Cystická fibróza Molekulární postata choroby porucha v transportu iontů chlóru, sodíku a vody přes apikální membránu specializovaných epiteliálních buněk chloridový kanál regulující transport iontů přes buněčnou membránu C7B •Tvořen 5ti doménami: 2 membrane spanning domains 2 nucleotide binding domains 1 regulatory domain CFTR exprese ve všech tkáních (vyjma nervové) l multiotgánové onemocnění Organs Affected by Cystic Fibrosis The genetic defect underlying cystic fibrosis disrupts Hie functioning of several organs by causing ducts or other tubes to become clogged, usually be thick, sticky mucus or other secretions. AIRWAYS Clogging and infection of bronchial passages impede breathing. The infections progressively destroy the lungs. Lung disease accounts for most deaths from cyslic fibrosis. LIVER Plugging of small bile ducts impedes digestion and disrupts liver function in perhaps 5% of patients. PANCREAS Occlusion of ducts prevents the pancreas from delivering critical digestive enzymes to the bowel in 65% of patients. Diabetes can result as well. SHALL INTESTINE Obstruction of the gut by thick stool necessitates surgery in about 10% of newborns. .REPRODUCTIVE TRACT /^hsence of fine duds, such as ttie the vas deferans, renders 95% of males infertile. Occasionally, women are made infertile by a dense plug of mucus ttiat blocks sperm from entering the uterus. SKIN Malfunctioning of sweat glands causes perspiration to contain excessive salt (NaCI). Measurement of chloride in sweat is a mainstay of diagnosis. CF plíce — molekulární podstata Plíce CF pancreas — molekulární podstata Pankreas CF potní Žlázy — molekulární podstata Mucus clogs the jungs and leads to chronic respiratory InFectJnfis. Mucus obstructs bhe ducts of the pancreas, preventing digestive enzymes from reacfang The tnJtesErw'B. Fertilita nemocných CF Muži •Sterilní v 95% •Porucha vývoje vas diferentia (CBVAD) epididymis a vesiculi seminalis Semenonosnv ttibul Obstruktivníazoospermie může být zcela izolovaným příznakem Nej častější mutace asociované s CBVAD: 5T vatianta v intronu 8 Ni^ R117H Zeny 'Plodnost snížena pro viskozitu cervikálního hlenu •Častá primární nebo sekundární amenorrhea v důsledku poruch výživy a plicních změn Chromosome 7 CFgene 050 kb) 7 8 14*1517*18 23 ni i liHir i—H—(h- 450,910 11121314b1G17b 19 20 21 22 24 AAAAAAAA niRNA (6129 nucleotides) NH£ Glycosylate, foldBj, and membrane insertion THD-1 TMD-2 ]C00H Prutein [1480 amino acidsl □«■4**10 BQ ■ * DO'i 1 *■ ■aas rjurj o* i El' ISřŽ = tanf™?^ ^í"5 ™«« types NBF-1, NBF-2 = nucleofide^inding folds 4 = jn w de|e1jon . = mjssense R= regulatory domain * ^ * = nonseriSe ° = frame-shift ^ůJ™- , - Sp|jcjng error cell membrane cystic fibrosis transmembrane conductance regulator [CFRJ protein \m i k gen •lokalizován na chromozomu 7 (7q31) •250 kb dlouhý •27 exonů •cDNA sekvence dlouhá 6129 bp kóduje 1480 aminokyselin CFTR proteinu • 1500 CFTR mutací bylo nalezeno v CFTR genu (CFTR Mutation Table; http://www.genet.sickkids.on.ca./cftr-cgi-bin/FullTable • Většina z nich je raritní, „privátní" nebo jejich vztah k CF nebyl prokázán • pouze 7 mutací vyskytuje na více než 1% CF patologických alel • Je pozorováno široké rozpětí ve frekvenci jednotlivých mutací u různých populací • nejčastější mutatace F508del je detekována u cca 66% CF pacientů delece od 1 bp po kilobáze inzerce včetně duplikací jednobázové substitutce missense transverze nonsense tranzice splice site posunové (frameshift) v důsledku delecí, inzercí, poruch splicingu CFTRdele2,3(21kb) 4,64% G551D 4,03% N1303K 3,02 % G542X 2,22% 1898+lGtoA 2,02% 2143delT 1,21% R347P 0,81% W1282X 0,60% • 4374+lGtoA, 1717-lGtoA, R1162X, E92X, 2184insA, 3849+lOkb každá 0,4% • R334W, R553X, 621+lGtoT,........ každá 0,2% Normální CFTR Nucleus Endoplasmic Reticulum Golgi Apparatus Cell Membrane •CFTR gen - přepsán (transkribce) do messenger RNA • mRNA CFTR - přeložena (translace) do proteinu •CFTR protein - postranslační modifikace (glycosylace) •CFTR maturovaný protein - umístěn v buněčné membráně 81 CF mutace: třída I Nucleus Endoplasmic Reticulum TrUllidlLrl mRNA Golgi Apparatus CFTR gen - stop kodón \zkrácená , nefunkční messenger RNA CF mutace: třída II Nucleus Endoplasmic Reticulum Golgi Apparatus Cell Membrane "n-1 •CFTR gen - přepsán (transkribce) do messenger RNA » mRNA CFTR - přeložena (translace) do proteinu mutace F508del dává CFTR nesprávný tvar (^gradován proteolýzou CF mutace: třída III Nucleus Endoplasmic Reticulum Golgi Apparatus Cell Membrane •CFTR gen - přepsán (transkribce) do messenger RNA » mRNA CFTR - přeložena (translace) do proteinu •CFTR protein - postranslační modifikace (glycosylace) •CFTR maturovaný protein - umístěn v buněčné membráně mutace G551D — nefukční NBD1 doména CF mutace: třída IV chromo Nucleus .RJJ7P } Endoplasmic Reticulum Golgi Apparatus n rnp c'Iviitii--I CFTR gen - přepsán (transkribce) do messenger RNA mRNA CFTR - přeložena (translace) do proteinu CFTR protein - postranslační modifikace (glycosylace) CFTR maturovaný protein - umístěn v buněčné membráně mutace R347P - snižuje chloridovou konduktanci CF mutace: třída V Nucleus Endoplasmic Reticulum Golgi Apparatus CFTR gen - sestřihová mutace hkst mRNAs defektní snížené množství CFTR proteinu mutace 3849+lOkb setřihová (splicing) mutace ■itfodw* raüiAitiwi ní oihwiwi dwvti X H -X- ciw! iv dPírMHj ;nnrl...rlnnr.:- ir1i7h.éw7r [>n5jh| l33*í4l0t*OT) Clon HI IG55ID) Cbu I ddnttn** p--c4rvr- Enduptir-T'-: ■■■■ í ..li- Clou II ■an-Kľirnl procmJng/li^Scki-ig r i I 196 sekvenčních variací v genu CFTR Poly-T alelické varianty (Tn) v intronu 8 genu CFTR konfigurace polypyrimidinového traktu: 9 tymidinů - účinné akceptorové místo sestřihu 7 tymidinů - účinné akceptorové místo sestřihu __5 tymidinů - neúčinné akceptorové místo sestřihu chybí exon 8 u 90% syntetizovaného CFTR chybná funkce CFTR 5T alela považována 2a mutaci asociavanou s širokým spektrem příznaků Zena: zdravá -----------------atypická CF -------typická CF Muž: CBVAD------------------#typická CF -----------typ-kkáCF í absence vas A • 5T vatianta v intrv IVS8 • R117H • 10,11,12 TG vIVS8 Kaskádovitá*4 strategie rutinní molekulárně genetické diagnostiky CF suspektní CF pacient nebo přenašeČ Proužky značené 95,98 jsou 95- a 98-párŮ bazí dlouhé PCR produkty Proužky značené H jsou heteroduplexy formované chybné spárovanými