Principy vyšetření hemostázy, preanalýza Trombóza - Hemostáza - Krvácení Fyziologie krevního srážení Základní homeostatický mechanizmus Spolupůsobení různých systémů včetně regulačních zpětných vazeb ^ Cévní stěny ^ Trombocytů ^ Plazmatické koagulační faktory ^ Plazmatické inhibitory ^ Systém fibrinolytický Dělení testů Testy globální ^ postihují celý systém (i více) Testy skupinové (screening) ^ postihují určitou část koagulačního systému ^ umožňují odlišení poruch vnitřní a vnější cesty a přeměny fibrinogenu Testy speciální ^ vyšetřují jednotlivé složky systémů Dělení testů dle principu Koagulační Fotometrické Imunochemické Tlirbidimetrické (jiné než koagulační, imunochemické) Sledování času rozpuštění koagula Sledování rozpustnosti koagula Jiné Dělení testů dle principu Koagulační ^ sledování času srážení manuálně (kývání, rotace) aktivovaná doba srážení sledování času vytvoření fibrinového vlákna manuálně (háčkování) koagulometr (poloautomat, automat) • mechanické • kuličkové (sledování změn pohybu kuličky) • háčkové • optické • nefelometrie (sledování rozptylu světla) • turbidimetrie (sledování průchodnosti světla) Dělení testů dle principu Fotometrické ^ sledování změn zbarvení v důsledku štěpení specifického chromogenního substrátu - detekce absorbance (A) end point" (A) kinetické (AA/min) ^ limitace -hemolytické a ikterické vzorky Turbidimetrické (jiné než koagulační, imunochemické) ^ sledování změn zakalení detekce změn transmise (propustnosti T) detekce změn absorbance ^ limitace- chylózní vzorky Chromogeny Chromogenní substrát ^ uměle připravený velkoobjemová aminokyselinové bezJ)arvý koncovka raménko zakončené paranitroanmd Argininem n Argininem n Chromogeny Princip ^ enzymy štěpí substrát - vzniká žluté zbarvení ^ měříme při 405 nm [j;jríjrjji;rD5jrjjJjj"j Kinetické měření 1 min čas měření (min) Dělení testů dle principu Imunochemické ^ sledování reakce antigénu s protilátkou aglutinace • LIA • ELISA EID Aglutinační metody sledování aglutinace viditelných částic s navázanou protilátkou proti vyšetřovanému antigénu odečítání makroskopicky pozitivní( +, ++, +++)/negativní ^ semikvantitativní metody (udaná mez detekce) metody ^ latexaglutinační (např. FDP, D-Di) hemaglutinační (např. FM) Příklad vyšetření D-Dimerů Mez detekce = 0,5 mg/l neředěný vzorek vzorek ředěný 1:6 výsledek aglutinace < 0,5 mg/l aglutinace + > 0,5 mg/l a < 3,0 mg/l aglutinace + + > 3,0 mg/l Liquid immunoassay - LIA metody Sledování aglutinace m i kro latexových částic s navázanou protilátkou proti vyšetřovanému antigénu Odečítání optickým systémem koagulometru Změna zakalení (AA/min) Kvantitativní metody (např. D-Di, vWF:Ag...) Limitace Chylozita vzorku ^1 Hookův jev (vysycení protilátky antigenem) LIA testy Provedení (STA© Liatest© D-Dimer) 50 \i\ vzorku 100 \i\ pufru inkubace 240 s 150 ml latexového měříme činidla změnu absorbance mezi 12 s-140 s Princip metody - schéma A540 Reaction buffer 00 ul Latex suspension 50 4 minutes 37°C 60 120 180 Monitorování změny absorbance po dobu 140 s při 37° C -Time (sec.) > Odečítání koncentrace sTfR LIA testy Kalibrace Sigmoidní ^ Křivka 3. řádu ^ Minimálně 5 bodů Platí pro celou šarži ELISA metody -^Stanovení antigenu(Ag)pomocí protilátky (Ab) značené enzymem (AbE) - kvantitativní ^ inkubace vzorku v mikrotitračních jamkách s navázanou Ab proti vyš. Ag - vazba Ag na Ab ^ odsátí vzorku + promytí inkubace AbE v jamkách - vazba na Ag odsátí AbE a promytí ^ detekce enzymatické aktivity komplexu Ab-Ag -AbE po přídavku chromogenního substrátu (A) přímá úměra: enzym, aktivita x množství Ag Elektroimunodifúze - EID metody vyšetřovaný antigén reaguje s protilátkou