Fluorometrie, chemiluminiscence Miroslava Beňovská, Petr Breinek Luminiscence •Jev představující vyzařování přebytečné energie ve formě fotonů - dochází k němu při návratu excitovaných elektronů na základní hladiny •Emise světla vzniká následně po excitaci atomů působením jiného záření, elektronů nebo při chemické reakci apod. a po jejich návratu do základního stavu •Děj, při němž záření o kratší vlnové délce (větší frekvenci) vyvolává v látce určitého složení vznik záření o delší vlnové délce (nižší frekvenci) •Část energie se vyzáří ve formě tepla (nesvítivé deexcitační procesy) Luminiscence LUMINOFOR/ FLUOROFOR TEPLO Světlo Emitované záření LUMINISCENCE Excitační záření Jev, při kterém vzniká světlo (fotony) po předchozím dodání energie (excitaci) materiálu (luminoforu) Luminiscence je charakteristická svojí dobou trvání, která o několik řádů převyšuje doby života termálních kmitů (záření černého tělesa), t.j. tepelné záření není luminiscence! Druhy luminiscence Luminiscence vzniká po dodání energie v různé podobě •Fotoluminiscence – luminiscence je vyvolána elektromagnetickým zářením (zářivky) - do této kategorie patří fluorescence a fosforescence •Chemiluminiscence – luminiscence je vyvolána chemickou reakcíí (sem patří také bioluminiscence, kdy je emise světelného záření vytvořena živými organizmy – světlušky, medúzy) •Elektroluminiscence – luminiscence je vyvolána elektrickým polem (reklamní panely, nouzové osvětlení) •Katodoluminiscence – luminiscence je vyvolána dopadajícími elektrony (stínítko televizní obrazovky). •Termoluminiscence – luminiscence je vyvolána vzrůstem teploty po předchozím dodání energie •Radioluminiscence – luminiscence je vyvolána působením radioaktivního záření •Triboluminiscence – luminiscence je vyvolána působením tlaku (při deformaci tělesa) •Sonoluminiscence - vyvolána dopadem ultrazvuku Bioluminiscence v přírodě medúza Světlušky, medúzy, dřevokazné houby, hlubokomořské ryby,…… Jellyfish Fotoluminiscence •Podle délky trvání } fluorescence (10-9 -10-5 s ) • } fosforescence (10-2 s až dny) • •Dochází k ní vlivem absorpce energie dopadajícího světelného záření • •Pokud po odstranění zdroje ozařování rychle vymizí } fluorescence • •Pokud přetrvává (doznívá) i po odstranění zdroje ozařování } fosforescence Fotoluminiscence •X + hv ---- } X* + hν´ • X a X* je základní a excitovaný stav molekuly • hν a hν´ dopadající a emitovaná světelná energie •Emitovaná energie záření je nižší než energie dopadajícího (primárního) záření •Emitované (sekundární) záření má nižší frekvenci a delší vlnovou délku než světelné záření primární •Rozdíl mezi vlnovou délkou excitačního a emitujícího záření - Stokesův posun Fluorescence •Přechod mezi tzv. povolenými stavy atomu •K vyzáření fotonů dojde již za pár nanosekund (krátkodobé světélkování - 10-8 až 10-5 s). •Představuje sekundární záření po absorpci elektromagnetického záření Absorpční a fluorescenční spektrum • Posunuto k delším vlnovým délkám než původní absorpční spektrum (Stokesův posun) • Zaujímá zrcadlovou pozici Stokesův posun je rozdíl mezi vlnovou délkou excitačního (primárního) a emitovaného (sekundárního) záření Fluorimetr •Zdroj světelného záření (xenonová, xenonová-rtuťová oblouková výbojka, laser) •Monochromátor pro výběr excitačního záření •Kyveta (křemenné)/vzorek •Monochromátor pro sekundární (emisní) záření •Detektor (fotonásobič) · ☼ Mexctt Vzorek Memis D Přístrojová technika •Zdroje: xenonová oblouková výbojka • xenonová-rtuťová oblouková výbojka • laser •Kyvety: křemenné sklo • křemen •Detektor: fotonásobič • kolmo ke směru dopadajícího • primárního záření •Monochromátory •U imunoanal. metod se stejným fluorofem je nahrazuje: •Interferenční filtr propouštějící fluorescenční signál – fixní vlnová délka 12 Fluorescence Měření fluorescence •Fluorimetry •Spektrofluorimetry •Fluorescenční skenery •Fluorescenční mikroskopy •Průtokové cytometry Fosforescence •Přechod tzv. zakázaný. • •Při fosforescenci se fotony vyzáří, ale trvá to až několik minut (dlouhodobé světélkování 10-2 s až několik dní) • •Nemá v klinické laboratoři praktické využití Chemiluminiscence •Je luminiscence vyvolaná energií chemické reakce •Vzniká vyzářením fotonu z molekuly luminoforu po jeho chemické oxidaci působením oxidantů (H2O2, O2,…) •Dochází k produkci světelného záření exitovanými molekulami v průběhu chemické reakce •Chemiluminiscence v živých organismech - bioluminiscence •A + B à X* à P + hν • A a B jsou reaktanty, X* je excitovaný meziprodukt, P je produkt v základním stavu a hν je energie emitovaného světelného záření •Elektrochemiluminiscence - modifikace