jednořetězciDNA (95/98 a 98/95) 1. non dF508 / non dF508 2. dF508 / dF508 3. dF508 / non dF508 4. marker pBR322/Alul delece ďínukleotidů CTTv CFexonulO ztráta jedné aminokyseliny — fenylalaninu v pozici 508 v CFTR proteinu Detek ELFO: 5%*PAGE, 200 V, 20°C, 2hours Polyacrylamidová gelová elektroforéza duplex PCR produktu: Primery 2,3F a 2,3R -ohraničují deleční bod zlomu L amplifikace 207bp dlouhého produktu p řítomno s t l^^c e Kontrolní primery 3i-5 a 3i-3 amplifikace 309bp dlouhého produktu obsahujícího exon 3 nepřítomnost delece 1. CFTRdele2,3(21kb) / non 2. wt 3. CFTRdele2,3(21kb) / non Duplex PCR zajišťuje in terní amph'fikat ní kon trolu a umožňuje rozlišit mezi homozygtem a heterozygotem pro deleci rychlý bezpečný snadno interpretovatelný Princip detekce mutací na přístroji Light Cycler PCR: primer F,R hybridizace: donor, akceptor proby v '.'iľllíiillllllllh " iiiiiiiiiniiHiiiii konec elongace I CFTRdele2,3(21kb) G542X i G551D I R553X Li9htCycler jedno ho testovaného jedince nej častěj ších CF mutací e detekováno za 1 hodi nu Detekce mutací G542X, G551D a R553X PCR: jeden pár primerů Analýza bodu tání: dva systémy prob Fluorescenční monitoring G551D/R553X lokusu ace CFTRdele253(21kb) PCR jeden F primer dva specifické R primery Analýza bodu tán dva systémy prob Fluorescenční analýza lokusu s delecí fluorescein Primer Position: 38 200 Primer Position: 37 £ breakpoint 1 Fluorescein Primer Position: 59 154 Anchor probe | | Mutation wt wt CFTRdele2,3(21kb)/non wt wt J^-DNA 1 Primer Position: 37 f Alela bez delece - wt deletion2,3(21kb) Alela s delecí - mt Fluorescenční analýza lokusu bez delece Temperature CC) Alkaline Phosphatase Chromogen (NBT/BCIP) Streptavidin Nitrocellulose Stl (* DNA-prob* )0 Amplified i target 19 a 17 CF mutatci a jejich wild-type sekvence polymorfni Tn misto(intron 8) asociovane s CBVAD -ä. E1 CD 00 CO CO CD 0 im 5 T3 W < CO £ CO „ ^ S 00 CO i— t— .,— CM < CM CM IN NO-Li PA Reverse hybridization ptrincipI Alkuine Phosphataw Chromogŕn (NBT/BCIP) Strpptavidin Jeden vzorek Jedna amplifikace Nitrocellulose Dva stripy Výsledek multihybridizace do 3 hodin po amplifikaci I YICVY I UUli I ICI|J l£j Samples Plot ■■T File Edit View Tools Alleles Help IüIyL *® ta Suiple Kit Sample Name SQO OS Plat Setting: |Microsatellite Default v| |j Panes: |2 v| |H|Q|_iit |AM| |B|ÄIUa| ItUitf , CFEU2_2010-«»-29_F«7_S3(l_l«A.ffi |S361_1(IA ICFEU2 A rdi PORT maonjiJDDm] ay syQ&affl--0yay ess-BBBEyfflyBBy B aaya 200 300 400 500 Ü7T iOSdsl WT si 146.08 67.49 sr31j)8 0+37 08 CFEU2_2010-«»-29_A»9_SJ61_10Bjffi !S3611(IB | CFEU2 B imLc EHBBBBB BB] B B QQ BE EBB yBBQ BB BB BBQE BBBBB y B 030303 BEB ■ 200 300 400 500 < © Samples Plot 0@® 111 k í H4I Sample Hie Faid SQO os !sq 1 '-1- File Edit View Tools Alleles Help Plot Setting: Micro satellite Default Panes: 2 |©(ÜImJ lil* i CFEUÍ_2«l|i-l(i-ll_GIiJ_lííi_l«Aďfi CFEU2 Aiiiľc P0P7 □ Ii n^nroroCTTTO BS B BBfta^SBBB BBE-BBBE3BBBBB00 B BBQEE B B B B E] slTT OSdelM T sz 1+8.43 3.39 .59 ar 11129 es3 9 ta 1148 ss sl41-CFDel2_3 SE43J.S3 ar 23Í40 ht 2117 CFEU2 201(11U U HUT 199i UBďíi CFEU2 Jtimx ■ EEBEBBB BEI B B BSBBEBB 0SBB BBBB BBQQB BEBB0 B B B3QBQB B B B B < [X 214.79 Y3104] [Peak: Data Point 5220 Size 437.63 Height 2117 Allele 41-CFDel2_3] [Bin: 13-L20BW Marker L20BW] File Edit View Tools Alleles Help Plot Setting: Micro sate II it e Default - E ] iiojB u say ma i SQG OS SQ isg°l I CEEU2_2Cl(i It 11_C(J_S3ÍJ_l(iAf>4 IĽFEUÍ A Iiis P0P7 £ IFSUBdcl [3849+10Kb I |1078dclT J I CFEU2_2Cl(i It 1Í_D(T_S3ÍJ_1(B f>a |3849+10Kb~ □ |1677delIA " |1078delT " sz 145.21 htr5? 151.49 ht 67:; 2125 ht261 si 175.5'. iS1 ii n ss IPG .81 sr5299 PHSIVT Model 310 59/D2mht/u9F S13 Version 3.3 ABI-CE2 59/02mht/u8F Version 3.3.2 Lane 13 Signal G:140 A:162 T:1SS C:139 Page 1 of 2 DT310POP6{BDv3}v1-mob Tue, Apr 22. £003 9:36 Seq Mix v3 E Sat, Apr 19, 20O3 20:17 Points 1282 to 10200 Pk 1 Loc: 1282 Spacing: 12.19<12.19} CGGCGGAGTGAT TCCTO&GCTCTGGGCATGG ACCTGGC CACACTAGAGATCACAGCCC ACAATGAGCG CAAGCCCAAC CCGCCG 10 Z« 30 40 50 60 70 88 iCCAG GGCTGCTGAC CTGGCTCATG TCCATCGATG TCAAGTACCA GATCTGGAAG TTCGGGGTCA TCTTCACAGA CAACT 90 100 110 1Z0 130 1+0 150 160 fCCTTC CTGTACCTGG GCTGGTATAT GGTGATGTCC CTCTTGGGAC ACTACAACAA CTTCTTCTTT GCTGCCCATC TC 170 180 190 200 210 220 230 240 rCTGGACAT CGCCATGGGG GTCAAGACGC TGCGCACCAT CCTGTCCTCT GTCACCCACA ATGGGAAACA GCT 2 60 270 280 290 310 Analýza celé CFTR kódující sekvence a přilehlých oblastí racni c •rychlá analýza 23 CFTR exonů doplněná simplex DGGE analýzou zbylých exonů 'Sekvenace úseků se zachycenou sekvenční změnou DGGE mult Annealing Exon fragment! temperature (%) (°Q 1 451 n 7 40-80 55 -A7 365 6 10-60 50 • a) 'J516 2 25-75 55 «7. 283 4 10-60 50 i zm 362 4 30-80 60 Rodokmen rodiny P Pacient J.F. Detekována mutace dF508 na obou alelách genu CFTR Rodina M. Rodina E.,K • incidence : 1/10.000 novorozených chlapců • deficience koagulačního faktoru VIII • X-vázaná choroba Inverze v genu F8: najčastejší příčina hemofílie A Iii IV Prince Albert von Sachsen-Coburg-Gotha D Heinrich von Preussen O Alice Queen Victoria Ludwig v. Hessen ODO Irene Alexandra Frederick Nikolaus Jf Leopold Duke of Albany CH-D Beatrice Prince Heinrich von Battenberg O Alice / i $ jf./ / 3 g g čji in T- V K+ K- »49 -50 ».60 —> »«»19 ^.^44 « -45 ___*A -> g o K+ K-co o> o o K+ K- o> m o o K+ K m 2 os m CO T- ■* co o> del t c e JJiVXD kzoj ibBI Zkumavka 1 Pm 535 pb exon 3 410 pb exon 43 357 pb exon 13 238 pb exon 6 207 pb Zkumavka 3 exon 19 459 pb exon 8 360 pb exon 4 196 pb Zkumavka 2 exon 49 439 pb exon 50 271 pb exon 47 181 pb exon 60 139 pb exon 52 113 pb Zkumavka 4 exon 48 506 pb exon 44 426 pb exon 51 388 pb exon 45 307 pb exon 53 212 pb exon 42 155 pb MLPA A "Multiplex gene dosage analysis made easy" Poprvé popsána: Schouten JP et al. (2002) -Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Res. Jun 15;30(12):e57. detekce aberantních DNA sekvencí jednoduchým provede minimum pouze 20 ng DNA Lze analyzovat degradovanou DNA - extrahovanou z tkání v parafínových bločcích - extrahovanou z tkání ve formalínu - volnou fetální DNA získnou z maternální plasmy diskriminuje sekvence lišící se pouze v jednom nukleotidu determinuje metylační status promotrů detekce známých mutací a SNP děním na základě PCR reakce 1. Denaturace 2. Hvbridizace 3. Ligace 4. Amplifikace MLPA pf oby Hybridizace 1. MLPA probemix je přidán k denaturované