Buněčná biologie, nádorová transformace, onkogeny a supresorové geny Buněčný cyklus • interval mezi dvěma děleními buňky – kontinuální růst buňky – nesouvislé dělení buňky • podobné mechanizmy u všech eukaryot – od kvasinky po člověka – konzervované proteiny regulující buněčný cyklus • Howard a Pelc – rostlinné buňky – 50. léta 20. stol. • 4 fáze: G1, S, G2, M – buňky, které se nedělí setrvávají v G0 fázi – interfáze = G1 + S + G2 Fáze buněčného cyklu G0 fáze Klidová fáze – zastavení cyklu. Trvalá (buňka se už nikdy nedělí) nebo dočasná (po příslušném signálu - např. růstový faktor pokračuje v cyklu). G1 fáze Od ukončení do začátku replikace DNA. Buňka roste (syntéza proteinů a RNA), zvyšuje se počet buň. struktur (ribozomy, mitochondrie, ER). Nejvariabilnější část buň. cyklu. Hlavní kontrolní bod cyklu. S fáze Replikace DNA, syntéza histonů. U dané buňky je trvání konstantní. Po skončení je v jádře dvojnásobné množství DNA. G2 fáze Růst buňky – syntéza RNA, proteinů a tvorba buněčných struktur. Kontrolní bod. M fáze Vlastní rozdělení buňky. Kondenzace chromozomů, rozpad jaderné membrány, tvorba mitotického aparátu. Konec syntézy RNA a nízká proteosyntéza. Kontrolní bod. Studium buněčného cyklu - historie • je DNA syntetizována pouze v určité fázi buněčného cyklu nebo konstantně celý cyklus? • buňky kořene cibule – na mikroskopické sklo, inkubace s 32P, převrstvení fotografickou emulzí a inkubace ve tmě – vyvolání emulze – mikroskop – buňky, ve kterých došlo k replikaci DNA jsou „označené“ (cca. 20% interfázních buněk) – výpočet délky S fáze (Pelc – Heredity – 1953) Mitóza • kontinuální proces, konvenční dělení: – profáze • kondenzace chromozomů, tvorba vřeténka – metafáze • chromozomy v ekvatoriální rovině vřeténka, oddělují se chromatidy – anafáze • dceřinné chromozomy putují k pólům vřeténka – telofáze • tvorba membrán dceřinných jader, vřeténko mizí, dekondenzace chromozomů – cytokineze • zaškrcení a rozdělení buňky na 2 dceřinné pomocí kontraktilního prstence (mikrofilamenta z aktinových vláken) Mitóza Mitóza Meióza • specializované buněčné dělení – z 1 diploidní buňky vznikají 4 haploidní gamety • první meiotické dělení • druhé meiotické dělení • abnormální meióza – nondisjunkce = homologní chromozomy se neoddělí – někt. gamety pak postrádají chromozom, u jiných naopak přebývá (př. Downův syndrom) Mitóza vs. meióza Regulace buněčného cyklu • synchronizace dějů v buňce • série biochemických změn, každá z nich vyvolá specifickou změnu na úrovni buňky – změny jsou binární (zapnuto/vypnuto) – kontrolní systémy jsou robustní, spolehlivé a adaptabilní • komplexní síť regulačních proteinů, které řídí průběh buněčného cyklu – reagují na velikost buňky, replikaci genomu a extracelulární signály – zajišťují, že je DNA zdvojena v cyklu pouze jednou a že buňka bude po replikaci rozdělena Regulace buněčného cyklu • přechody mezi jednotlivými fázemi buněčného cyklu jsou striktně regulovány a uskutečňují se podle určitého genetického programu • kontrolní body – G1 (hlavní kontrolní bod) • spuštění syntézy DNA po dosažení určité velikosti buňky – G2/M • kontrola replikace DNA – spuštění mitózy – M • kontrola mitotického dělení – spuštění cytokineze • jsou-li aktivovány, zablokují průchod buněčným cyklem – dočasně nebo trvale – v někt. případech je spuštěna apoptóza Kontrolní body buněčného cyklu Regulace buněčného cyklu Aktivace kontrolního bodu v G1 Modely buněčného cyklu • domino – následující událost nezačne před předcházející • budík – existuje nezávislý měřič času, který řekne, kdy se má spustit další fáze • skutečnost – kombinace obou – domino • mitóza nezačne před úplnou replikací DNA – budík • buněčný cyklus je ovlivněn také faktory vnějšího prostředí Cykliny • katalytické podjednotky aktivních komplexů cyklincyklin-dependentní kináza (CDK) – 8 cyklinů (A-H) – nemají enzymovou aktivitu • jejich buněčná hladina výrazně osciluje během buněčného cyklu vlivem transkripční regulace a různě rychlé degradace proteinu – změna koncentrace vede ke změně aktivity příslušné CDK Cykliny • v komplexu s CDK určují jejich substrátovou specifitu • různé varianty cyklinů v různých fázích cyklu – G1 – cykliny D1, D2 a D3 – přechod G1/S – cyklin E – později cykliny A a B Cyklin-dependentní kinázy • enzymy fosforylující specifické cílové proteiny – výsledkem je většinou aktivace těchto proteinů – malé proteiny (34- 40 kDa), serin/threonin proteinkinázy – aktivní pouze v komplexu s příslušnými cykliny – struktura • kinázová podjednotka – katalytická funkce • cyklin – regulační funkce a změna konformace CDK na aktivní formu • živočišná buňka – min. 9 typů (CDK1-CDK9) • CDK1 – pravděpodobně jediná nepostradatelná CDK – schopna zajistit průběh všech fází buněčného cyklu – některé specializované buňky potřebují i jiné CDK – některé typy nádorových buněk jsou zcela závislé na další CDK (např. CDK4) • ačkoliv buňky, ze kterých vznikají, ne (buňky normální mléčné žlázy vs. buňky karcinomu prsu) – terapeutický potenciál? Profil CDK v průběhu buněčného cyklu Inhibitory cyklin-dependentních kináz • vazbou na CDK tlumí její aktivitu • protein p21 – vazbou na E/CDK1 zabrání vstupu do S fáze – intenzivně syntetizován při poškození DNA • vazba na CDK a přerušení buněčného cyklu • buňka může uskutečnit reparaci • inhibiční účinek p21 navozen nahromaděním aktivního proteinu p53 Geny účastnící se regulace buň. cyklu • protoonkogeny – regulují transkripci genů, jejichž produkty (cykliny a CDK) se podílí na řízení cyklu – geny myc, fos a jun – myc gen • vazba růstového faktoru na receptor – přenos signálu do jádra, nárůst koncentrace proteinu myc, pak pokles (negativní zpětná vazba) • překonání G1 kontrolního bodu • zvýšená exprese myc – deregulace proliferace • potlačení exprese myc – buňky se nedělí ani v přítomnosti růstových faktorů • tumor-supresorové geny – jejich produkty se uplatňují při inhibici proliferace a růstu buněk – podílí se na zastavení cyklu především v G1 – jejich inaktivace způsobuje nekontrolované dělení buňky – Rb protein • hl. negativní regulátor buněčného cyklu, řídí přechod G1/S • aktivita řízena de-/fosforylací (pomocí CDK4/6 + cyklin D) • mutace RB vede k retinoblastomu (nádor sítnice) – p53 – inhibitory cyklin-dependentních kináz – pro-apoptotické • Bcl Protein p53 • gen TP53, chromozom 17p13.1 • jaderný protein (53 kDa) – aktivní jako fosforylovaný tetramer, transkripční faktor • negativní regulátor přechodu G1/S – zvyšuje expresi inhibitorů b. cyklu • p21 – aktivuje reparaci DNA • zvyšuje expresi GADD45 – excizní oprava DNA – indukuje apoptózu • při neúspěšné reparaci • inaktivace obou alel u řady nádorů – karcinom tlustého střeva, prsu a plic • aktivován poškozením DNA – ionizující záření, mutageny Rb protein (kontrolní bod Rb/E2F G1) Regulace buněčného cyklu Nádory - terminologie • nádor – patologický útvar tvořený tkání, jejíž růst se vymkl kontrole organizmu – benigní • roste ohraničeně a metastázy nezakládá – maligní • ničí okolní tkáně a zakládá metastázy • novotvar • nádor – primární • vzniklý prvotně v určitém orgánu – sekundární • metastázy Benigní vs. maligní nádory benigní maligní charakteristika buněk diferencované, připomínají buňky, ze kterých vznikly nediferencované buňky, anaplazie, atypická struktura rychlost růstu většinou progresivní, pomalý různá, závisí na stupni diferenciace způsob růstu expanduje aniž by invadoval do okolních tkání, většinou s obalem invazivní růst, výběžky infiltrují okolní tkáň metastázy bez metastáz metastázuje do různých částí těla Kmenové buňky • kmenové buňky – sebeobnova – schopnost diferencovat v různé buněčné typy Koncept nádorové kmenové buňky Jsou nádory