homozygota - neúplně dominantní • odstupňovaná tíže nemoci u heterozygota a mutovaného homozygota - ko dominantní • jak normální tak patologická alela jsou vyjádřeny ve fenotypu I I male ^ alfected male deceased male Q female 0 affected ternalejJJÍ'deceased teinale Monogenní nemoci - AR • u heterozygotů s 1 mutovanou alelou stačí produkt k udržení normální funkce • manifestní onemocnění u heterozygota je důsledkem: • haploinsuficience - pro normální funkci je potřeba >50% aktivního genového produktu • dominantě negativního efektu - syntéza abnormálního proteinu, který "soutěží" s normálním a ovlivňuje fenotyp (např. osteogenesis imperfecta) • zesílení funkce ("gain-of-function") - mutací je posílena přirozená vlastnost proteinu • ztráty heterozygozity (loss-of-heterozigosity, LOH) v somatické buňce - např. familiární predispozice k nádorům v důsledku mutací v supresorových genech (např. retinoblastom) • velmi často enzymové defekty postižen je mutovaný homozygot (popř. sourozenci), heterozygotní rodiče jsou přenašeči (asymptomatičtí) - riziko 0.50 x 0.50 = 0.25 • frekvence přenašečů nemoci v populaci »> frekvence nemocných nejčastější AR nemocí u bělochů je cystická fibróza (f nemocných 1/2000, f přenašečů 1/22) • konsanguinita (příbuzní rodiče) a geneticky izolované populace (např. Aškenazi židé - Tay-Sachsova choroba) Monogenní nemoci - AD • nemoci j sou důsledkem j ak mutací přenášených mezi generacemi tak vzniklých nově • nemoc se projevuje v každé generaci - postižený jedinec má postiženého rodiče (a prarodiče), a to matku nebo otce • riziko pro potomka 0.50 (pokud by byli oba rodiče postižení pak 0.75, ale to je vzácné) • familiární hypercholesterolemie (1/500), • myotonická svalová dystrofie (1/1000) • Huntingtonova chorea (1/3000) Monogenní nemoci - X-vázané • ženy 3 genotypy, muži pouze 2 X-vázané nemoci se manifestují u všech mužů, kteří zdědili mutaci, a pouze u homozygotních žen • hemofílie A • Duchenneova muskulární dystrofie • Wiskott-Aldrichův syndrom (imunodeficience) • existují rozdíly v genové expresi mezi alelami, které se nacházejí na chromosomech, zděděných od otce a od matky - jsou důsledkem genomového imprintingu (metylace chromatinu, různý metylační vzor na chromosomu mateřského a otcovského původu, dochází k ovlivnění exprese genů, nedochází ke změně sekvence DNA) Monogenní nemoci - X-vázané inaktivace X-chromozomu u žen - kompenzace dávky a exprese X-vázaných genů - hypotéza Lyonové ("lyonizace") • v somatických b. je 1 X inaktivovaný a v interfázi se zobrazuje jako "Barrovo" tělísko (viz sporné identifikace pohlaví) • proces je náhodný, může se týkat jak otcovského tak mateřského X - "manifestující přenašečka" - u heterozygotních žen je důsledkem buněčný mozaicismus (př. X-vázaná anhidrotická ektodermální dysplazie'-chybí potní žlázy). Pokud žena je heterozygotní pro některou X- vázanou recesivně dědičnou chorobu, může se tato choroba u ní klinicky projevit. Porucha tam, kde zůstal aktivní defektní X chromozom Časné stadium děleni Náhodná inaktivace chromozomu X Dospelá žena - mozaika Obrázek 5.16 Hypotéza Lyonové o náhodné inaktivaci X chromozomu v ženských somatických buňkách. Xf = pater-nálnč zdéděný chromozom X, Xm = matcrnálné zdédénv chromozom X. šedé nebo červené ovály představuji tělíska Barrové, vytvořená z. inaktivovaného patemálního, respektive maternálnlho chromozomu. Dospělé tkané (dole) jsou mozaikou populaci klonů, exprimujicich alely buď z Xp, nebo z \m. (Upraveno podle Kosenberga LE Inborn errors of metabolism, z Bondy PK, Rosenberg I.E fed.) Metabolic control and disease, 8. vyd., WB Saunders 1<80, Philadelphia, s. 73-102.) Komplexní nemoci • multifaktoriální, multigenní • roli hrají kombinace určitých genů a určitých faktoru zevního prostředí • Na odhalení nej obecnej š ich principů genetiky multifaktoriálních nemocí se na rozdíl od genetiky nemocí mendelistických v současné době stále ještě čeká. • v klinické praxi často kolísa názor na výsledky genetických studií, které se snaží odhalit genetický podklad komplexních nemocí, od neodůvodněného očekávání nad nalezenými geny velkého účinku až po velkou skepsi vzhledem k existenci genetického podkladu v populaci četných nemocí ( nad 1%), jako je v kardiológii např. esenciální hypertenze. pokud choroba má prokazatelně familiární výskyt, musíme