genomické DNA 2. Dvě Části každé próby hybridizují k odpovídající sekvenci Duchennova svalová dvstrofíe Amplifíkace 4. Pár univerzálních primeríl je použit k amplifikaci všech ligovaných prób. AmplifikaČní produkt každé próby má unikátní délku (130 -480 bp) Duchennova svalová dystrofie i V í_L P A Separace a kvantifikace kapilární elektroforézou Každý pík je In amlifikační produkt II II specifické proby Vzorky jsou porovnávány BIMlIffl s kontrolním vzorkem ÉÉ _,-^--1 ■ ' 1 <í c JJJjLiIíJ ^-,_,-- 20 li li Llii -1—' 1 '—^—H Rozdíl v relativní výšce nebo ploše píku III v cílové sekvenci próby II lállm i i i i i i i i i i líiiMuj J-h_L_^-1 ' 1-' ' '-L klillL i 1 1 1 1 i 1 PA Kit P034/P035 DMD/Becker Detekuje delece a duplikace všech exonů DMD genu DMD muž delece probe odpovídající sekvence se proievuie absei delece probe odpovídající sekvence se projevuje absencí amplifikaCního produktu proby DMD Žena přenašečka - heterozygot 30- 35% redukovaná plocha píku amplifikaCního produktu příslušné proby Mutace/polymorfismy ležících v místech dosedání prob mohou také způsobit redukci plochy píku - deleci jednoho exonu nutné ověřit jinou metodou Duchennova svalová dvstrofie Duchennova svalová dvstrofíe Kontrola P34 ilii iUi.i Přenašečka dclccc exonu 8-41 P34 ilLil Kontrola P35 Přenašečka delece exonu 8-41 P35 Metodou fluorescenční iti situ hybridizace lze lokalizovat cílové nukleotidové sekvence přímo v buňkách (in situ). etoda FISH naložena na schopnosti jedno řetězcové DNA ;ondy vázat komplementární úsek cílové DNA ixované na mikroskopickém skle. del exonf46 - 47 iH renašecka delece exonu 46-47 genu pro dystrofin na chr.X ymfocyty periferní krve Kuglík, Slámová Laboratoř molekulární cytogenetiky, OLG, FN Brno Duchennova svalová Život s dystrofií se podobá temnému tunelu, kde je lepší nevidět konec. Světýlek naděje na léčbu v něm bliká málo Ale nyní se z temnoty tunelu ozvývá veselý psí štěko Na Žádnou z podob svalové dystrofie nebyl zatím nalezen účinný lék......... Duchennova svalová Mesengioblasty - kmenové buňky získané ze stěn cév krevního oběhu - schopné diferenciace na svalová vlákna a produkce dystrofinu - Čtyři z pěti psů se postavili na nohy - transplantované buňky pronikly do svalů v různých Částech těla, zapojily se do nich a pomohly k nápravě - v některých svalech až 70% vláken dárcovského původu Giulio Cossa, Nature, listopad2006 skipping - AON (antisense oligonukleotid) -zabraňuje transkripci poškozených exonů - vzniká zkrácený funkční protein Shoří fragment homologous f e pail DNA RNAJ [dystrophi n) (dystrophin) •frekventovaná v Africe a černé popuk í -^►1:500 f •autozomálně recesivní dědičnost rpkovitá anémie Doména:Eukaryota Rise:Chromalveolata Nadkmen:Alveolata Kmen:vÝtrusovci (Apicomplexa) Tŕída:krvuikovky (Haematozoea) Rád: Haemosponda CeleďPlasmodiidae Koá:Plasmodium Amino acid ssquenca No*maJ red Wood colls DMA GAG GTS GAG WQLXH1C8 QTQ £AC T G T G A G G A ACT OCT Amino acid soquoncfl YflJlne — Htstldna — Leudns — Threonine = ProHns -! I-! L--1 I--J L-:— C A C ETC i_i C T C GAG Glutamic ecld Sicklod rod blood cetls The change En amino acid sequence causes hemoglobin molecules to crystallize when oxygen levels in the blood art low. As a result, red blood cells sickle and get stuck in small blood vessels. tnn ucleo tide mutace trin ucleo tifle repaet expansion TRED trin ucleo tide repeat expansion ^diseases expanze nový typ mutace, popsán 1991 široce rozšířeny v j * v intronech * uvnitř čtecích rá one< nepřekládaných nestabilita, závisící na: * typu sekvence ^ * délce repetitivní sekvence Expanze a delece ťi^nukleotidů při replikaci 1 TR lokalizovány uvnitř OR L-> expanzí narušená struktura proteinů (Huntingtonova chorea) okalizovány vně ORF - v introne patrně inaktivují nebo ovlivňují expresjgenu (Myotonická dystrofie) lech, - w Přehlejd a základní charakteristika některých chorob asociovaných s exoanzí Choroba Dědičnost Fragilní X (FRAX-A) XD Hungtigtonova chorea AD Myotonická dystrofie 1 AD Kenedyho choroba XR Spinicelebrální ataxie 1 AD 1/2500 mentální retardace FMR-1 RNA (FRAXA) binding 1/5000 až demence 4pl6.3 IT15 huntigtin 15000 1/8000 svalová slabost 14ql3.3 DMPK 1/50 000 atrofie svalů Xqll AR postižení 6p22 SCA1 míšních provazců a mozečku Počet opakování Sekvence patologick trinukleotidu normální é 200 až 4000 11 až 34 35 až 121 5 až 35 50 až 2000 CAG 12 az 34 40 az 62 40 až 80 v / J .\ Myotonická /dystrofie typu 1 (MD1) •autozomálne dominantní neuromuskulární choroba •nejčastější forma svalové dystrofie* celosvětová frekvence výskytu 1:80Q0 •polysystémová manifestace v \ A •klinicky extrémne variabilní v patří mezi onemocnění TREDs příčina expandované trinukleotidové repetice (TŘEs) >vé réoetice : (TREsl expanze t r ve 3'UTR genu DM] lokus 19ql3.3 DMPK gen 1 nom om/ální produkt DMPK protein expanzivní mutace Lvnena ik patolog rote motypu neobjas yravděpodobné příčiny vzniku MD: • narušený transport a úprava mRNA • narušení struktury chromatinu expandovaným repetitivním traktem—► jmrucha exprese genů lokalizovaných v okolí geůu-DMPK T\ • vy syceníDNA vazebných prote - funkce genů v okolí genu DMP, ^narušeni f Alely gemifl^vIPK Normální alela Premutantní alela r 35 - 49 CTG repetic může expandovat během gametogeneze, transmise alely s delší trinukleotidovou repetice než má rodič f Mutantní alela / | ^ 50 a více CTG repetic asociováno s manifestací choroby A u 100% jedinců s MD1 u a' f( otypu á fenotypu u MD1 wm klinická forma myotonické dystrofie mírná klasická neonatální počet CTG trinukleotidů 35 - cca. 49 100- 1000 až 1500 1000 až cca. 3000 propuknutí choroby ve věku 21 - 40 let od narození do cca. 10 let průměrná délka života normální 64 let ■ 48 - 55 let přežije neonatální klinické projevy žádné postižení výjimečně katarakta katarakta mírná myotonie i svalqyá slabost myotonie katarakta předčasné srdeční aritmie postižení endokrinního systému další těžká hypotonie respirační problém postižení srdce prtentální retardace další typický výraz obličeje "maska" KongenitájAií MD (CMD) •ochablost svalstva •těžká hypotonie •obličejová ochablost •respirační problémy •postižení srdce •mentální retardace •strabismus •neprojevuje se myotonie katarakta CMD je povaZgyána.za subtop MD, ale symptomy J^>Žy°J Choroby je JfcHišný od MD 4| , itální/MB^CMD) •nejzávažnější forma MD •popsána pouze u MD typu •dědí se převážně maternální cestou •popsány případy CMD po přenosu expandované alely od oice rodič MD1 matka MD1 ■ . ■ >tec MD1 dítě adultní/S^pi expandované alely se dedí ilavím ovUvněn^ efekty na transmisi MIK Bdí od otce i od matky nestabilita alel je převáZně maternální CMD se dědí převážně maternální cestc mální cestou príCina 'snížená fertilita mužů s adultní formou MD1 amet •kontrakce repetitivního traktu během transmise muZských gamet •maternálnídědičnost abnormalit mitochondriální DNA, která interaguje s produktem genu DMPK •maternální imprinting f •transplacentární faktory Diagnostika MD1 Histologické vyšetrení postižených svalů histochemie elektron, mikroskoj jednoznačně ^ w ] nebo potvrdí diagnózu _v_ agi MD1 •prováděna u Členů rodiny se zátěží MD1 •analýza DNA extrahované z fetálních buněk získané i^^R^ • amniocentéza (14.