Průtoková cytometrie a stanovení lymfocytárních subpopulací Jana Nechvátalová Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně Cluster Designation (Cluster of Differentiation) •buňky exprimují ( vystavují) na svém povrchu různé specifické molekuly – znaky, které můžeme uspořádat do skupin charakterizujících buněčnou linii, stav diferenciace jednotlivé buňky a její aktivace • •CD klasifikace: znak definované struktury rozpoznatelný monoklonální protilátkou je zařazen do skupiny diferenciačních CD znaků a označen číslem (CD1, CD2, CD3,…). V současné době je na lidských leukocytech charakterizováno asi 400 znaků. • •Využití: CD znaky jsou používány k označení plně definovaných molekul. Molekuly zařazené do CD klasifikace jsou členěny podle funkce. Rozlišení adhezních membránových molekul, receptory pro rozmanité cytokiny, molekuly vyjádřené na T lymfocytech, B lymfocytech , trombocytech či jiných buněčných populacích. • • B lymfocyty CD19 CD20 CD19 Iga Igb T lymfocyty http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/6/62/Healthy_Human_T_Cell.jpg/220px-Healthy_Hum an_T_Cell.jpg http://www.cartage.org.lb/en/themes/sciences/lifescience/GeneralBiology/Immunology/Recognition/Tcel l/Tcellcomplex/Tcellcomplex.htm CD3 na povrchu všech T lymfocytů CD4 na povrchu TH lymfocytů (TH1, TH2) CD8 na povrchu TC lymfocytů Monocyty http://ww2.valdosta.edu/~dodrobin/2652/Bloodlab/Mono.JPG CD14 HLA DR -součástí nespecifické imunity -schopnost fagocytózy -tkáňová forma = makrofág NK buňky CD16+ CD56+ CD3- http://immuneresponse.wikispaces.com/file/view/killercell.jpg/228962966/458x323/killercell.jpg NKT buňky CD16+ CD56+ CD3+ Pozn. -rozeznávají buňky, které mají na povrchu abnormálně málo MHC I (= nádorové a virově infikované buňky) -používají cytotoxické mechanismy (perforin, granzymy) http://www.klinickalaborator.cz/upload/img/image005_2.jpg Pro stanovování lymfocytárních subpopulací odebírat krev do zkumavky s EDTA http://static.medixa.prod.fishcms.cz/media/image/2-lymfocyty.jpg Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 30min inkubace tma pokoj. teplota protřepat Mnoklonální protilátky •protilátky jsou produktem jediného klonu B lymfocytů (klony vzniklé fúzí buněk produkujících protilátky a myelomových buněk, jež schopnost produkce svého vlastního imunoglobulinu ztratily) • •jsou naprosto totožné a jsou přísně specifické proti jedinému epitopu Beckman Coulter Solastra Five-Color Reagent Panel http://vipdictionary.com/img/255px-Antibody.svg.png http://www.vesmir.cz/files/image/id/581 Roztok A: na 1,5 l destilované vody – 1,8 ml 99% kyseliny mravenčí Roztok B: na 1,5 l destilované vody 9,0 g bezvodého Na2CO3, 21,75 g NaCl, 46,95 g bezvodého Na2SO4 Roztok C: na 1,5 l PBS (pH 7-7,4) - 15 g paraformaldehydu LYZOVÁNÍ ERYTROCYTŮ Průtoková cytometrie FLOW CYTOMETRY http://img.medicalexpo.com/images_me/photo-g/flow-cytometer-75322-3239611.jpg Průtokový cytometr 1.FLUIDNÍ SYSTÉM 2.OPTIKA 3.ELEKTRONIKA http://www.cytovas.com/wp-content/uploads/2012/06/cytometer-labels.png 1.FLUIDNÍ SYSTÉM •Zajišťuje transport bb. •v nosné tekutině (pod tlakem) •do průtokové komory. Buňky se •pohybují jedna za druhou • •na základě hydrodynamické fokusace - nosná tekutina •(destil. voda, komerční tekutiny) bývá do komory přinášena tenkou •kapilárou pod větším tlakem než suspenze částic, které jsou tak •udržovány jen v úzké centrální části proudu. Zrychlení vznikající při •výstupu vodního paprsku z komůrky nutí částice pohybovat se jedna •za druhou. 15µm Velikost buněk: Forward Scatter Přímý rozptyl - úměrný velikosti buňky Granularita buněk: Side Scatter Boční rozptyl – indikátorem vnitřní buněčné struktury (granularity) •2. OPTIKA •Excitační část – laser •Sběrná část – systém čoček, zrcadel a optických filtrů zachycující fluorescenci částic vyzářenou po jejich projití světelným paprskem http://www.semrock.com/flow-cytometry.aspx •3. ELEKTRONIKA •Převádí optické signály (fluorescenci) na signály elektronické (fotonásobiče, fotodiody). •Po zesílení signálu a dalším zpracování dojde k jeho digitalizaci pro počítačovou analýzu Bllod Analysus Flow Cytometry http://healthcare.analog.com/static/imported-files/microsites/healthcare/pop_blood_analysis_fc.html Průtokový cytometr Laser Systém hnací tekutiny přináší vzorek do komory kde jsou buňky jedna po druhé vyšetřovány laserovým