očekávat podíl genetického podkladu na její manifestaci, a to i v tom případě, že není dosud dobře definován nebo dosavadní znalost nepovažujeme za přesvědčivou. Své genetické pozadí mají i tak relativně vzdálené proximální fenotypy, jako je např. kvalita života u nemocných s chronickým kardiovaskulárním onemocněním. Každá choroba má nějaké genetické pozadí, jehož podíl na manifestaci dané choroby je různý. Komplexní nemoci komplexní onemocnění jsou charakterizována: - neúplnou penetrancí patologického fenotypu • u určité části osob, přestože zdědí nevýhodný genotyp (zde ve smyslu souboru vícero genů) se patologický fenotyp nerozvine - existencí fenokopií • patologický fenotyp může být přítomen u lidí, kteří nejsou nosiči zmíněného genotypu - genetickou heterogenitou (lokusovou a alelickou) • klinický obraz není specifický, ale může se rozvinout v důsledku záměn v genech ležících na různých lokusech (= lokusová heterogenita), v jednotlivých genech může být přitom vícero mutací či polymorfizmu (= alelická heterogenita) - polygenní dědičností • predispozice k rozvoji patologického fenotypu se zvyšuje pouze při simultánním výskytu určitého souboru alel - vysokou populační frekvencí alel zodpovědných za rozvoj patologického fenotypu • každá jednotlivá predisponující alela pravděpodobně není sama o sobě výrazně patogenní - spolupůsobením dalších mechanizmů přenosu • mitochondriální dědičnost, imprinting Komplexní choroby choroby, na jejichž vzniku a progresi se podílí „komplex" genetických, epigenetických a vnějších faktoru - fenotyp nevykazuje klasickou mendelistickou dominantní či recesivní dědičnost jako důsledek změn v jediném lokusu (tzv. jednolokusových) predisponuj ící "geny" zvyšují pravděpodobnost onemocnění, ale nedeterminuje jednoznačně jeho přítomnost - je nutné spolupůsobení negenetických faktorů (prostředí) • dieta, fyzická aktivita, kouření, .... - a interakcí genů mezi sebou nej častější komplexní nemoci - diabetes (1. i 2. typu) - dyslipidemie - esenciální hypertenze - alergie o c d) optimum NGT fyziologická populační variabilita riziko polygenní nebo monogenní porucha IGT glukóza (mmol/l) optimum (A O C fyziologická populační variabilita riziko polygenní porucha krevní tlak (mmHg) w o c ■H 4) >U optimum fyziologická populační variabilita riziko hypecholesterolemie polygenní porucha normolipidemie monogenm porucha Komplexní nemoci Obezita - Hypotéza typu „thrifty genotype" • V současné populaci jsou selektovány alely, které favorizují přírůstek váhy a skladování tuků, aby byl zajištěn dostatek živin pro častá období nedostatku potravy. • Při konstantně vysoké nabídce potravy a poklesu fyzické aktivity tato predispozice vede k pandemii obezity v rozvinutých zemích. Jednolokusové nemoci Komplexní nemoci Závažnost Obsah přednášky • Struktura lidského genomu • Reakce lidského genomu na vlivy prostředí. Exonové, intronové a promotorové mutace. • Monogenní a polygenní choroby a vztah multigenních nemocí a prostředí. • Genetické studie a klinická genetika. Genetické studie Základní debata nad genetickým podkladem nemocí logicky začíná od strategie výběru tzv kandidátních genů. Tato otázka je podstatně jednodušší u mendelisticky děděných nemocí, kde se změněná funkce jednoho genu snadněji identifikuje. Celogenomové asociační studie (GWAS = Genome-Wide Association Study) vyhledávají polymorfismus jednotlivých nukleotidů nebo běžné genové variace, které se typicky chovají jako ukazatelé genových oblastí s malým efektem u stoupajícího rizika nemocí. Dalším významným momentem je výběr statistické metodologie, která zhodnotí sílu asociace genů s chorobami. Možnosti jsou v zásadě dvě: linkage (vazebná) analýza a asociační studie. K detekci specifických genetických oblastí a genů, které se účastní v transmisi nemoci, je v principu možné použít obě metody. Genetické studie Kandidátní geny • s intermediálním fenotypem • s klinickou manifestací nemoci • s klinickou závažností nemoci • s odpovídavostí nemoci na léčbu Linkage (vazebná) analýza • testuje kosegregaci genového markem a fenotypu nemoci v rodině. Cili marker a nemoc se v dané rodině mají vždy vyskytovat spolu. Genetické studie Asociační studie • vyšetřují souvýskyt markem a nemoci na populační úrovni, tj. u nepříbuzných jedinců, obvykle srovnáním frekvencí markem u nepříbuzných