Optické metody (pokračování) – fluorescence, fluorimetrie



Luminisceční metody
lLuminiscence – je emise světla při návratu elektronu
lz excitovaného stavu na nižší energetickou hladinu
l
lDruhy luminiscence:
lFluorescence
lFosforescence
lChemiluminiscence
lVzájemně se liší:
lzpůsobem aktivace elektronu do excitovaného stavu
lzpůsobem vyzáření energie

Fluorescence
l druh luminiscence, u níž dochází k emisi světla v čase kratším než 10-8 s
lJe to emise elektromagnetického záření při přechodu mezi dvěma stavy téže multiplicity (obvykle
dvěma singlety)
lmolekuly absorbují světlo při jedné vlnové délce (excitační) a reemitují při větší vlnové délce
(emisní)

Fluorescence a fosforescence
l


Fluorofory
Přirozené fluorofory
•Tryptofan
•porfyriny
Analytické fluorofory
•Fluorescein
•Methylumbelliferon
•Methylumbelliferonfosfát (MUP)
•Cheláty lanthanidů (Europium)
- látky, které fluoreskují. Většina obsahuje konjugované dvojné vazby

Fluorescence
lPři excitaci se molekuly dostanou na vyšší energetickou hladinu a při návratu do základního stavu
se část energie vyzáří také ve formě tepla.
lProto má emitované záření fluoreskujících sloučenin vždy vyšší vlnovou délku (tj. méně energie)
než excitační záření, vyvolávající fotoluminiscenci
l

Fluorescence
lStokesův posun
lrozdíl mezi vlnovou délkou excitačního primárního)
la emitovaného (sekundárního) záření
l

Fluorimetrie
lPřístroje, které se používají k měření intenzity emisního záření se nazývají fluorimetry
l
l
☼
Mexcit
Vzorek
Memis
D

Fluorimetry
lZdroj světla:xenonová nebo xenono-rtuťová lampa (300-550 nm)
lMonochromátor pro výběr excitačního záření
lAbsorpční prostředí – křemíková kyveta
lMonochromátor pro sekundární emisní záření
lDetektor: fotonásobič, je umístěn pod úhlem 90ºvzhledem ke zdroji záření
l
l

Fluorimetrie
lImunochemické metody s fluorescenční detekcí
lIntenzita fluorescence je úměrná koncentraci fluoroforu
lMetody jsou řádově citlivější než měření absorbance (100-1000x)
lFluorescence je více specifická, protože existuje jen málo přirozených fluoroforů, které by mohly
způsobit interferenci

Fluorimetry
lAutomatizované imunoanalyzátory
lFluorescenční polarizované systémy – TDx, Imx
lDELFIA – imunoreagencie značené europiem
lPrůtoková cytometrie
l