Speciální koagulační vyšetření II Přirozené inhibitory Antitrombin Systém PC/PS (ProC Global) Protein C Protein S APC-rezistence Antitrombin Vyšetření funkční aktivity fotometricky (IIa, Xa) Vyšetření antigenu u vrozených defektů EID, ELISA Systém proteinu C XIIa FVIIa-TF XIa FVIIIi FIXa FVIIIa FVIII FX FXa FX FVi FVa FV FII FIIa fibrinogen FIBRIN Ca2+ TM PC APC PS Protein C Vyšetření funkční aktivity koagulační metody fotometrické Klinický význam - snížení Normální hodnoty 60 - 130 % Vyšetření antigenu u vrozených defektů EID, ELISA Protein C – koagulační metoda Stanovení prodloužení koagulačního času (APTT) způsobené inaktivací F VIIIa a Va aktivovaným proteinem C. Postup ředěná vyšetřovaná plazma + aktivátor proteinu C neředěná protein C deficitní plazma APTT reagencie, inkubace CaCl2 stanovení koagulačního času odečtení funkční aktivity z kalibrační křivky lin/lin závislost vyjádření výsledku % normálu Protein C- fotometrická metoda Sledování vzniku zbarvení v důsledku štěpení specifického chromogenního substrátu aktivovaným proteinem C. Postup ředěná vyšetřovaná plazma + aktivátor proteinu C specifický chromogenní substrát sledování vzniku zbarvení  kineticky ( A/min) „end point“ (A) odečtení funkční aktivity z kalibrační křivky lin/lin závislost vyjádření výsledku % normálu Protein S Vyšetření funkční aktivity koagulační metody Klinický význam - snížení Normální hodnoty muži 65 - 140 % ženy 50 - 140 % Vyšetření antigenu - volný, celkový LIA ELISA EID Protein S – koagulační metoda Stanovení prodloužení koagulačního času (PT) způsobené inaktivací Va systémem PC (PS + aktivovaný PC). Postup ředěná vyšetřovaná plazma neředěná protein S deficitní plazma aktivovaný PC PT reagencie stanovení koagulačního času odečtení funkční aktivity (%) z kalibrační křivky lin/lin závislost Rezistence na aktivovaný PC = snížená antikoagulační odpověď na aktivovaný PC (APC)  Popsána v r. 1993 Dahlbäckem  Příčinou vrozené APC-R je ve většině případů Leidenská mutace faktoru V (FVL) Bertina 1994 Rezistence na aktivovaný PC Příčiny získané APC-R mohou být zvýšení aktivity faktoru VIII lupus antikoagulant těhotenství, hormonální substituce (včetně HAK) antikoagulační léčba významné defekty proteinu C a S nesprávné zpracování vyšetřované plazmy Možnosti vyšetření APC - rezistence  Vyšetření fenotypu koagulačními metodami  Vyšetření genotypu molekulárně genetické stanovení FVL Koagulační vyšetření APC - R  Vyšetření prodloužení koagulačních časů po přídavku APC vyšetření dvou koagulačních časů na principu aPTT nebo RVVT s přídavkem a bez přídavku APC (+ korekce FV deficitní plazmou) vyšetření jednoho koagulačního času s využitím jiných aktivátorů (hadí jedy) s přídavkem APC, F V deficitní plazmy APC-R (APTT, RVVT) umožňují průkaz vrozené i získané APC-R Vyjádření výsledku poměr R t (s APC) R = ------------------- (norma např. > 2,0) t (bez APC) normalizovaný poměr nR R vzorku nR = ------------ R normálu Koagulační stanovení ovlivněné celou řadou faktorů APC-R (APTT,RVVT) diluce F V deficitní plazmou V poměru 1:5 (1 díl vyš. plazmy+4 díly F V def. plazmy) Citlivost testu pouze k vrozeným nebo získaným defektům F V Diluce a vyjadřování výsledku v nR zajišťuje téměř 100% citlivost pro F V Leiden APC-R (jiné aktivátory, jeden koagulační čas) využívají hadí jedy (např.Crotalus viridis Helleri, který je přímým specifickým aktivátorem faktoru X) výsledek je vyjadřován pouze jako koagulační čas normální hodnoty: časy > cut off (např.120 s) test je citlivý pouze k F V Leiden a event. jiným vrozeným, případně získaným defektům faktoru V test není ovlivněn antikoagulační léčbou, defekty proteinu C/S, přítomností LA, zvýšením F VIII ProC Global globální funkční test stanovení antikoagulační kapacity systému PC nejen APC-R Použití ke screeningu vrozených i získaných poruch Princip test na bázi APTT s použitím hadího jedu (Agkistrodon contortree), který aktivuje endogenní PC přítomný v testovaném vzorku sleduje se prodloužení APTT indukované aktivovaným endogenním PC ProC Global - výsledky Vyšetření dvou koagulačních časů PCAT aPTT v přítomnosti aktivátoru proteinu C PCAT0 aPTT bez aktivátoru proteinu C Výsledek - normalizovaný poměr (NR)  vztažení poměru časů R ke standardě ProC Global - výpočet PCAT NR = ---------- x KF PCATO PCAT stand.plazmy KF = SV/ -------------- PCATO stand.plazmy KF - kalibrační faktor SV - citlivost standardní plazmy ProC Global Normální hodnoty NR > 0,8 Předpokládá se, že snížení poměru je v závislosti na riziku trombózy v důsledku inhibitoru heparinu ve reagencii je test necitlivý na přítomnost heparinu < 0,8 j./ml v plazmě test je však ovlivněn kumariny ProC Global Test je citlivý na defekty v systému proteinu C (95 %) Leidenská mutace faktoru V (100 %) defekt proteinu C (85 %) defekt proteinu S (56 %) Zachycuje vrozenou i získanou APC-R I samotná pozitivita PCG (bez známé příčiny) zvyšuje riziko VT (4x) Vhodný test pro screening trombofílie nikoli jako diagnostický test Diagnostika APC-R - závěr Diagnostika APC-R musí zahrnovat Nejen mol. biologické vyšetření F V Leiden, Ale také vhodná koagulační vyšetření k průkazu získané APC-R a ostatních vrozených APC-R, které se dosud běžně nevyšetřují Testy k diagnostice vWF  doba krvácení  PFA  APTT  F VIII:C (funkční aktivita)  funkční aktivita vWF (vWF:RCo)  antigen vWF (LIA, ELISA, EID)  agregace po ristocetinu  kolagen vazebná kapacita vWF  F VIII vazebná kapacita vWF  multimerní struktury vWF  molekulární diagnostika Ristocetin kofaktorová aktivita vWF vWF:RCo slouží k posouzení na trombocytech vázaných funkcí vWF v primární hemostáze využívá schopnosti vWF shlukovat trombocyty v přítomnosti antibiotika ristocetinu detekce metodou agregační aglutinační optickou na koagulometrech Ristocetin kofaktorová aktivita vWF Použití komerčních setů (většinou) obsahující lyofilizované normální promyté trombocyty + ristocetin Sledování změn po přídavku vyšetřované plazmy chudé na destičky (zdroj vWF) Agregační metoda vWF:RCo Princip sledování změn transmise světla v agregační kyvetě, obsahující suspenzi trombocytů a ristocetinu, po přídavku vyšetřované plazmy (PPP), registrované v podobě agregační křivky Vyhodnocení maximální změny transmise/min a odečtení hladiny VWF:RCo z kalibrační křivky (lin/log závislost) Vyjádření výsledků v % normálu Agregační metoda vWF:RCo Destičkový agregační test využívající suspenzi zdravých promytých destiček v přítomnosti antibiotika ristocetinu a vWF pacienta v podobě plazmy chudé na destičky (PPP) Aglutinační metoda vWF:RCo Princip sledování aglutinace v suspenzi trombocytů a ristocetinu po přídavku titrované ičkové vyšetřované plazmy (zdroj VWF) na skleněné desce Vyhodnocení makroskopické odečtení posledního titru při kterém ještě nastává aglutinace, vynásobení titru udanou citlivostí Vyjádření výsledků v % normálu (semikvantitativně např. >16% a < 32%) Agregace po ristocetinu (RIPA) Princip destičkový agregační test v plazmě bohaté na trombocyty (PRP) pacienta v přítomnosti antibiotika ristocetinu použití různých koncentrací ristocetinu  z důvodu detekce zvýšené citlivosti vWF pacienta na nízkou koncentraci u typu 2B vWF choroby Vyhodnocení maximální amplituda A max (%) strmost křivky (%/min) Korekce normální PPP při  RIPA 4 díly PRP pacienta + 1 díl PPP normálu Kolagen vazebná kapacita vWF Princip vazba vWF na koňský kolagen navázaný na stěnách mikrotitrační desky následná detekce vázaného vWF enzymatickou imunochemickou reakcí (EIA) Vyhodnocení odečtení absorbance Vyjádření výsledku v % normálu odečtením z kalibrační křivky Faktor VIII vazebná kapacita vWF Princip vazba vWF na stěny mikrotitrační desky potažené monoklonální protilátkou eluce F VIII pacienta inkubace s definovaným množstvím rekombinantního faktoru VIII detekce vázaného F VIII na vWF chromogenní metodou Vyhodnocení odečtení absorbance Vyjádření výsledku v % normálu odečtením z kalibrační křivky Multimerní analýza Princip detekce multimerní struktury vWF elektroforéza vzorku v SDS-agarózovém gelu specifická detekce autoradiograficky Western blot Význam vyšetření odlišení různých typů a podtypů vWF choroby Molekulární analýza detekce specifických genetických defektů vWF řetězovou polymerázovou reakcí a mutační analýzou Testy fibrinolytického systému Rutinní testy euglobulinová lýza D-Dimery FDP Speciální testy (aktivita - fotometricky, antigen - ELISA, EID) plazminogen () a-2-antiplazmin () PAI-1() tPA () TAFI () Diagnostika krvácivých stavů Screening poruch primární hemostázy a vWF v systému koagulačních faktorů v systému fibrinolýzy Speciální testy primární hemostáza vWF systém koagulačních faktorů systém fibrinolýzy Diagnostika trombofilních stavů Vyšetření hyperkoagulace nutné provedení speciálních testů k vyšetření jednotlivých trombofilních markerů zkrácení časů APTT (málo citlivé) v porovnání s předchozím výsledkem za vyloučení arteficiálního ovlivnění při odběru vyšetření molekulárních markerů D-Dimery - aktivace koagulace i fibrinolýzy – sledování dynamiky změn kvantitativně FPA, F1+2, TAT - aktivace koagulace – metody ELISA nejsou dostupné statim Trombofilní markery Defekty systémů  Přirozených inhibitorů krevního srážení  Koagulačních faktorů  Fibrinolýzy  Trombocytů Přítomnost protilátek Nespecifických (LA) Specifických (inhibitor PC, PS, F V, AT..) Defekty inhibitorů krevního srážení Antitrombin Systém PC/PS Protein C Protein S APC-rezistence TFPI Defekty koagulačních faktorů Zvýšená hladina Faktor VIII Faktor XI, IX, II, VII, fibrinogen Dysproteinémie Fibrinogen,… Defekty fibrinolýzy PAI Plazminogen Faktor XII Dysfibrinogenémie TAFI Defekty trombocytů Hyperagregabilita trombo Samovolná agregace Agregace – nízké koncentrace ADP, Epi Aktivace trombocytů molekulární markery PF4, bTG - ELISA