nemocných a kontrolních subjektů (studie case-control). • Statistickou sílu asociace je možno dále zvýšit obohacením o další kritéria, jako jsou klinické subtypy nemoci (studie case-case), závažnost nemoci, časný začátek nemoci, rizikové faktory pro nemoc včetně pohlaví a vhodné biologické znaky (např. plasmatické hladiny cytokinů při asociaci genetických polymorfismů v cytokinových genech; studie genotyp-fenotyp). Klinická genetika zabývá se diagnostikou, léčením a prevencí genetických nemocí genetické poradenství vrozené vývojové vady - poruchy utváření orgánů, které vznikly v období nitroděložního života, i poruchy funkční (např. duševní opoždění) a poruchy na úrovni biochemické a molekulární (např. vrozené vady metabolismu). Skupina Příčina Zastoupení Primárně (geneticky) chromozomální aberace 10 % monogenní dědičnost 20 % Sekundárně (prostředí) léky, infekce, záření 5 % porodní poranění 12 % infekce po narození 7 % Neznámé (multifaktoriální) geny + prostředí 46 % Klinická genetika Prenatální diagnostika • zahrnuje vyšetřovací postupy směřující k vyhledávání statisticky významné odchylky ve struktuře nebo funkci, která přesahuje hranice fenotypové variability umožňuje v závažných případech ukončení gravidity, u dalších je možno v předstihu plánovat optimální perinatální péči. Rizikové faktory: • věk matky v době porodu je vyšší jak 35 let Součet věku rodičů nad 70 let • pozitivní biochemický screening z krve matky ultrazvukový nález, který zvyšuje riziko přítomnosti chromozomální aberace (nahromadění tekutiny v podkoží, nepřítomnost nosní kůstky, srdeční vada plodu aj.) • přítomnost chromozomální aberace v rodině Klinická genetika Vyšetření karyotypu plodu • invazivní metody - amniocentéza, biopsie choriových klků, kordocentéza genetické vyšetření, přesněji vyšetření cytogenetické (neboť se vyšetřují chromozomy), ovšem nejedná se o test DNA FISH - fluoresceční hybridizace in situ • vazba denaturované sDNA se specifickou sondou AmnioPCR je moderní metoda sloužící ke genetickému vyšetření plodu. • porovnání DNA markem matky i plodu —► stanovení početu jednotlivých chromozomů u plodu. • výsledek je následně potvrzen klasickým cytogenetickým vyšetřením • K dispozici je v současné době vyšetření 21. chromozomu -amnioPCR, nebo sada vyšetřující chromozomy 13,18, 21, X a Y- tzv. multiamnioPCR. ih( J) nu )| MHU II )t N ! I) /ill il II i! II >l II Odběr plodové vody Amniocentéza Plodová voda Ultrazvukový snímač Klinická genetika Stanovení pohlaví plodu • volné fetální DNA kolující v krvi matky neinvazivní s přesností -98 % od 10. týdne těhotenství • DNA plodu z venózní krve matky • z klinického hlediska je určení pohlaví plodu důležité v případě rizika nějaké genetické choroby vázané na určité pohlaví (např. hemofílie). Preimplantační diagnostika metodu časné prenatální diagnostiky, která je vázána na techniky umělého oplodnění. Za účelem minimalizace chyby genetického vyšetření je třeba k oplozování vajíček použít metody intracytoplazmatické injekce spermie buňky pro genetické vyšetření jsou odebírány z embrya nejčastěji ve stadiu 8 buněk nebo blastocysty Postnatální diagnostika např. trombofilie , cystická fibróza... Klinická genetika Trombofilie • vrozený sklon ke zvýšenému srážení krve • může být v některých případech pro své nositele výhodná (omezení ztrát krve při poranění) • i příčinou různých komplikací v těhotenství, při dlouhodobém znehybnení nebo při užívání některých léků může způsobit hlubokou trombózu či plieni embólii genetické vyšetření u: gravidních, před začátkem užívání hormonální antikoncepce, před chirurgickým zákrokem Leidenská mutace - mutace genu pro inhibitor koagulace faktor V - riziko trombembolie -30 %, genová mutace rs6025 G1691A, R506Q (arg^gln), AD Defekt antitrombinu (FII) - mutace koagulačního faktoru II zvyšujícího hladinu protrombinu - riziko trombembolie -70 - 90 %, genová mutace rs 1799963 G20210A Hyperhomocysteinemie - mutace enzymu konvertuj ícího kyselinu listovou -metyltetrahydrofolátreduktáza (MTHFR) - projeví při nedostatku vitaminů B6, B12 a kyseliny listové, genová mutace rsl801133 C677T, AR Klinická genetika Cystická fíbróza • více než 30 mutací, které způsobují toto onemocnění důvody k vyšetření jsou: • podezření na klinické onemocnění • příbuzenský vztah rodičů • opakované potraty • léčená neplodnost