paprskem Zkumavka se suspenzí buněk Sběrná optika (čočky, zrcadla, filtry, světlovodná vlákna) třídí světelný signál Podle barvy se světlo a přivádí ho na jednotlivé detektory (Opto)elektronika převádí optický signál na elektrický, ten zpracovává a údaje jsou posílány do počítače Speciální počítačové programy umožňují zobrazit a vyhodnotit výsledky analýzy – každá vyšetřená buňka má přiřazené hodnoty parametrů (0 – max) a buňky jsou vyhodnocovány kolektivně, tedy jako populace Excitační optika (lasery, světlovodná vlákna, zaostřovací a tvarovací prvky) přivádí budící záření do komory lymfocyty monocyty granulocyty granularita •Fluorochromy: -Polycyklické organické molekuly a jejich deriváty • Fluorescein isothiokyanát (FITC), Cyaniny, Texas Red, řada Alexa, řada Pacific and Cascade, • AmCyan, Propidium iodide, 7-AAD, CFSE, -Fluorescenční proteiny • Phycoerythrins (PE), Allophycocyanin, PerCP, • GFP a jiné fluorescenční proteiny • •Schopné absorbovat fotony budícího záření (např. 488 nm) •a následně (10-8 s) emitovat fotony s •delší vlnovou délkou (v tomto případě 500 – 800 nm). •Fluorescenční světlo má tedy jinou barvu Fluorescence Emisní spektrum Absorbční spektrum Barva pohlceného a vyzářeného světla se liší Vlnová délka (λ) Stokesův posuv Energie (E) Fluorescence E = h.c/l Emitované záření má větší vlnovou délku a tudíž nižší energii -rozdíl mezi vlnovými délkami emisního a excitačního maxima (nm) Část energie se přemění na energii vibrační CD3 CD4 • • CD3+CD4+ CD3-CD4- CD3-CD4+ CD3+CD4- CD3 PC5 Krevní diferenciál Monocyty Granulocyty Lymfocyty Zkumavka A Zkumavka B Vyšetření lymfocytů periferní krve ZNAK EXPRESE FUNKCE ZASTOUPENÍ NA LYMFOCYTECH PERIFERNÍ KRVE (%) CD3 všechny T-lymfocyty asociován s TCR, přenos signálu 58-85 CD4 pomocné T-lymfocyty receptor pro MHC II, aktivace 30-60 CD8 cytotoxické T-lymfocyty receptor pro MHC I, aktivace 15-35 CD19 B-lymfocyty regulátor aktivace 7-23 CD16/CD56 NK-buňky FcR pro IgG/mediátor adheze 6-20 HLA-DR B-lymfocyty, monocyty, aktivované T-lymfocyty MHC II, prezentace Ag B-lymfocyty konstitutivně (na všech B-lymfocytech), T-lymfocyty 3-7 (na aktivovaných T-lymfocytech) Hodnocení nálezu jednotlivých subpopulací Snížení/ zvýšení subpopulace onemocnění ¯ CD19+, CD3+, CD4+, CD8+ při imunosupresi – např. cyklosporin (způsobuje lymfopenii) ¯ CD19+ u některých pacientů s CVID CD19+ B – buněčná leukémie ¯ CD3+ při expozici člověka toxickými chemikáliemi CD3+ T – buněčná leukémie ¯ CD4+ u některých pacientů s CVID (běžný variabilní imunodeficit – common variable immunodeficiency) - virové infekce (EBV, CMV, HIV) CD4+ autoimunity, alergie ¯ CD8+ autoimunity (roztroušená skleróza, systematický lupus erythematodes-SLE) CD8+ u některých pacientů s CVID - virové infekce (EBV, CMV, HIV) Příklady využití průtokové cytometrie v praxi Bronchoalveolární laváž (BAL) - imunofenotypizace při převráceném poměru CD4+/CD8+ - podezření na sarkoidózu Pacientka: Ž, *1957 •pacientka z revmatologie - léčba např. rituximabem způsobuje depleci B-lymfocytů (po 4-6 měsících návrat k normálním hladinám) Pacient: muž, * 1966 Leukémie -dovyšetřit CD5+CD19+ buňky CD5+CD19+ CD5+CD19+ : 94.8% Pacient: M, *1999 převrácený poměr CD4/CD8! CD4+ 13,2% CD8+ 50,9% virová infekce??? CD8+CD38+ 83,2% CD8++CD38++ 92,2% HLA-B27 asociace HLA-B27 s řadou nespecificky zánětlivých onemocnění, jako jsou záněty kloubů, vnitřních struktur oka (uveitida), krátkých kostí rukou, nohou a šlach, dále lupénka (psoriasis), vyrážek, chronické bolesti spodní části zad a spondyloarthropatie, z nichž nejznámější je ankylózující spondylitida (zánětlivé systémové onemocnění osového skeletu a kloubů - Bechtěrevova nemoc). negativní pozitivní Test aktivace bazofilů (bazotest) funkční test umožňující vyšetření aktivace basofilů po setkání se s určitým alergenem in vitro Obrázky převzaty z prezentace MUDr. Zity Chovancové PhD., FNUSA ÚKIA Brno na povrchu bazofilů - FcεRI (receptor pro IgE) - CD203c založen na expresi aktivačního znaku (CD63) na povrchu periferních bazofilů po jejich expozici alergenem in vitro ohraničíme subpopulaci bazofilů (IgE pozitivní) - sledujeme expresi CD63 (viz.obr.) a CD203c (není uvedeno) Sledujeme expresi CD63 na povrchu bazofilů negativní pozitivní http://www.deviantart.com/download/345357176/out_of_the_way__blood_cells__by_terminaitor-d5pm7aw.pn g