Elektroforeza Sekvenovani Molecular diagnostics for your routine Výsledek PCR Elektroforéza • V molekulární biologii se používá k separaci nukleových kyselin a bílkovin • Principem je pohyb nabitých molekul v elektrickém poli • Gelová, polyakrylamidová dráhy Obr. Schéma elektroforetickej separácie (vľavo) a gél pod UV svetlom (vpravo) Elektroforéza Arne Tiselius Švédský chemik Nobelova cena v roce 1948 za objev elektroforézy a adsorpční analýzy Princip elektroforézy • Principem metody je pohyb záporně nabitých molekul DNA v elektrickém poli směrem k anodě. • Hlavním nositelem náboje nukleových kyselin jsou záporně nabité fosfátové skupiny. • Separace molekul DNA podle jejich velikosti. Nosiče Agaróza Agarosa je získávána z mořských řas Je to lineární polysacharid Polyakrylamid Polyakrylamidový gel vzniká polymerací akrylamidu s příměsí bisakrylamidu, který umožňuje zesíťování lineárních vláken a vytvoření prostorové struktury. Nosiče • Agarózovýgel • Snadná příprava • Velké rozmezí velikostí molekul DNA, které je možné na agaróze dělit • Vysoká cena • Přírodní produkt, jednotlivé šarže i od stejného výrobce se mohou trochu lišit a poskytovat odlišné výsledky. • DNA izolovaná z agarózového gelu může být kontaminovaná látkami (např. sacharidy, ionty kovů), které mohou inhibovat následně prováděné reakce (reštrikční štěpení) • Polyakrylamidovýgel • Pracnější příprava • Třeba dávat větší pozor při manipulaci, protože akrylamid a N,N'-metylenbisakrylamid jsou vysoce toxické a kumulují se v organismu • Vysoká rozlišovací schopnost (0,2%), tj. dokáže rozlišit např. DNA o délce 500 bpod DNA 501 bp • Dokážou pojmout mnohem větší množství DNA než agarózové gely bez ztráty rozlišení • DNA izolovaná z polyakrylamidového gelu je vysoce čistá a může být použita i pro velmi náročné molekulárně-biologické techniky (např. mikroinjekce DNA do myších embryí). Elektroforetické pufry • Elektroforetické mobilita DNA je ovlivněna složením a iontovou silou elektroforetického pufru • V nepřítomnosti iontů je elektrická vodivost velmi nízká a DNA putuje velmi pomalu, proužky jsou rozmazané. • TAE, TPE, TBE (tris-borát, kyselina boritá a EDTA) Horizontální gel Vertikální gel Barvení gelu ks Ethidiumbromid (2,7-diamino-10-ethyl-9-fenyl-fenanthridiniumbromid) - mutagen SYBR Green Barvení stříbrem - polyakrylamidové gely Nanášecí pufr • Nanášecí pufry plní tři role: 1) Zvyšují hustotu nanášeného vzorku, který ochotněji klesá ke dnu startu. 2) Svou barvou usnadňují nanášecí proces. 3) Během elektroforézy indikují přibližnou polohu jednotlivých fragmentů DNA._ Hmotnostní standard Nanáší se do jedné jamky gelu pro odhad velikosti pozorovaných DNA fragmentů Má definované velikosti jednotlivých fragmentů Příslušenství • K dosažení maximálního rozlišení fragmentů DNA větších než 2 kb, napětí by nemělo přesáhnout hodnotu 5 V/cm. Zviditelnění gelu směs fragmentů DNA různé velikosti £Z -i—■ "O CO cš o "O (1) d veli i—■ CO VZG e elektroforetický gel dlouhé fragmenty krátké fragmenty Sekvenování CGATTAAAGATAGAAATACACGATGCGAGCAATCAAATTTCATAACCTCACCATGAGTTTGATCCGAAGCGATTAAAGATAGAAATACACGATGCGAGCAATCAAATTTCATAACCTCACCATGAGTTTGATCCGAAG • Cílem je stanovení primární struktury neboli pořadí nukleotidů v molekulách DNA • Znalost sekvence DNA je rutinně používána pro odvození aminokyselinové sekvence • Původně 2 metody: Maxam-Gilbertovo sekvenování a Sangerovo sekvenování • Dnes již více metod-next generation sequencing Maxamovo-Gilbertovo sekvenování • Podstatou je