Chromatografie-I 2012 Chromatografie Petr Breinek Společným znakem všech chromatografických metod je kontinuální dělení složek analyzované směsi mezi dvěma fázemi. • Pohyblivá fáze (mobilní), eluent • Nepohyblivá fáze (stacionární) 80px-Chromatography_of_chlorophyll_-_Step_7 Výsledek chromatografie chlorofylu Princip chromatografického dělení • Koncentrace látky mezi těmito fázemi je definována distribučním koeficientem Kd = cs / cm • • Sloučeniny se dělí dle svých distribučních koeficientů pro zvolenou mobilní a stacionární fázi • Podle povahy mobilní fáze v Chromatografie plynová (GC; Gas Chromatography), v Chromatografie kapalinová (LC; Liquid Chromatography) Různá hlediska dělení chromatografie Podle způsobu provedení vKolonová (sloupcová) - stacionární fází (ukotvenou na vhodném materiálu) je naplněna skleněná či kovová kolona a mobilní fáze protéká kolonou pomocí gravitace nebo pumpy vPlošná (planární) vhodný materiál pro stacionární fázi (silikagel, Al2O3) je nanesen v tenké vrstvě na skleněnou, plastikovou nebo kovovou desku a mobilní fáze se pohybuje tenkou vrstvou pomocí kapilárních sil - tenkovrstevná chromatografie (chromatografie na tenké vrstvě, TLC), papírová chromatografie Podle principu separace • Rozdělovací • Adsorpční • Iontově výměnná (chemisorpční) • Gelová (sítový efekt) • Afinitní Podle účelu použití ü Analytická ü Preparativní Rozdělovací chromatografie je založena na různé velikosti rozdělovacích koeficientů dělených látek mezi dvěma nemísitelnými nebo omezeně mísitelnými kapalinami ·o separaci rozhoduje různá rozpustnost dělených látek v stacionární a mobilní fázi Kapalina 1 butanol Kapalina 2 voda C1 C2 + Z K = c1/c2 Adsorpční chromatografie je založena na rozdílných adsorpčních schopnostech jedné látky k povrchu druhé látky(adsorbentu) tvořící stacionární fázi ·stacionární fáze je adsorbent (sorbent) vPolární (např.silikagel, oxid hlinitý a křemičitý) vNepolární (např. aktivní uhlí) v Iontově výměnná chromatografie dělení látek je založeno na schopnosti výměny iontů na pevném nosiči (matrici) stacionární fází je iontoměnič (ionex ) vAnexy („přitahují anionty“) vKatexy („přitahují kationty“) v v mobilní fází jsou nejčastěji vodné roztoky Gelová chromatografie také chromatografie na „molekulových sítech“ dělení látek na gelu je založeno na velikosti molekul · ·stacionární fáze je neionizovaný přírodní nebo syntetický gel. Gelová C.PNG Afinitní chromatografie využívá vlastnosti biologicky aktivní látky vytvářet specificky reverzibilní komplex s jinou molekulou (chemická reakce). Stacionární fáze obsahuje zakotvené ligandy, na které se rozdělovaná látka váže. Jestliže jednu složku navážeme na vhodný nosič, potom můžeme druhou látku izolovat a kvantitativně stanovit. Např. antigen-protilátka, enzym-substrát,… Potom je zpravidla nutné změnit složení eluentu, aby nastala disociace komplexu a abychom získali přečištěný materiál. Typickým příkladem použití afinitní chromatografie je isolace albuminu z lidského séra. Afinitní chromatografie affinity-chromatography.gif llllllppppp Techniky úpravy vzorků • Extrakce kapalinou • Extrakce pevnou látkou (SPE) • Ultrafiltrace • Derivatizace • Extrakce plynem (headspace) • Adsorpce • Vymrazování vials-1a.jpg Příprava.jpg Planární (plošná) chromatografie TLC.png thin_layer_chromatography_1110.jpg Příklad: Papírová chromatografie Toxilab (Merck) Obr.3.1 Obr.3.2 Obr.3.3 Obr.3.4 Extrakce Napipetování extraktu Vložení terčíku filtr.papíru Odpaření extrakčního činidla Obr.3.5 Obr.3.6 Obr.3.7 Obr.3.8 Vložení terčíku na start Vyvíjení chromatogramu Fixace chromatogramu Barvení chromatogramu TLC_Toxilab 014 2 min 4 min 6 min 8 min Časový průběh vyvíjení chromatogramu Kapalinová chromatografie 1.Adsorpční 2.Rozdělovací 3.Iontově výměnná 4.Gelová 5.Afinitní Příklad