Adobe Systems Adobe Systems
Moderní metody analýzy genomu
- aplikace
Mgr. Nikola Tom
Brno, 24.3.2014

Možnosti aplikace NGS
•SNV (single nucleotide variant)
•InDel (krátké inzerce a delece)
•Strukturalní varianty (dlouhé inzerce delece, translokace, inverze, atp.)
•CNV (copy number variation)
•Analýza genové exprese
•De novo assembly
•Epigenetika
•Metagenomika

DNA sekvenování
•Whole genome re-sequencing
•Targeted re-sequencing
•De novo assembly

Whole genome re-sequencing
•< 1000 $ (Illumina HiSeq X)
•Resekvenační microarrays
    (1 milion variant – 500 $)

Asociační studie
•GWAS (genome-wide association study)
–hl. SNP ve spojitosti se určitým fenotypem
–Analýza komplexních onemocnění,  predikce, prognóza, perzonalizovaná medicína, preventivní
medicína, vývoj léčiv
–Case – control studie
•HapMap Project (detekce haplotypů)
•1000 genomes (SNP nad 1 %)

Targeted re-sequencing
•Sekvenování vybrané oblasti (target enrichment)
–exom
–chromozóm
–gen
–exon
•Využití multiplexování (amplikony, vzorky)
•Nižší cena
•Vyšší citlivost
•Diagnostika i výzkum

Target enchrichment
•Hybridizace
–Na čipu
–V roztoku (levnější, vyšší uniformita pokrytí, méně vstupního materiálu)
•PCR (vhodná pro obohacení menších genomových oblastí – geny, skupiny genů)
–Klasická PCR
–Mikrofluidní (Fluidigm, Raindance)

Hybridizace v roztoku
•Magnet
•Protilátky

Deep sequencing
= sekvenování s vysokým pokrytím
= určitý region je sekvenován ˃ 100x
•Senzitivita dána chybovostí enzymů
•Analýza somatických mutací a polyklonálních nádorů (detekce klonů s výskytem < 1 %)
•Klonální evoluce
•Solidní tumory

Zkušenosti
•Whole genome (SOLiD 5500, ABI)
•Exomové sekvenování u CLL pacientů (SOLiD 5500, ABI)
•Panel genů u pacientů s Duchenova muskulární dystrofie (GS Junior, Roche)
•Deep sekvenování p53 u CLL, CML pacientů (Miseq, Illumina)

RNA sekvenování
•Analýza hladiny exprese
•Alternativní splicing
•Postranskripční změny
•Genové fúze
•Mutace v transkriptech
•De novo assembly

RNA sekvenování
•Transkriptomové sekvenování
–Single end (kvantifikace)
–Paired end (struktura transkriptů)
•Tag sekvenování
–3´ tagy (kvantifikace bez informace o struktuře)
–5´ tagy (identifikace cílů miRNA = degradome sequencing)
•Sekvenování krátkých RNA
–Identifikace a kvantifikace miRNA, tRNA

Analýza exprese
•Analýza exprese konkrétní alely (GWAS) – muže být rozdíl od genotypu
•Množství mRNA nekoreluje s hladinou proteinů
•Místo a čas specifické
•Chybí info o intronové sekvenci (regulatorní fce)
•Náročnost bioinformatického zpracování a interpretace (biologická, klinická a regulatorní funkce)
•Data storage, speciální algoritmy (mapování)
•Cena

Izolace RNA
•mRNA
•Oligo-dT
–3´ konec
•Hexamer priming
–5´ konec
•ncRNA
•PolyA selekce vs. rRNA deplece
–Zastoupení non-polyA (non-coding) RNA
•Podle délky z gelu (miRNA, tRNA)

Izolace mRNA



Zkušenosti
•miRNA (SOLiD 5500)


Epigenomika
•Reverzibilni změny DNA nebo histonů ovlivňující genovou expresi a regulaci bez změny struktury DNA
•Methylace DNA (v místě promotoru)
•Modifikace histonů

Metylace DNA
•MeDIP – imunoprecipitace methylované DNA
–Protilátka rozpoznávající Met-C
–Pozice metylovaných úseků DNA
•Bisulfite sekvenování
–Konverze C → U, Met-C se nemění
–Přesná identifikace jednotlivých metylovaných bazí

Modifikace histonů
•Detekce DNA sekvence s navázaným histonem