mono- nebo polyklonální? Charakteristiky nádorových buněk • abnormální a rychlá proliferace • ztráta diferenciace = anaplazie – morfologické změny buněk • často aneuploidie • atypické mitotické figury • pleomorfizmus — variabilita velikosti a tvaru buněk a jádra • grading nádorů – cytologický/histologický • podle stupně diferenciace a počtu proliferujících buněk • čím jsou buňky podobnější normální tkáň tím nižší grade Normální vs. nádorová tkáň Patomorfologické vyšetření • typing – histologická klasifikace, určení typu nádorového procesu – klasifikační schéma – ICDO kód • grading – stupeň diferenciace – zásadní vliv na léčbu – různá schémata pro různé typy nádorů • Gleasonovo skóre • staging – anatomický rozsah choroby – TNM klasifikace • popis primárního nádoru – podle velikost a bariér, které růstem překonal • popis uzlinových metastáz – počet a lokalizace postižených uzlin • popis vzdáleného metastatického postižení TNM klasifikace Změny u nádorových buněk • genetická nestabilita – častá aneuploidie – intrachromozomální • inzerce, delece, amplifikace – mikrosatelity – bodové mutace • nezávislost na růstových faktorech – růst nádorových buněk v médiu bez séra • ztráta kontaktní inhibice – vysvětlení • ztráta soudržnosti a adheze – uvolnění povrchových buněk nádoru – kadherin-katenin-aktin • regulace migrace, apoptózy a buněčného cyklu • méně E-kadherinu na povrchu buňky Změny u nádorových buněk • „přichycení k okolí“ – oddělení normální buňky od ostatních nebo od ECM vyvolá apoptózu • anoikis – neplatí pro nádorové buňky • komunikace mezi buňkami – změny proteinů gap junctions • délka života – u normálních buněk je počet dělení omezen • 50 při in vitro kultivaci – nádorové buňky se dělí bez omezení • delší telomery, více enzymu telomerázy • exprese antigenů – často antigeny embryonálních buněk tkáně, ze které jsou odvozeny Změny u nádorových buněk • tvorba enzymů, hormonů a dalších látek – degradační enzymy – tvorba hormonů – produkce látek s prokoagulačním působením • změny cytoskeletu – abnormální intermediální filamenta, aktinová filamenta nebo mikrotubuly Srovnání normální a nádorové buňky Metabolizmus normální a nádorové buňky Invazivita a metastázování • šíření do tělních dutin – často do peritoneální • spojeno s akumulací tekutiny • metastáza – vznik sekundárního nádoru v místě vzdáleném od primárního nádoru – často jsou zachovány charakteristiky primárního nádoru – někdy jsou detekovány dříve než primární nádor – nádor ledviny – metastázy v plicích • šíření nádorových b. – lymfou – krví • GIT, pankreas a slezina – krev do jater • sentinelová uzlina – první spádová lymfatická uzlina v daném směru od zhoubného nádoru • někdy metastázy ve vzdálených místech – vhodné mikroprostředí • transferin v plicích Mechanizmy nádorové metastázy Mikroprostředí nádorové buňky Růst nádoru • závisí na – počet dělících se buněk – trvání buněčného cyklu – poměr zaniklých a nových buněk • nádory – více dělících se buněk • růstová frakce – dělící se b./b. v klidové fázi • detekce nádoru – od velikosti 1 cm • 109 buněk – po 35 děleních 1012 b. • dostatečné k usmrcení Molekulární patogeneze nádorů - geny • protoonkogeny – kódují normální buněčné proteiny • růstové faktory, jejich receptory a signální molekuly, transkripční faktory podporující růst b. • C-myc – mutací vzniká onkogen • zvýšená aktivita • tumor-supresorové geny – mutace snižující jejich aktivitu podporuje vznik nádoru – RB gen • normálně brání dělení – TP53 • normálně spouští apoptózu je-li poškozena DNA Aktivace onkogenu • různé genetické změny – bodová mutace • Ras – chromozomální translokace • Burkittův lymfom – protoonkogen c-myc z chrom. 8 na chrom. 