-19.tg) • biopsie choriových klků (10.-12.tg) •testování přítomnosti expandované alely DMPK ^ ^ jednoduchý PCR systém zahrnující 2 PCR reakce /. L Triplet Primed PCR ie molekulárně genetického trení DNA pacienta ( susp. MD1) hu PCR P1/P2 detekce 2 alel genu DMPK detek alely genu DMPK TP PCR zdravý homozygot heterozygot s expandující alelou ^Stanovfcní cjg. MD1 při prenajtalním\yšetření asymptomatický , ti 3] -H [expanze] symptomy MD - I [5]+ [13] . [expanze] [13] + [expanze] - genotyp (CTG)n ^ prokázána expanze trinukleotidových repetic na jedné alele genu DMPK [5-13]+ [13-21] - genotyp (CTG)n velikost repetic je na obou alelách ve fyziologickém rozhraní [13] + [21]J t21l+ [expanze] Průkaz expanze CT6^ěpétice v genu DMPK metodou TJ&PCR •nemůže být stanoven věk nástupu nemoci a její závažnost rsu>c: >ci a ieií zái -expanze CTG repeticí asociována s -možnost somatického mozaicismu ina se 3 fěhptypy srnu ■ ^^^^^^ •presné urCení délky expanze:730-1000 a více repetic velmi pravděpodobnártrŠociace s CM] •ultrazvukové vyšetření ve 2. a 3. trimestru může odhalit CMD: ^ -zmenšený fetální pohyb -polyhydroamnion ^u*/' A • přímá RNA diagnostika - skrínování celé kódující oblasti příslušného genu • gene - expresní analýza: - diferenciační diagnostika některých typů nádorů (NB) — detekce cirkulujících nádorových buněk v krvi, kostní dřeni pacienta — monitorování průběhu léčby a detekce reziduálni choroby kontrola štěpu před autologní transplantací - differential display, PTT test, funkční testy.... RN savčí buňka: • 10 - 30 pg celkové RNA • tRNA (28S,18S, 5S) 80-85% • tRNA, snRNA 15-20°/ • mRNA 1-5% 360 000 mRNA molekul/buňku , tj. 12 000 rozdílných ttanskriptíl typická délka 1 ttanskriptů cca 2kb Nestabilita přítomnost ribonukleáz (RNázy) v buňce RNázy — velmi stabilní — nevyžadují kofaktory — účinné v nízkých koncentracích — obtížná inaktivace — kontaminace RNázami: lidská pokožka prachové Částice (bakterie,plísně) izolace a analýza RNA : speciální přístup i techniky Stabilizace RNA a uložení gene-expresní analýza: analyzovaná RNA musí reprezentovat in vivo expresi vzorku komplikace během odběru a zpracování biologického vzorku: — v okamžiku odběru RNA se stává extréme nestabilní — dva hlavní typy artefaktů: 1) redukce specifických i nespecifických druhů mRNA (downregulace genů a enzymatická degradace RNA) 2) indukce exprese určitých genů stabilizace RNA ve vzorku při odběru : — okamžité zmrazení v tekutém dusíku a uložit při -80 °C stabilizační roztoky: RNAlater (tkáně), RNAprotect (bakterie), ^^^^^^^^^^^^^^^PAXgene (krev, kostní dřeň) kontaminace DNA — PCR primery překrývající hranici intron/exon — štěpení DNázami — cílená izolace mRNA izolovaná RNA může být uložena při -20 nebo -70 °C (bez degradace RNA po 1 roce uložení) • i - skrínování celé kódující oblasti příslušného genu • gene - expresní analýza: - diferenciační diagnostika některých typů nádorů (NB) — detekce cirkulujících nádorových buněk v krvi, kostní dřeni pacienta — monitorování průběhu léčby a detekce reziduálni choroby kontrola štěpu před autologní transplantací - differential display, PTT test, funkční testy.... štika NF1 genu Struktura NF1 genu 433 341 203 B. NF1 gene on chromosome 17 -60 e 11 -13kbmRNA protein neurofibromin - 2818 aminokyselin - zřejmě tumor supre Human GAPa (GT Pase-act ivati n g protein) Yeast IRA1 í. NF1 gene product (neurofibromin) AutosomálnG dominantní Frekvence 1:3000 Lokus17q 50% mutací de novo Predispozice k tumorům nervového systému Café-au- lait spots eurohbromy Komplikace při molekulami diagnosti - problematická klinická diagnostika případ - vysoká mutační rychlost elikost genu (350 kb, 60 exonů) absence hot spot oblastí nutnost vyhledávání v celém genu ce mezi tvpem mutace a formou postižení - neurofibromin - známa funkce pouze jeho centrální domény itrálni - různé klinické projevy i u pacientů nesoucích stejnou mutaci ie molekulárně-genetického testoval NF1 pacien DNA / RNA NF1 pacienta I Vazebná DNA analýza Mutační analýza 1 Přímé sekvenování intragenový DNA polymorfismus I DNA/RNA vyhledávací metody IVS27AAAT2.1, IVS27AC28.4 DGGE, SSCP IVS38GT53.0 - i 38 cDNA/SSCP cDNA SSCP semi-nested PCR cDNA (segment P7) P7A(560bp) P7B(614bp) podmínky elektroforetické separace : 12% PAGE (60:1) / 150V /16 hod. / r.t. Sekvenace cDNA segmentu P7 NF1 genu (exony 28 -32/33) standardní cDNA cDNA NF1 pacienta, mt Sekvenace vzorku DNA s odlišnou elektroforetickou mobili GEN NF1 - exon 37 standard DNA 1200/01 mt 6789 delTTAC: Thr>Thr, delece Tyr, posun ct. rámce Výhody a nevýhody RNA diagnostiky genů - jednodušší a rychlejší skríning multiexonickéh genu (10 segmentů cDNA místo 60 exonů), mRNA ie bez intronů - záchyt sestřihových mutací - záchyt delece celého exonu na jedné alele genu - nižší ekonomické náklady - složitější odběr krve pro izolaci RNA - nižší stabilita RNA - dlouhé úseky genu obtížnější elektroforetická separace a sekvenace nejasný efekt mutace na fenotvDové úrovni diagnostiky!) Molekulární analvz 1 genu blastome Retinoblastom zhoubný nádor oka, pocházející z primitivních buněk sítnice incidence 1/5 000 až 1/20 000 živě narozených dětí manifestace do 5-ti let věku projevy: ztráta zrakové ostrosti, strabismus, leukokorie, slepota, postižení: oko, mozek, mícha (může se šířit do CNS přes opticus) léčba: chemoterapie, lokální terapie (kryoterapie, nitrooční podání cytostatik), enukleace oka (oko je už většinou slepé, jde o život zachraňující výkon) úspěšnost léčby při zahájení: nádor uvnitř oka - 95% mimo oblast oka - 10% Gen jediný známý gen asociovaný se vznikem retinoblastomu (RBL) • lokalizace - 13q14.1-14.2 27 exonu, >180kb genomické DN kóduje retinoblastomový tumor-supresorový protein,(pRb,928 aa). významný negativní reaulátor buněčného cyklu tumor-supresorová aktivita II.I.I1I.I.I.II1.U1) ■*_V" *.