specifické rozštěpení molekuly DNA chemickými činidly v místech, kde je lokalizovaná báze určitého typu • Výchozí materiál-jednořetězcová DNA, označená na jednom konci radioaktivní značkou • Podmínky reakce-poškození pouze jedné báze v řetězci (dimethylsulfát, hydroxid sodný) • Výsledkem modifikace je vytvoření křehkého místa v řetězci DNA, které je citlivé na štěpení • Potom je DNA vystavena piperidinu, což vede k rozštěpení řetězce v zesláblých místech • Odečtení sekvence v denaturujícím polyakrylamidovém gelu • Není rutinně používáno-data nejednoznačná, vysoká úroveň radioaktivity Maxamovo-Gilbertovo sekvenoväni 1. Pnmer for replication Strand to be sequenced 2. Prepare four reaction mixtures; include m each a drfferent replication-stopping nucleotide Pnmer Primer ~^^^^^t*£ 3. Replication products of "C" reaction 4. Separate products by gel electrophoresis Sequence of interest C M »I v CO CACTJ Read seqence as complement of bands contammQ labeled strands A T i ■ _ • — AOC GGA TOC — AOC - VI i TOT — AOC — TOC - VI, CVlA — . ,1 ,1 1UO AM - 1,1,. — AOC ton tAOT TOO — VI* l— IGT 4 -.,-.„■. II, I I El 743 A 1 ■ I, I I, I I <: ■< «, IJI«S47I«I0 1I Sangerovo sekvenování • Enzymová metoda • Využívá biologického procesu replikace DNA s radioaktivně značenými 2',3'dideoxyribonukleosidtrifosfáty - inhibitor (terminátor) syntézy DNA • Elektrozoréza v polyakrylamidovém gelu DNA polymeráza při náhodném začlenění dideoxy analogu nemůže dále syntetizovat => vznik fragmentu separace těchto fragmentů na polyakrylamidovém gelu s následnou autoradiografickou detekcí sekvenovaný úsek DNA ddATP ddCTP ddTTP ddGTP i 3'-GAATTCATTCGCCAT-51 5'-CTTAAGTAAGC, / t pnmer syntetizovaný reaKceve fragment směsi s ddCTP 5'-TAAGCGGTA-3' \ 3'-ATTCGCCAT-5' Sangerova metoda • místo radioaktivního značení (32P) použita fluorescenční detekce • dnes nej používanější metoda • reakční směs: - fluorescenčně značený primer (4 směsi => 4 značky) - DNA-polymeráza - 2'-deoxyribonukleosidtrifosfáty - jednotlivé směsi obsahují navíc příslušné 2:,3'-dideoxyribonukleosidtrifosfáty (menší množství, asi 1%) Sangerova metoda Strand to be sequenced primed dna Prepare lour reaction mixtures; include in eacri a diltůnent replication-stopping nucleotide Prima* ^*5<^ftůpllcaBun products dt "G" ioacBon Separata products by gal elecbrophorasis Raad sequence as t ^Sov ' comptement ol bands a containing lahelad strands Automatická Sangerova metoda • Využívá fluorescenčně značené terminátory | | | | |TGCAAATCGGTGTAAA T"TTTTtgcaaatc | | | | |TGCAAAT I I I I ITGCA 11111 fTGCAAATC fTGCAAATCG Automatická Sangerova metoda • Separace jednotlivých fragmentů pomocí kapilární elektroforézy Automatická Sangerova metoda • Sekvenace jednotlivých DNA fragmentů. Možnost paralelní sekvenace • max. 96 sekvencí v jednom běhu (96 kapilařové sekvenátory) • Délka získané sekvence cca 650 bp. • Max. sekvenační výtěžek jednoho běhu cca 60 kb Sekvenování nové generace Sekvenování nové generace • Fragmentace DNA. • PCR se provádí paralelně pro všechny fragmenty DNA nebo není třeba. • Paralelní sekvenování několika miliónů sekvencí. • Délka získaných sekvencí cca 50 - 600 bp. • Sekvenační výtěžek jednoho běhu několik až několik tisíc Gb (o 4 až 6 řádů vyšší než u kapilárního sekvenování). • Cena sekvenace za bázi o řád až dva nižší než u kapilárního sekvenování. Pyrosekvenování Monitorování aktivity DNA polymerázy pomocí bioluminiscence syntéza nových sekvnencí DNA s různou detekcí nukleotidů bez elektroforézy přítomno