14 do blízkosti genu pro těžký řetězec Ig • chronická myeloidní leukemie – translokace 9, 22 – vzniklý hybridní onkogenní bcr-abl podporuje proliferaci b. • genová amplifikace – receptor 2 pro lidský epidermální růstový faktor (HER-2/neu) • často amplifikovaný u nádorů prsu • Herceptin – monoklonální protilátka proti HER-2 Aktivace onkogenu chrom. translokací Chronická myeloidní leukemie Burkittův lymfom Inaktivace tumor supresorového genu • protein p53 – mutovaný u nádorů plic, prsu a kolorekta • dvou zásahová hypotéza karcinogeneze – první a druhý zásah • úplná ztráta funkce – dědičná forma RB • mutace od rodiče – ve všech buňkách těla • druhý hit postihne buňku retiny • ztráta heterozygozity – sporadická forma • 2 mutace musí postihnout jednu buňku Vznik retinoblastomu Epigenetické mechanizmy • změna genové exprese bez změny DNA • mechanizmus inaktivace – metylace DNA • může představovat 1. zásah • léky s hypometylačním efektem – azacitidin, decitabin – myelodysplastický syndrom - léčba Molekulární a buněčné dráhy Poruchy reparace DNA Defekty signálních drah růstových faktorů • mutace v genech kontrolujících signalizaci růstového faktoru • př. CML – mutace protoonkogenů kontrolujících tyrozin kinázy Další dráhy • abnormální apopóza – Ras – mutace TP53 – TRAIL – stabilizace mitochondrií – metylace kaspázy 8 – NF-κB – Bcl-2 (antiapoptotický efekt) • abnormální stárnutí – telomeráza Aktivovaná angiogeneze • ↑ tvorba angiogenních faktorů • ztráta angiogenních inhibitorů – p53 – regulace trombospondinu-1 • Bevacizumab – protilátka proti VEGF – léčba CRC, nádorů ledviny, prsu, plic aj. Mikroprostředí • různé buněčné typy – makrofágy, fibroblasty, endotelie, b. imunitního systému • extracelulární matrix • různé mediátory – cytokiny, chemokiny, hormony Karcinogeneze • stadia – iniciace • expozice karcinogennímu agens • ireverzibilní – promoce • reverzibilní – progrese Rizikové faktory - dědičnost • predispozice popsána u 50 typů nádorů • rakovina prsu – BRCA1 (breast carcinoma 1) – BRCA2 (breast carcinoma 2) – „lifetime“ risk (85 let) – 80 % – zvýšené riziko rakovina vaječníků, prostaty, pankreatu, CRC a jiných • někdy autozomálně dominantní dědičnost – RB – 30 % dědičných Další rizikové faktory • imunitní systém – ↑ incidence nádorů u lidí s imunodeficitem i u transplantovaných s imunosupresivní léčbou – také u starších lidí • nádorové antigeny – u většiny nádorových b. • unikátní • vyskytující se i na normálních buňkách • hormony Rizikové faktory – chemické karcinogeny • karcinogeny reagují – přímo – nepřímo • prokarcinogeny (iniciátory) – indukce tvorby radikálů • ovlivnění replikace a kontroly buněčného cyklu – promotory • zesilují karcinogenicitu někt. látek • faktory životního stylu – kouření • prokarcinogeny i promotory • faktory životního stylu – dieta • aflatoxiny • polycyklické aromatické uhlovodíky – aktivovány při tepelné úpravě potravy • tuky, vláknina, červené maso • obezita, fyzická aktivita – alkohol • etanol – metylace DNA, metabolizmus retinoidů • acetaldehyd – bodové mutace Kouření jako rizikový faktor Rizikové faktory – onkogenní viry • u člověka 4 onkogenní DNA viry – HPV • 60 genet. rozdílných typů • typy 16 a 18 – cervical cancer – EBV – HBV – HHV-8 • 1 retrovirus – HTLV-1 Systémové projevy nádorů • obecné příznaky – subfebrilie a febrilie • produkce endogenních pyrogenů – Il-1, Il-6, TNF-α • přenastavení termoregulačního centra – prostaglandin E2 – nechuť k jídlu, úbytek hmotnosti • přenastavení centra sytosti v hypotalamu • zhoršená průchodnost GITu • změna prahu vnímání chutí • nádorová kachexie – nechutenství, ztráta hmostnosti – svalová atrofie – projevy snížené imunity • infekce – častější, závažnější, hůře a déle reagující na léčbu • hematologické příznaky – anemie – leukocytóza – trombocytóza – hyperkoagulace Paraneoplastické syndromy • příznaky nepravidelně doprovázející některé nádory • př. produkce ACTH – v buňkách bronchogenního nádoru – zvýšená tvorba adenomem hypofýzy