Vysokoúčinná kapalinová chromatografie HPLC (High Performance Liquid Chromatography) HPLC – přístroj • HPLC%201200%20Series microHPLC HPLC – jednoduché schéma • hplc Eluční činidlo Pumpa až 350 barů Nanesení vzorku Kolona Detektor Odpad Převodník signálu Zapisovač • hplc2 Chromatografický proces Eluce látek v koloně Reverzní fáze = stacionární fáze je méně polární než fáze mobilní Typ eluce: vIzokratický vGradientový = v průběhu dělení se mění složení mobilní fáze Hlavní součásti kapalinového chromatografu Vysokotlaká pumpa (v případě gradientové eluce je nutná druhá pumpa a mísič) Injektor Dělící kolona Detektor Vyhodnocovací zařízení (zapisovač, PC, tiskárna) GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 022a Vysokotlaká peristaltická pumpa Instr Injektor – dávkovací zařízení Instr Dělící kolona • UV/VIS • Detektor s diodovým polem (DAD, Diode Array Detector) • Fluorescenční • Elektrochemický (coulometrický, ampérometrický,….) • Hmotnostní spektrometr (MS) Detektory Základní pojmy: Fáze Průtok (flow rate, ml/s) Retenční čas (minuty) Pík Výška píku; Plocha píku; Šířka píku Šum Drift Účinnost kolony Teoretické patro = minimální délka kolony nezbytná pro ustavení 1 cyklu rovnováhy mezi fázemi; 50 000 -100 000 teoretických pater na 1m délky Kvantifikace (vyhodnocení) 1.Přímé srovnání plocha nebo výška píku srovnání s kalibrátorem (externí standard) 2. Metoda vnitřního standardu plocha nebo výška píku srovnání poměru plochy nebo výšky píku stanovované látky s vnitřním a externím standardem 3. Metoda standardního přídavku Chromatografický záznam • MycophenolicAcid Příklad Analyzátor aminokyselin GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 022 Autosampler Mobilní fáze Ninhydrinové činidlo Kolona Detektor Pumpy GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 023 Autosampler GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 020 Kolona GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 017 Detektor- fotodioda Průtoková kyveta Zdroj-halogenová lampa Chromatogram-AK Plynová chromatografie (GC) Dělená směs musí procházet kolonou v plynném stavu! Plyn - Kapalina Rozdělovací Plyn - Pevná látka Adsorpční GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 011 Vyhřívaný prostor pro kolonu Autosampler GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 003 Kolona • Plamenový ionizační (FID) • Tepelně vodivostní (TCD) • Elektronového záchytu (ECD) • Hmotnostní spektrometr (MS) Detektory (u GC): Plamenový ionizační detektor (FID) Měření změny ionizačního proudu vodíkového plamene v důsledku přítomnosti iontů vzniklých při spálení a100105e Hmotnostní spektrometrie (MS) Analytická metoda sloužící k převedení molekul na ionty v plynné fázi ve vakuu a rozlišení těchto iontů podle poměru hmotnosti a náboje (m/z) Principem MS je pohyb iontů v elektrickém nebo magnetickém poli v závislosti na jejich hmotnosti a náboji • Hlavní součásti hmotových spektrometrů: •Iontový zdroj (destrukce molekul na fragmenty) •Hmotnostní analyzátor •Detektor dopadajících fragmentů Iontový zdroj Hmotnostní analyzátor Detektor Vzorek (vakuum) (vakuum) Magnetické pole Měření molekulové hmotnosti 1. Převedení molekul na ionty 2. Urychlení iontů z pohybu lze vypočítat poměr m/z 3. Detektor určí parametry dráhy iontů 4. Zpracování signálu a výpočet m/z 5. Ionizace a iontové zdroje v MS • Ionizace nárazem elektronů (EI) • Desorpce laserem (LD) - MALDI(matrix assisted laser desorption/ionization) - SELDI(surface enhanced laser desorption/ionization) • Elektrosprej (ESI) • Ionizace chemická, …. Hmotnostní analyzátory jsou tvořeny kombinací elektrických a magnetických polí nebo je separace založena na měření rychlosti iontů • Magnetické • Kvadrupolové • Iontové pasti • Průletové (TOF) • Tandemové (MS/MS) Hmotnostní spektrum