Počítání krevních buňek Bourková L., OKH FN Brno Hematologické analyzátory • každý má svá jedinečná specifika • dva základní principy měření: – optický – impedanční • z měření získáváme informace o: – počtu buněk (kvantitativní analýza) – velikosti, tvaru a složení buňky (kvalitativní analýza) • principy měření mohou být na jednotlivých analyzátorech různě kombinovány • různé kombinace pak umožňují různě přesnou kvantitativní i kvalitativní analýzu všech prošlých buněčných elementů Principy měření • absorbční spektrofotometrie • impedanční analýza – možné doplnění vysokofrekvenční analýzou • optická analýza – prošlého světla – rozptýleného světla – fluorescence cytochemická Používaná diagnostika • analýza nesrážlivé periferní krve – odběr do solí EDTA (K2+, K3+, Na2+) • ředící roztoky – impedanční analýza vodivý roztok + nevodivá buňka – optická analýza opticky inaktivní roztok + opticky aktivní buňka • lyzační roztoky hemolýza erytrocytů • barvící roztoky barvení obsahu buňky (granula, DNA, RNA) • čistící roztoky čištění měříciho systému Absorbční spektrofotometrie • Metoda slouží ke stanovování množství hemoglobinu ve vzorku. V dnešní době se již jedná většinou o bezkyanidové metody. Mikrohematokritová metoda • Centrifugační metoda v mikrohematokritových kapilárách pro stanovení PCV – (Packet Cell Volume), metoda je méně častá – většinou se vydává jako počítaný parametr (HCT=MCV x RBC) – nebo přímo měřený parametr odběr centrifugace Impedanční analýza - I • mezi elektrodami je v apertuře standardní vodivost (standardní vodivost diluentu) • při průchodu buňky aperturou se vodivost naruší/změní  impedanční impulz (odpor) • četnost impulzu  počet buněk velikost impulzu  velikost buňky Impedanční analýza - II • využívá se hydrodynamická fokusace: unášení jednotlivých buněk proudem kapaliny • měření může být doplněno například vysokofrekvenční analýzou: na stejnosměrné elektrické pole → superponováno vysokofrekvenční elektrické pole → pronikne cytoplazmou → pak se změří vysokofrekvenční vodivost buňky → ta odpovídá její fyzikálněchemické struktuře (kvalitativní analýza buňky) Hydrodynamická fokusace 000 Customer Training odynamic Focusing Hydrodynamic Focusing with Diluent Sheath 8psi Cells Aperture two columns of different events the diluted sample y flow of cells sing zone d into single sensing zone effects ng dynamically nges measured cell through the nerates a pulse termined from ude ated from moving Impedanční analýza Optická analýza • využívá se hydrodynamické fokusace • využívá se průtoková cytometrie: – každá buňka je ozářena laserovým paprskem – po interakci buňky s paprskem se provádí analýza – analyzuje se samostatně každá buňka v suspenzi • detekuje se – prošlé světlo – rozptýlené světlo – fluorescence Optická analýza ngle Polarised Scatter paration (MAPSS) ZE OMPLEXITY BULARITY RANULARITY Analýza prošlého světla • Detekce paprsku ve směru 0° udává hodnoty: – počet prošlých buněk – velikosti jednotlivých buněk Analýza rozptýleného světla • Detekce depolarizovaného (rozptýleného) paprsku v různých detekčních úhlech. • Analýza může být doplněna cytochemickým barvením buněk. • Měření slouží k detekci tvaru a velikosti buňky, jádra a granularity cytoplazmy Analýza fluorescence • Obarvení buňky speciálními barvami → ozáření buňky laserovým paprskem. • Absorbce světla buňkou → emise světla o vyšší vlnové délce → detekce emitovaného světla • Detekce: DNA, RNA nebo povrchové antigeny (CD znaky). Analýza fluorescence CELL-DYN ® 4000 Customer Training Fluorescence Red fluorescence is a measurement of the amount of DNA stained by the dye. Axial light loss (0º) measures cell size. NRBC WBC Cytochemická analýza • v buňkách (WBC) je barvena peroxidáza např. Sudanovou černí • cytochemická analýza je vždy kombinovaná současně s jinou analytickou metodou (optickou)