přítomnou v agarózovém gelu při elektroforéze za vzniku precipitačního píku ■Adélka píku je přímo úměrná koncentraci antigénu kvantitativní metoda Princip EID kalibrace vzorky pacientů Vyšetření plazmatických proteinů Vyšetření funkční aktivity koagulační metody fotometrické metody Vyšetření antigénu ^ imunochemické metody ^ umožňují odlišení defektů kvalitativních kvantitativních Správnost laboratorních výsledků Faktory objektivní subjektivní Faktory ^ preanalytické *i analytické ^ postanalytické Preanalytické faktory Příprava pacienta Odběr vzorku Transport vzorku Zpracování vzorku Skladování vzorku Příprava pacienta Odběr na lačno nebo po lehké snídani bez tuků * Dostatečný příjem tekutin Uvedení času odběru Uvedení léčby Uvedení komplikace při odběru Odběr vzorku Minimální zatažení paže ->Do plastikových nebo silikonovaných skleněných zkumavek První 2-3 ml nelze použít ■^Antikoagulační roztok pro nesrážlivou krev-citrát sodný v ředění 1:10 Šetrné promíchání krve s citrátem (5-1 Ox) Nedostatečné promíchání krve s citrátem Nebezpečí aktivace a srážení vzorku Koncentrování citrátu u hladiny 5 automaty pipetují těsně pod hladinou naředěnou plazmu s nadbytkem citrátu 5 špatné výsledky ověření po stažení plazmy a promíchání Antikoagulancia Citrát sodný 0,109 mol/l (3,2 %) doporučeno * 1,129 mol/l (3,8%) -»CTAD zkumavky ^ brání aktivaci trombocytů doporučeno pro testy PAI-1, heparin, PF4. Správný odběr vzorku Vyřadit vzorky -^Sražené -^S chybným objemem krve (rozdíl 10%) Hemolytické, ikterické a chylózní ^ hemolytický a ikterický vzorek ovlivňuje výrazně fotometrická stanovení >l chylózní vzorek ovlivňuje výrazně koagulační stanovení na optických koagulometrech a imunochemická stanovení vyhodnocovaná opticky Správný odběr vzorku Množství krve *Méně ^ prodloužení koagulačních časů APTT citlivé od 90 % objemu PT citlivé od 80 % objemu ^ zkrácení koagulačních časů?? Správný odběr vzorku Hematokrit 30 % nebo >60 % upravit objem citrátu 100 - hematokrit ml citrátu - ================== x ml plné krve 595 - hematokrit Transport vzorku -»Čas Teplota Mechanické vlivy (potrubní pošta) Zpracování vzorku Odstranění krevních buněk centrifugací Stažení plazmy Většina testů do 1 -4 hod po odběru * Výjimka EGT, EF (15 - 30 min), heparin, PAI-1, LA, vyšetření fcí trombocytů Vyšetřovaný materiál Plazma 5 plazma bohatá na trombocyty centrifugace 10 minut 150 - 250 g, sedimentace 5 plazma chudá na trombocyty centrifugace 15 minut 2500 g ^ bezdestičková plazma dvojnásobná centrifugace (ultracentrifugace) Plná krev Sérum Centrifugace Výpočet otáček pro danou centrifugu *g = 1,118 x 105x rx N2 r = poloměr otáčení v cm, N = otáčky/min Příklad: r = 15 cm, 2500g 3860 otáček/min Skladování primárních vzorků * Laboratorní teplota 18 - 25 °C a PT 6 hodin a APTT 4 hodiny ^ APTT (léčba heparinem) 1 hodinu a Ostatní vyšetření: 4 hod Vyšší teplota ne Uložení v lednici (aktivace FF VII a XII) ne Zamrazování vzorků Plazma chudá na destičky/bezdestičková ^ Objem > 500 ul Zkumavka se zátkou Správná velikost zkumavky Zkumavka naplněná do 3/4 Rychlé zamrazení (-70 °C, -196 °C) ■^Sskladování zamrazených vzorků krátkodobé -20 °C, dlouhodobé: - 70 °C Rozmrazování vzorků *Při 37 °C 15 minut Dobře promíchat Opakované zamrazení není možné Analytické faktory Dodržování metodických postupů Správné pracovní návyky Správná funkce a kalibrace přístrojů Výběr diagnostických setů a reagencií Správná volba kalibračních a kontrolních materiálů Správně provedená kalibrace a kontroly kvality Postanalytické faktory Rozmezí fyziologických hodnot Terapeutické rozmezí Vyjadřování výsledků Vyhodnocení výsledků Interpretace výsledků