chemiluminiscence, luminiscence je generována chemickými reakcemi iniciovanými elektrochemicky • Luminometr •Skládá se z měrné komůrky a detektoru (fotonásobiče) •Měrná komůrka (cela) se vzorkem a ostatními reaktanty obsahuje systém zrcadel – soustřeďují světelné záření na detektor •Vznik záblesků světla - fotony •Počet fotonů zachycuje citlivý fotonásobič Fluorofory, luminofory •Fluoreskující látky obsahují konjugované dvojné vazby • •Spontánně fluoreskuje málo biologických molekul - tryptofan a porfyriny • •Luminofory produkují záření při chemických reakcích • •V imunoanalýze jsou fluorofory a luminofory navázány jako značka na protilátky či antigeny nebo tvoří substrát, eventuelně vznikají až po jeho rozštěpení • Fluorofory, luminofory – často jako značka v imunoanalýze •Příklady: • Akridin a jeho estery • Adamantyl dioxetan • Methylumbelliferon (MU) • Cheláty platinových kovů (ruténium) • Cheláty lanthanidů (europium) • Luminol, isoluminol • Fluorescein • Luminol (5-aminoftalhydrazid) luminol2 2H2O2 = 2 H2O + O2 (peroxidasa) Luminol + 2H2O +O2 ® aminoftalát + N2 +3H2O+ světlo (1928) – oxidace v bazickém prostředí Ester akridinu → Akridin + světlo Akridin phenyl ester Chemiflex™ (Abbott) Patentovaný ester akridinu akridinium(N-sulfonyl)karboxamid Sloučenina je velmi stálá Reakce: - oxidace v kyselém prostředí (pH=2; HNO3 a H2O2) - změna prostředí na zásadité (NaOH) - vznik nestabilní N-sulfonylpropylakridon v excitovaném stavu - při přechodu do stabilní formy se uvolní CO2 a energie v podobě světla (430nm) Využití luminiscence: Automatické imunochemické analyzátory •Spojení luminiscenčních technik a imunoanalýzy představují automatické imunochemické analyzátory •Na nich většina imunoanalytických metod v laboratorní medicíně •Uplatnění biochemie, sérologie, transfúzní stanice •Automatizace koncem 80. let •Uplatnění pro analyty s nízkou koncentrací (nmol/l, pmol/l) •Využití reakce antigen – protilátka •Značená protilátka (případně antigen) •Většinou heterogenní imunoanalýza (pevný povrch – paramagnetické částice, kulička) •Doba analýzy 15 – 60 min •Detekce s vysokou citlivostí (chemiluminiscence, elektrochemiluminiscence, fluorescence..) • • • • Jaká je výhoda při použití luminiscence? üImunoanalytické metody Vysoká citlivost metod Např. Kardiální markery (cTnI, cTnT, BNP, NT-proBNP) Hormony (TSH, FT4, hCG, testosteron, prolaktin, …) Léky (digoxin, gentamicin, …) Tumorové markery (PSA, CEA, CA 125, AFP, …) üChromatografie - detektor Luminiscenční •Lumino Immuno Assay (LIA) •Chemiluminescent Magnetic Immuno Assay (CMIA) •Immuno Lumino Metric Assay (ILMA) •ElectroChemiLuminiscence (ECL) Fluorescenční •Fluorescence Immuno Assay (FIA) •Fluorescence Polarization Immuno Assay (FPIA) •Dissociation Enhanced Lanthanide Fluoro Immuno Assay (DELFIA) •Time Resolved Aplified Cryptate Emission (TRACE) Citlivosti metod Metoda (g) EMIT 10-6 FIA, FPIA, EIA 10-9 RIA, REA, IRMA 10-12 LIA, ILMA 10-15 Světluška Princip: oxidace luciferinu luciferin Luciferin + ATP ® Luciferyl adenylát (enzym luciferáza) Luciferyl adenylát ® Oxyluciferin + AMP + CO2+ světlo Reakcí jedné molekuly luciferinu je produkován jeden foton o vlnové délce odpovídající namodralému světlu. Při reakci se pouhé 4 % energie mění na energii tepelnou a zbytek, tedy 96 % energie je vyzářen. Světluška je tedy daleko účinnější zářič než běžná výbojka, která má tento poměr 9:1 (tedy jen 10 % energie přechází na světlo). světluška Nositelé Nobelovy ceny 2008 za chemii Osamu Shimomura jako první izoloval zelený fluoreskující protein z medúzy Aequorea victoria (GFP) Martin Chalfie první prakticky využil fluorescenčního proteinu (značení neuronů pro hmatové receptory) Roger Y. Tsien objasnil fluorescenční mechanizmus GFP a různými modifikacemi rozšířil paletu barev emitovaného záření Použití GFP v chemii a biologii Lze připravit protein, který obsahuje sekvenci (např. Ser-Tyr-Gly) Sekvenci z DNA medusy, která je zodpovědná za tvorbu GFP lze vpravit do DNA jiného organismu, např. i savce... albagreen 30 FISH •Fluorescence In Situ Hybridization je cytogenetická metoda, která umožňuje detekci a lokalizaci konkrétních sekvencí DNA v chromosomech •Metoda je určená k mapování genů a sledování chromosomálních abnomalit, … •Pro detekci se využívá fluorescenční mikroskopie • AA4 „Není Fish jako FISH“ FISH - princip •Krátký jednovláknový (single stranded) úsek DNA, který je komplementární k hledané sekvenci, je označen fluorescenční značkou •V rozpletených úsecích DNA dochází k navázání na komplementární části •Dochází k nalezení a označení části sekvence, která kóduje zkoumaný úsek •