\) *.\) *jO ĽJ í.0 í.0 *.\) jj ij j3 j3 j3 j3 I RB1 gen I deregulace buněčného cyklu i vznik retinoblastomu Funkce retinoblastomového proteinu (pRb) | Spufca: Čaucsr Cnninil S 2004 H. Lbů Maim Canťer Center Riú flaaearrfi rnsíitule, Iftc. | v,brzda" buněčného cyklu - kontrolní bod přestupu z G1 do S fáze: - pRb v aktivní formě váže transkripční faktor E2F - CyklinD- a CyklinE-dependentní kinázy fosforylují - a tím inaktivují - pRb - inaktivovaný pRb uvolňuje E2F transkripční faktory, které stimulují expresi cyklinů a dalších genů potřebných pro syntézu DNA a vstup do S fáze retinoblastomu • vznik RBL vysvětluje Knudsonova teorie dvou zásahů: sporadicky retinoblastom - 60% pacientů - dvě somatické mutace _ - pozdější rozvoj RBL (24.měsíc věku) - unilaterální forma retinoblastomu hereditární retinoblastom - 40% pacientů - první mutace germinální - „druhý zásah" - mutace somatická - časnější rozvoj RBL (8.měsíc) - bilaterální/multifokální forma - vyšší riziko vzniku dalších nádorů (Osteosarkom, sarkomy měkkých tkání,...) Alfred G. Knudson Knudson's hypothesis Hereditary Retinoblastoma First Mutation Germline RBrb Constitutional Ztráta vrozené heterozygotnosti • „druhým zásahem" vedoucím ke vzniku retinoblastomu bývá často ztráta vrozené heterozygotnosti (LOH - loss of heterozygosity) linobfast with o nmal copies of chromosome 13 <<<< <<<< / / / / f RU1 HBx RBx Non-disjunction aimiiosřs /c Second hit: reduplication of mutated chromosome 13 RR1 RBI RBx Malignant retinoblast Retinoblastoma tumour development: loss of heterozygosity Expert Reviews in Molecular Medicines 2003 Cambridge University Press * mechanismy LOH: - delece - mitotická rekombinace - nondisjunkce a reduplikace - uniparental™ disomie Molekulárně genetická analýza genu RB1 v genu RB1 bylo popsáno více než 500 mutací rozmístěny po celé kódující oblasti genu a zahrnují všechny dále byla u retinoblastomu popsána hyperme CpG dinukleotidech promotoru ji různé formy inaktivace Rb1 genu vedou k rozdílné penetranci a expresivite genu, a tudíž rozdílným klinickým projevům onemocnění rozlišení hereditární a nehereditární formy onemocnění v■ v ■ v m r r mm mmm* mmn- m aDNcinuiici vznik RBL Typ mutace výskyt metoda detekce cytogenetické aberace (delece a přestavby 13q14) 8% bilaterálních RBL 1-5% sporadických RBL testy heterozygozity velké delece a přestavby 10% familiárních RBL kvantitativní multiplex PCR jednonukleotidové substituce 40-50% RBL small length mutations 25-30% RBL hypermetylace promotorové oblasti RB1 10% RBL Mater periferní krev, tkáň RBL DNA, RNA pacienti s RBL a rodinní příslušníci ►sekvenace cDNA ►sekvenace DNA •MLPA •metylační analýza promotoru Strategie molekulární analýzy genu RB1 vzorek tumoru / periferní krve izolace RNA izolace DNA RT-PCR sekvenace cDNA nález sekvenční změny (substituce, delece, inzerce) nález rozsáhlé delece sekvenace DNA MLPA negativní výsledek MLPA Metylační analýza promotoru • hypermetylace CpG ostrůvků promotorové oblasti vede k represi transkripce - umlčování genu u TSG (RB1, BRCA1, p15, p16..) představuje hypermetylace promotorů jeden z mechanismů onkogeneze hypermetylace promotorové oblasti popsána u sporadických i hereditárních retinoblastomů nemetylovaná DNA 5'-ACGT -3' metylovaná DNA 5'-AC*GT-3' modifikace bisulfidem sodným 5'-A GT-3 5'-AC*GT-3 PCR s primery specifickými pro metylovanou a nemetylovanou DNA 1 .cyklus PCR 5'-AUGA-3' 3'-TACT-5' 5'-ATGA-3' 3'-TACT-5' 5'-AC*GT-3' 3'-TG CA -5 PCR amplifikace 5'-ACGT- 3' 3'-TGCA-5' detekce metylačního statusu pomocí PAG elektroforézy / sekvenování g.45798G>A/non : A G hfi T Th G A A CA T A 1 G A T GA G NTA ATT 220 g.41954G>T (E137X)/non G S NN N N N NGGNNN N N G g.59749G>A/non g. 156768-156769insAT/non g.150038delG/non • přímá RNA diagnostika - skrínování celé kódující oblasti příslušného genu • gene - expresní analýza: — diferenciační diagnostika některých typů nádorů (NB) — detekce cirkulujících nádorových buněk v krvi, kostní dřeni pacienta — monitorování průběhu léčby a detekce reziduálni choroby — kontrola štěpu před autologní transplantací — differential display, PTT test, funkční testy.... Spolehlivá Přesná Rychlá Univerzální Van* analý žitých sond ce více mutací běhe eke Pro detekci produktu v průběhu PCR existují následující metody: - Na DNA se vázající interkalaČní barviva • SYBR green I - Na menší žlábek dsDNA se vázající barviva • BEBO - Technologie využívající fluorescenční výměny • dvakrát fluorescenčně značené sondy vázající se na střední Čás amplif ikovaného produktu - TaqMan - Molekulární majáky - QZyme • jedenkrát fluorescenčně značené sondy nebo primery - LUX - PNA • dvakrát fluorescenčně značené primery - AmpliFluor - Scorpions Polyty ové varianty v intřonu 8 CFT Percentage of Normal CFTRmRNA Clinical Phenotype CFTR Genotype 1 uu Normal 91/91 91/71 71/71 91/51 71/51 51/51 10 CBAVD ""I OF/51 _| OF/CP" Cystic fibres is-PS 0 Cystic fbrosis-PI CF/CF PCR analýza alel polyT sequencí v intronu 8 CFTR genu •nested PCR •reštrikční štěpení •ELFO Kvantifikace cDNA PCR produktu CFTR exon 9 na LightCycler Transcripty byly izolovány z leukocytu perifrní krve. File: C:\LightCycler3\UsersWJministrator\Data\CFTR\2005\050-120-5T QPCR.ABT Program: amplifikace Run By: Administrator Run Date: Jan -19, 2005 14:32 Print Date: January 26, 2005 1 D2MG 1 0 6 2 Ď2MG10 5 ■4 Ď2MG10 3 5 b2MG 1 0 2 6C127/04 D2MG 7C128/04[]2MG 8 C11I05 1J2MG 3 C28I03 1]2MG 10 K- b2MG 11 CI 27/04 12 C1 28/04 13 C11/05 14 C28/03 wt ■10 12 14 16 18 20 22 24 26 23 30 32 34 36 33 40 42 44 46 Cycle Number Reakce monitorována pomocí SYBR Green I. Koncentrace vybraných transkriptŮ exonu 3 je vyjádřena v relaci ke koncentraci referenčního (housekeeping) genu. l.Case (patient C127/04) 2.Case (patient C128/04) 3.Case (patient C 11/05) .wt (C28/03) Kvantifikace cDNA PCR produktu CFTR exoti 9 na LightCyclet Transcripty byly izolovány z buněk bukální sliznice Fiie: C\LJ3^íC^l^rS^iJs^rs\^niinJ^riíor\!J^a\C>TP^2005^150i50ĚíiT CjPCfí.roT Program smplitiksoe Run By: Administrator Run Date: Jun 05, 2005 03:43 Print Date: June 14, 2005 2 01 45/05. b2MG 3 01 46/05. b2MG 4 01 