Optické metody Denzitometrie Reflexní fotometrie Denzitometrie lOptická metoda, která se zabývá měřením absorbance – vyhodnocení hustoty zbarvení v plošném uspořádání l lpřímá denzitometrie – v procházejícím světle (průhlednou podložkou) Denzitometr ØPřístroj, který slouží k vyhodnocení hustoty zbarvení v plošném uspořádání. Ø ØJedná se o postup, který je podobný l fotometrickému stanovení (liší se v uspořádání), zaznamenává měnící se hodnotu absorbance v závislosti na intenzitě zbarvení. Denzitometr lHlavní komponenty přístroje: l lZdroj světelného záření: halogenová žárovka lMonochromátor: interferenční filtry lDetektor: fotonásobič l Přímá denzitometrie lPrincip: lměření intenzity záření procházejícího průhlednou plochou, získává se grafický záznam fotometrovaného úseku. lJednotlivé frakce dělené směsi tvoří na záznamu v ideálním případě souměrné křivky zvonovitého tvaru. lPlocha těchto píků připadající jednotlivým frakcím, je úměrná relativnímu zastoupení jednotlivých frakcí v dělené směsi. lPoužití: při hodnocení elektroforeogramů l Denzitometr lElektroforeogram se automaticky posunuje nad štěrbinou, kterou prochází světlo zvolené vlnové délky (400-700 nm) lV místě frakcí dochází k částečné absorpci záření – to se projeví při dopadu na detektor lPo zpracování signálu integrátorem získáme číselné výsledky jednotlivých frakcí lNa jedné podložce je součastně vyhodnocováno až 30 elektroforetických drah Elektroforeogram – elektroforéza v plošném uspořádání na agaróze HYRYS 2 Denzitometr HYRYS (fy SEBIA) Význam denzitometrie lKvantitativní vyhodnocení jednotlivých frakcí získaných elektroforetickým dělením bílkovin v biologickém materiálu lVedle grafického výstupu (křivka elektroforeogramu) , vypočítává software denzitogranu procentuální zastoupení jednotlivých bílkovinných frakcí l Reflexní fotometrie Reflexní fotometrie lPrincip lměření intenzity záření odraženého od neprůhledné (homogenně zbarvené) podložky. Hodnotí se poměr intenzity dopadajícího světla a světla odraženého od barevné plochy lPoužití: suchá chemie, močová analýza, denzitometrické hodnocení tenkovrstevných chromatografů Reflexní fotometr l Přístroj slouží ke kvantitativnímu vyhodnocení reakcí probíhajících na pevné fázi. lPevná fáze slouží jako nosič obsahující činidla aktivovaná vodou obsaženou v naneseném vyšetřovaném biologické materiálu (krev, moč). lMěří se intenzita záření odraženého od homogenně zbarvené podložky.(matrice) Reflexní fotometr - pevná fáze (matrice) lČinidla jsou v reagenční zóně proužku impregnována vlákna proužku (fy Roche, Reflekton) l lČinidla jsou nanesena v reagenční zóně proužku jako vícevrstevný film (fy Kodak) l Reflexní fotometr lOdraz světla od reagenční zóny: lzrcadlový – na reflexní ploše zrcadla ldifuzní - je výsledkem interakce dopadajícího světla s molekulami reakční zóny zahrnuje i absorpci a rozptyl l l Hlavní komponenty reflexního fotometru lZdroj záření: lhalogenová lampa l xenonová výbojka lsvětloemitující dioda l l Hlavní komponenty reflexního fotometru lUlbrichtova koule (jako zdroj difuzního lsvětla): ldutá koule jejíž vnitřní povrch je potažen vysoce reflexním materiálem (síran barnatý). lSvětlo ze zdroje se po vstupu do koule mnohonásobně odráží od stěn a jako dokonale difuzní dopadá na reagenční plošku Hlavní komponenty reflexního fotometru lDetektor záření: luvnitř koule jsou umístěny dva detektory. lJeden měří světlo difuzně odražené od reagenční plošky a druhý je referenční l refl_fotometr urisys2400_new Reflexní fotometr pro chemické vyšetření moče pomocí diagnostických proužků