spousta enzymů - DNA polymeráza - ATP sulfuryláza - luciferáza - apyráza substráty - adenosinfosfosulfát - luciferi n přidávají se nukleotidy postupně d ATP, dGTP, dCTP, dTTP za sebou detekce uvolnění světla {i jeho intenzita) po uvolnění pyrofosfátu při začlenění konkrétního nukleotidu na konci spotřeba ATP luciferázou k oxidaci luciferinu a degradace přidaného nukleotidu Polymerase .GATCÄCCTGAAGTCÄGCCCTTG. d AT P PPi ATP (d)XMP TCAGTCGGGAAC... ATP-sulfurylase https://www.youtube.com/watch?v=nFfgWGFeOaA 454 sekvenovani FLX System • 1 million of reads/run • 400-650 bp/read GS Junior • 0.1 millions of reads/run • 400 bp/read SOLEXA(lllumina) 2007 můstková „bridge" PCR sekvenování pomocí DNA syntézy 1. PREPARE GENOMIC DNA SAMPLE 2. ATTACH DNA TO SURFACE 3. BRIDGE AMPLIFICATION Randomly fragment genomic DNA and ligate adapters to both ends of the fragments. Adapter Bind single-stranded fragments randomly to Add unlabeled nucleotides and enzyme to the inside surface of the flow cell channels. initiate solid-phase bridge amplification. 4. FRAGMENTS BECOME DOUBLE STRANDED r \ v_J The enzyme incorporates nucleotides to build double-stranded bridges on the solid-phase substrate. 5. DENATURE THE DOUBLE-STRANDED MOLECULES r \ V_J Denaturation leaves single-stranded templates anchored to the substrate. 6. COMPLETE AMPLIFICATION i i v_) Several million dense clusters of double-stranded DNA are generated in each channel of the flow cell. 7. DETERMINE FIRST BASE 8. IMAGE FIRST BASE 9. DETERMINE SECOND BASE First chemistry cycle: to initiate the first sequencing cycle, add all four labeled reversible terminators, primers and DNA polymerase enzyme to the flow ceH. After laser excitation, capture the image of emitted fluorescence from each cluster on the flow cell. Record the identity of the first base for each cluster. Second chemistry cycle: to initiate the next sequencing cycle, add all four labeled reversible terminators and enzyme to the flow cell. 10. IMAGE SECOND CHEMISTRY CYCLE 11. SEQUENCE READS OVER MULTIPLE 12. ALIGN DATA CHEMISTRY CYCLES r G I I GCTGA... . GCTGATGTGCCGCCTCACTCCGCTGG CACTCCTGTGG CTCACTCCTGTGG -»OCTGATGTGCCACCTCA GATGTGCCACCTCACTC GTCCCCCCTCAC1CCTG CTCCTGTGG Unknown tanan SNPrakd After laser excitation, collect the image data as before. Record the identity of the second base for each cluster. Repeat cycles of sequencing to determine the sequence of bases in a given fragment a single base at time. Align data, compare to a reference, and identify sequence differences. SOLEXA lllumina sequencers umina MiSeq lllumina GAIIx lllumina HighSeq 4 millions reads/run 300 millions reads/run 1500 - 3000 millions reads/run 150 bp/read 150 bp/read 100 bp/read Next generation sequencing Microarrays • Skleněná nebo silikonová destička s miliony jednořetězcových DNA oligonukleotidů • PCR + Hybridizační reakce na čipu • Affymetrix, Agilent Technologies, Eppendorf či lllumina Princip Microarrays https://www.youtubexom/watch?v=9U-9mlOzoZ8 DNA micro array making Microscope glass slides c o ate d with p olyly s ine \ + 6116 Yeast ORFs amplified byPCR I Spotting (deposit) Hybridisation Strain 1 Strain 2 RNA extraction 1 1 11 mRNA 11 i reverse II & I ▼ transcription ▼ Results delivery Scanning (lecture) Results analysis Využití čipů v mikrobiologii • 12 virových agens způsobující onemocnění horních cest dýchacích • Čipy na chřipku • HPVčip • Genotypizace HCV • TruArray MRSA (Akonni) Děkuji za pozornost Mass sequencing by Viktor S. Poór