47/05 b2MG 5wtb2MG 6 K- b2M0 7 01 45/05 8 01 46/05 9 01 47/05 I 0 wt (021 6/05) II K- 2.4 2.2 2.0 1.8- 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 Cycle Number Reakce monitorována pomocí SYBR Green I. Koncentrace vybraných transkriptŮ exonu 3 je vyjádřena v relaci ke koncentraci referenčního (housekeeping) genu. 3.Case (patient C147/05) Nádorové buňky se od normálních zdravých buněk liší na molekulární úrovni svým expresním profilem nádorová buňka exprimuje jiné geny ze své výbavy projeví se změnou množství a spektra exprimované mRNA Onkomark Nádorové markery jsou látky produkované maligními buňkami, nebo organismem jako odpověď na nádorové bujení. mají onkomark H7tf» Klinický význam jednotlivých markerů je i u samotných odborníků, zabývajících se problematikou onkomarkerů značne diskutovaným problémem. I jejich stanoviska se postupem času měnila. Od původního přeceňování až k úplnému zatracení a novému uznání. Verifikace významu onkologických markerů a jejich využití v ambulantní praxi neustále probíhá. Statistické pojmy pro klinické hodnocení 1. Cut off - referenční hladina je definována jako hladina markem, pod kterou leží většina hodnot zdravé populace, či pacientů s benigním onemocněním, nebo hladina pod kterou leží většina hodnot pacientů v kompletní remisi 2. Senzitivita markeru Udává procento správně pozitivních výsledků z daného souboru 3. Specificita markeru Udává procento správně negativních výsledků z daného souboru 4. PV+ >w pozitivní prediktivní hodnota - udává v procentech s jakou ^^^pravděpodobností bude mít pacient hledanou chorobu, bude-li test pozitivní 5. PV- negativní prediktivní hodnota - udává v procentech s jakou pravděpodobností nebude mít pacient hledanou chorobu, bude-li test negativní Kritéri a id eálního onkomarker je produkován pouze u maligních onemocnění je orgánově specifický vyskytuje se ve vysokých koncentracích v biologických tekutinách hladina koreluje s velikostí nádoru hladina koreluje se stádiem onemocnění hladina koreluje s prognózou hladina koreluje s efektem léčby umožňuje průkaz zbytkové nádorové tkáně Rozdělení onkomarkerů podle chemické struktury, nebo biologické funkce onkofetální antigény enzymy hormony intracelulární onkomarkery ostatní blíže nespecifikovatelné látky Indikace a interpretace laboratorního vyšetření Indikace a interpretace laboratorního vyšetření má svá pravidla a též určitá úskalí. Pro jejich využití v diagnostickém postupu je třeba mít na paměti následující pravidla. • volba vyšetření • preanalytická fáze • analytická fáze • fáze klinického zhodnocení (vyloučení falešné pozitivity) Onkomarkery: indikace podle orgánů Zvýšení některých onkomarkerů za fyziologických, nebo nemaligních podmínek Podmínka_ gravidita menstruační cyklus kouření ethylismus katetrizace moč. měch. Fyziologicky zvýšené onkomarkei AFP, hCG, Cal25, TPS, TG Cal25 CEA, TPS, TG CEA, TPS PAP, PSA Podmínka_ Chron. onemocnění jater Endometrióza Pankreatitida Hypertrofie prostaty cukrovka zvýšení onkomarkerů u jiných chorob CEA, TPS, Ca 15-3, Ca 19-9, Ca 125 Ca 125 Ca 19-9, Ca 125 PAP, PSA Ca 19-9 Co z toho plyne Nádorové on koma r ke ry by se měly stanovovat jednou metodou v jediné laboratoři. Hodnoty onkomarkerů mohou být ovlivněny celou řadou procesů. ALE. ... diagnostický práh onkomarkerů umožňuje v příznivých případech odhalit nádor o hmotnosti 1 mg, tedy asi 106 maligních buněk, zatímco klinická diagnóza bývá určena většinou až u nádoru, který obsahuje nejméně 109 buněk, tedy nádor v průměru 1 cm. Aplikace a využití v onkologické praxi Screening Primární diagnostika Staging Sledování účinnosti terapie Sledování průběhu choroby Prognóza Predikce Analýz Pozitivní exprese markem (např. TH, TrKC, c-myc.) může upřesnit diagnózu nebo poukáže na remisi/ progresi či na odpovídavost na léčbu. Odběry chodí opakovaně —► umožní sledovat minimální reziduální nemoc v case. Detekce mi "eziudiá Detekujeme přítomnost izolovaných nádorových buněk v krvi, kostní dřeni a lymfatickém systému - možné prekurzory metastáz ^ Detekce MRD (minimal residual disease) - detekce znaků epiteliálních buněk v kompartmentech mesenchmálního původu Imunohistochemie - citlivost 1 : 10 000 Průtoková cytometrie - citlivost 1 : 100 000 PCR- citlivost 1: 1000 000 Real- time PCR - citlivost až 1 : 10 000 000 Princip detekce mimimalní reziduálni choroby metodou stu Epiteliální (nádorová) buňka nove expres Mezenchymální (nenádorová) buňka inRNA cDNA DNA amplikou Reverzní transkripce s náhodnými (random) primery PCR reakce se specifickými primery detekce amplikonu na gelu Real time RT-PCR, detekce fluorescenčně označeného amplikonu v reálném čase v průběhu PCR reakce, fluorescenční značení je buď nespecifické (DNA interkalátory) nebo specifické (sondy), díky standardům je detekce kvantitativní Detekce MRĎ a rozhodnutí o adjuvantní léčbě • Monitoring MRĎ v čase - relaps vs. remise • Včasný záchyt recidivy • Hodnocení léčebné odpovědi • Diferenciální diagnostika • Autologní transplantace při HĎ chemoterapii V LightCycler Data Analysis (Administrator) - [Quantification: 070516-TH; F2/F1; amplifikace seg 2] File Quantification Report Window Help C5 Čeština 3 X Analysis— C Fit Points ■id Derivative Maximum Baseline Adjustment-f None f» Arithmetic C Proportional C Normalized P..J N am e Standard I Calculat. Uro. 1 h-GGPDH 10 G 1.000E+OG 1.000E+0G 22.15 2 C31/07 h-GGPDH 2.445E+04 27.27 3 C232/07 h-GGPDH 4.777E+05 23.17 4 C233/07 h-GGPDH 3.315E+05 23.67 5 C234/07 h-GGPDH 1.533E+05 24.74 G <• h-GGPDH 7 □231^07 T H tkán 2.190E+0G 21.07 8 C23iy07 T H tkán 2.Í93E+0G 21.07 9 C232/07 TH KD-L 4.415E+01 35.98 10 C232/07TH KD-L 5.B08E+01 35. G0 11 C233/07TH KD-P 12 13 14 C233/07TH KD-P C234/07TH krev C234/07 T H krev 15 K+ TH 7.100E+05 22.62 1G K- TH Start " Front f/LGDA Bez nazvu - Malování *j V LightCycler Data Analysis (Administrator) - [Quantification: 070917-TH; F2/F1; ampLifikace seg 2] ^ File Quantification Report Window Help C5 Čeština 3 X Analysis— r F,i. Points id Derivative MaKirnum P...! N; Baseline Adjustment C None t* Arithmetic C Proportional C Normalized Standard Calculat... Do.. Analysis Notes Step 1: Baseline S tep 2: Analysis ■0,16 +05 24.94 +02 31.41 +05 24.20 +05 23.72 +05 24.01 +05 23.74 +05 23. G2 +04 25.79 +03 29.75 +02 31.90 +01 34:99 +00 38.55 '£ Start TH Iveta - Malování Z průběžných výsledků vyplývá detekce t \ onemocnění s od klinicky diagnostikovaného relapsu . neuroblastom IV. stadia datum odběru BM 1. 3. 07 exprese TH genu KD pozitivní PK pozitivní FISH klinický stav Nmyc- KD, metastázy lp36 - v obratlech bederní páteře l.blok CHT 30.4.07 PK KD(PS,LS, sternum) slabě pozitivní 0 před 2. Blokem CHT 26.6.07 KD (LS,PS slabě pozitivní) 0 plánovaná separace PBSC 17.10.07 PK, KD negativní lok. amp. N-myc před 2. PBSC (1-4.11.01) gainl7q- VGPR 5.11.07 0 N-myc - 16 11 07 0 N-myc - 22.11.07 ABCD štěpy negativní KD,PK negativní 0 25.1.08 PK negativní 0 před vysoce dávkovanou CHT s transplantací PBSC 27.2.08 PK negativní 0 kontrola po transplantaci 29.3.08 KD-LS negativní KD-PS pozitivní molekulární relabs 26.4.08 klinický relabs komarke Vyšetřování onkomarkerů je obrovským pokrokem při diagnóze a sledování efektu léčby nádorových onemocnění, jejichž počet se nejen v České republice, ale i v celé Evropě každoročně výrazně zvyšuje. Vzhledem k výše uvedeným podmínkám, pravidlům použití a značné finanční nákladnosti patří jejich využití v klinické praxi spíše do ordinací odborných lékařů než do ordinací praktických lékařů. Výjimku mohou tvořit skupiny s vysokým rizikem vzniku nádorového onemocnění, obecně skupiny s profesním rizikem vzniku karcinomu, nebo případy familiárních výskytů nádorových onemocnění, tedy skupiny kontrolované praktickými lékaři. Molekulárně genetická diagnostika strategie Přímá DNA diagnostika: • zjistí, zda analyzovaná DNA nese či nenese mutaci • detekce mutací v senech asociovaných s ch Nepřímá DNA diagnostika • užitím vazebních markem v rodinných studiích odhalí alelu genu v asociaci s nemocí v rodině 3 T X T G \ c G využití polymorfních míst lidského génom Nepřímá molekulárně genetická diagnostika Nepřímá diagnostika byla daleko více používána v minulosti, kdy u většiny chorob nebyla známa přesná molekulární povaha poškození genu, U nepřímé diagnostiky postačuje, je-li známa jen jeho přibližná poloha v genomu. Dnes se tento typ vyšetření používá tehdy, kdy sice víme, porucha kterého genu je zodpovědná za daný patologický fenotyp, ale nevíme, jaké konkrétní poškození genu chorobu u vyšetřovaného jedince vyvolá. Nepřímá molekulárně genetická diagnostika nezkoumá se přímo přítomnost nebo nepřítomnost určité poruchy v genu, ale segregace markeru, který je ve vazbě na gen, jehož porucha vyvolá vadný fenotyp. Marker, jehož segregace v rodokmenu se sleduje, se dědí totiž společně s genem, protože je v genomu v jeho těsné blízkosti, sám ale s chorobou nemá žádnou příčinnou souvislost. Ve zkoumaném rodokmenu se porovnává segregace markeru se segregací choroby Jako markery se používají DNA polymorfismy DNA polymorfismy Sekvence DNA se liší mezi jednotlivci. Přítomnost několika alel v určitém místě. tjako místo v sekvenci DNA, v němž jsou jedinci rozdílní. •jednobodový polymorfismus (single nucleotide polymorphism - SNP) • minisatelitové polymorfismy VNTR - variable number tandem repeats Jednobodový polymorfismus (single nucleotide polymorphism - SNP) •rozdíly v jednom nukleotidu v určitém místě •vyskytuje se asi jedenkrát na 1000 párů bazí. •celý lidský genom obsahuje více než 1,5 milionu SNPs •vyskytují se v intronech, v extragenových oblastech •jen asi 50 000 SNP v kódujících sekvencích genů •přítomnost/nepřítomnost restrikč. místa, vznik RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Jednobodový polymorfismus (single nucleotide polymorphism - SNP) Detekce RFLP (restriction fragment lenght polymorphism) reštrikční štěpení genomické DNA s následným Southern blottingem PCR amplifikace s následným restrikčním štěpením PCR amplifikace s následnou sekvenací DNA array (čipy) analýza až 100 tisíc SNP v jedné analýze Mikrosatelity - krátké tandemové repetice STR (Short Tandem Repeats) délka základní repetice 2 - 6 bp počet opakování repetice 2 - 100 bp Rozptýlené rovnoměrně v lidské genomu Vyskytují se běžně v populaci M<=»icm i nmnicnuánw Hn nrnt<=»inii tcccaagctcttcctcttccctagatcaatacagacagaagaca INejSOU přepisovaný OO proieinu ggtggatagatagatagatagatagatagatagatagataga |p7í v intrnnprh tagatagatatcattgaaagacaaaacagagatggatgatagat v mnul 1^701 acatgcttacagatgcacac Nejsou příčinou choroby Tvoří vzorce bez vztahu s fenotypem Mezi jednotlivci se velmi liší Odlišují jednoho člověka od druhého 7 repeats....., i , 8 repeats........ 9 repeats........ 1 0 repeats........ 11 repeats........ 1 3 repeats........ ...... Target region (short tandem repeat) Využití polymorfních míst lidského eno □ Identifikace osob/vzorků DNA (A. Jeffreys 1985) (lidé obvinění z kriminálních Činů, oběti katastro □ Určování paternity (VNTR, STR) □ Nepřímá diagnostika monogénních chorob □ Hledání nových genů (poziční klonování genů □ SNP a multifaktoriální choroby Nepřímá gelová elektřofořéza kapilární elektřofořéza Vazebná analýza je umožněna: — v rodinách s dvěma a více jedinci s klinicky potvrzenou diagnózou — rozlišením dvou chromozomů pomocí markerů na DNA — přiřazením DNA markerů (tj. chromozomu) k patologii v rodině Základní principy nepřímé DNA diagnostiky 1) odlišení dvou chromozomů rodičů (heterozygozyta markerů) 2) určení fáze (určení haplotypu - souboru alel polymorfních míst ve vazbě) 3) určení haplotypu (chromozomu) asociovaného s patologií v rodině Přísná rodinná specifita Nikdy nepotvrzuje diagnózu Rodokmen todi Nenřímá di užitím vazebních markerů v rodiných studiích odhalí chromozom v asociaci s nemocí v rodině od otce od matky alela AI: ------GTATC \TTCGG—- alela A2: -----GTATCACACACATTCGG- délka alely m bp délka alely m+4 bp [mt] + [=] [?] + [=] [A1] + [A3] [A1] + [A2] chr.n [=]+[=] [A 1 ] + [A3] informativní Nepřímá chr.n [?] + [=] [A1] + [A1] chr.n [=]+[=] [A1] + [A3] neinformativní Nepřímá diagnostika Autozomálně dominantní dědičbňost 131 131 179 179 135 131 187 179 135 131 181 179 Ô 131 131 179 179 131 135 179 179 135 181 131 179 neznáma mutace 135 181 131 179 135 181 135 185 Polymorfní systémy GXAlu / i27b IVS38GT /Í38 haplotyp v asociaci s neznámou mutací Autozomálně recesivní dědičnost i o B oo Ořu CA CA 5 6 5 6 LU 2 F508del neznámá mutace FA AA 1 3 I3J2 AD AA 2 2 2 2 AD AD 2 2 '22 Polymorfní systémy IVS17BTA alely 1 -6 IVS8BTA alelyA-D haplotyp v asociaci s neznámou mutací Cystická fibróza Nepřímá diagnostika Cystická fibróza Nepřímá diagnostika K určení patologického haplotypu slouží genotyp zdravé sestry zemřelého probanda oo 2 F508del neznáma mutace El A A 1 3 I3J2 AD 'AD 2 2/ 22 Polymorfní systémy IVS17BTA alely 1 -6 IVS8BTA alelyA-D haplotyp v asociaci s neznámou mutací I o Cystická fibróza Nepřímá diagnostika El A A 1 3 U2 AD AA 2 2 2 2 o<> 2 F508del neznáma mutace AD AD 2 2 2 2 Polymorfní systémy IVS17BTA alely 1 -6 IVS8BTA alelyA-D haplotyp v asociaci s neznámou mutací Nep •říniá di agr íostika JL Duchei tinova sví á dystrofie X vázaná dědičnost haplotyp v asociaci s neznámou mutací Duchennova svalov gnoslika Polymorfní místa v dystrofinovém genu 5 (CA)n iamHI _|_SIR45 J_^TR50 STR44 STR49 3 (CA)n Legenda •5 (CA)n alely 172 - 184 pb •pERT 87-8/Taq I alela 145 pb (-), 71 pb a 74pb (+) •pERT 87-15/BamH I_alela 216 pb (-), 166 pb a 50 pb (+) |*STR sekvence /(CA)n/: STR44 alely 174 - 204 pb, hetetozygozyta 87% STR45 alely 156 - 184 pb, hetetozygozyta 89% STR49 alely 227 - 257 pb, hetetozygozyta 93% _STR50 alely 233 - 251 pb, hetetozygozyta 71% •3 (CA)n alely 131 - 137 pb chennova svalová dvstrofie ABI^ GeneScan® 3.1 PRISM 210 GeneScan™ Project-14/3/2002 Display-9 240 270 Page 1 of 1 300 proband *— MM 1 3B:Sample13 / 88/95 STR50 / • ; J sestra HB 14B:Sample14 / 89/95 STR50 / a^U. ^ |^ matka MM 15B;Sample1 5 / 90/95 STR50 /^^a. ■ J J/ otec HB 1 6B:Sample1 6 / 91/95 STR50 / Duchennova svalov os K určení patologického haplotpu slouží genotyp zdravého bratra zemřelého probanda N?5 247J242 17 137 137 haplotyp v asociaci s neznámou mutací Legenda RFLP18 STR24 Retinoblastom O O Provedena mutační analýza genu Rbl • sekvenace kódující oblasti • sekvenace promotorové oblasti • MLPA pro detekci velkých delecí a duplikcí • metylační analýza Nebyla detekována patologie v genu Rbl tinoblast Musm gnos Používány polymorfní místa •extragenová (DS13S 1307, DS13S 272, DS13S 164) •intragenová (RM.20B) [A1] + [A2] [A3]MA4] [A7] + [A8] [A5] + [A6] 13S 1307 113S 1307 113S 1307 113S 1307 113S 1307 113S 1307 113S 1307 113S 1307 [141] DS [151] DS [139] DS [139] DS [139] DS [126] DS [126] DS [139] DS 13S 272 [133] 13S 272 [133] 13S 272 [127] 13S 272 [133] 13S 272 [131] 13S 272 [133] 13S 272 [129] 13S 272 [127] DS13S 164 [179] DS13S 164 [188] DS13S 164 [179] DS13S 164 [186] DS13S 164 [188] DS13S 164 [188] DS13S 164 [188] DS13S 164 [178] RM.20B [3] RM.20B [4] RM.20B [1] RM.20B [1] RM.20B [1] RM.20B [2] RM.20B [4] RM.20B [5] [A1] + [A3] [A6] + [A7] Nelze určit haplotyp v asociaci s patologií v RB1 genu Vysvětlení: • výskyt mutace v jiném systému regulace buněčného dělení a růstu (např. dráha pl4) • neheteditámí forma tetinoblastomu u obou bratranců ická diagnostika monoffenne dedičných rob Selekce embryí pro in vitro fertilizaci (IVF) pro páry s rizikem přenosu dědičné choroby na potomky Pro genetickou analýzu vhodné tři typy buněk / * 1. Polární tělíska odebrané ze stádia oocyt/zygota t 2. Buňky (blastomery) z embryí ve stádiu rýhování %/ 3. Buňky trofoblastu z blastocyst Monogenní choroby - metoda PCR Komplikace : ADO (alelic drop out) amplifikace jedné alely pod úrovní detekovatelnosti Minimalizace ADO protokol monitorující výskyt ADO: •multiplex PCR (koamplifikace mutace s polymorfními markery) •SSCPnebo DGGE analýzy ( detekující obě alely současně, potvrdí genotyp) •fluorescenčníPCR - redukuje výskyt ADO, detekce DNA fragmentu je až lOOOx citlivější ve srovnání s konvenční PCR technikou Preimplantační genetická diagnostika Nepřímá diagnostika Detekce mutace F508del v genu CFTR Multiplex PCR — koamplifikace lokusu mutace F508del s intf agenním mikřosatelitem IVS17bTA Kapilární elektřofotéza 1800 2B : 966/98 ivsl 7/proband / 966/98 ivs17/proband / 8B : dF508/nondF508 CFTR / dF508/nondF508 CFTR / 2R : 966/98 ivs 17/probind / GS500TAMRA / Genotyp blastomery: [F508del] + [=] Faktory, které ovlivňují spolehlivost nepřímého molekulárně genetického vyšetření 1. Spolehlivost klinické diagnózy Klinická diagnóza onemocnění musí být naprosto přesná. Je-li vyslovena špatná klinická diagnóza, uvedené molekulární vyšetření nemá smysl, protože se sledovala segregace markeru vázaného na gen, který nemá s chorobou nic společného. Výsledek molekulárního vyšetření je v tom případě nesmyslný a zavádějící. 2. Možnost rekombinace mezi markerem a genem Mateřská a otcovská chromozomální DNA se v průběhu crossing-overu "promíchá" v rámci homologních chromozomů. Pohlavní buňka pak nese nově "smíchanou" DNA - takto se vedle sebe mohou v gametě dostat informace, které spolu původně nesousedily Např. varianta markeru původně ležící v nebo v sousedství mutované alely na otcovské DNA se tímto "smícháním" octne v nebo v sousedství "zdravé" alely pocházející z mateřské DNA, neboť mezi ním a markerem došlo k rekombinaci. Pravděpodobnost rekombinace roste se vzdáleností mezi sledovaným markerem a genem. 3. Spolehlivost biologických vztahů v rodokmenu Biologické otcovství vyšetřovaných osob v rodokmenu musí souhlasit s údaji uvedenými v rodinné anamnéze, která je většinou sestavena na podkladě výpovědi probanda. Je-li zapotřebí vyšetřit široký rodokmen, proband nemívá o těchto citlivých údajích týkajících se rodičů, prarodičů nebo vzdálenějších příbuzných znalost. Někdy je jako vedlejší produkt nepřímého molekulárně genetického vyšetření odhaleno, že u některých osob nesouhlasí biologické vztahy v rodině. Někdy může tato souvislost zůstat nepoznána a může vést k falešnému výsledku. Cystická fibróza Nepřímá diagnostika O [F508]+[=] [A1]+[A3] [=]+[=] [A2]+[A5] [F508]+[=] [=]+[=] / [F508]+[G542X] [A1]+[A2] [A3]+[A5] / [A1]+[A1] K provedení r je u některých chorob nutné vyšetřit co největší okruh členů rodiny, tedy i zdravých, u kterých se nepředpokládá, že by mohli být nositeli patologie (partneři osob v riziku). Z praktického hlediska je to komplikované a někdy až nemožné, v některých rodinách se jejich členové ani příliš neznají a nemají ochotu podstupovat vyšetření kvůli probandovi, který jez jejich hlediska vzdáleným příbuzným. Nepřímá molekulárně genetická diagnostika má mnoho nevýhod a její význam postupně klesá s tím, jak se vyvíjejí možnosti přímého molekulárně genetického vyšettření. olekulárně genetická diag Problémy Vysoké náklady na molekulárně genetické vyšetření, velmi drahé používané chemikálie a přístrojová technika Při pozitivním nálezu znamená bolestnou zdravotní prognóz bez možnosti nápravy. Pacienta mŮZe eticky, sociálně i ekonomicky poškodit prozrazení jeho genetických údajů. Genetika prožívá svůj zlatý vě u toho