Optické metody – emisní spektrofotometrie Mgr. Jana Gottwaldová Spektrofotometrie-rozdělení lPodle typu interakce elektromagnetického lzáření: l absorpční spektrofotometrii l emisní spektrofotometrii lTurbidimetrii, nefelometrii lLuminiscenční metody: fluorimetrie, fosforescence, chemiluminiscence l l l l l Spektrum lVlivem interakce elektrického záření a lanalyzované látky vzniká spektrum (kvalitativní lcharakteristika) lemisní spektrum = závislost intenzity emitovaného záření na vlnové délce labsorpční spektrum = závislost absorpce záření na vlnové délce l Emisní spektrofotometrie lPři této technice se měří emise záření. K emisi záření o charakteristické vlnové délce dochází při návratu elektronů z excitovaného stavu (vyvolaného budícím zdrojem) zpět do základního stavu. lPřístroje, které se používají k měření intenzity emisního záření se nazývají emisní spektrofotometry Absorpce vs. emise záření lEmise záření: Dodáním energie (např. kinetické, tepelné) jsou částice látky (složky studovaného vzorku) převedeny do vyššího energetického stavu. Při zpětném přechodu se energie vyzáří ve formě fotonu lAbsorpce záření: Částice látky absorbuje foton a přejde přitom do vyššího energetického stavu. (Návrat zpět do energeticky nižšího stavu již není sledován.) Kvantitativní charakteristiky emise lintenzita emitovaného záření (I) je přímo úměrná koncentraci (c) stanovovaného prvku: l I = k c (platí v omezeném rozsahu) lPlatí pro AES ICP, plamenovou fotometrii lVztah mezi signálem (emise – intenzita záření;) a koncentrací se určuje kalibrací Atom Symbol Atomové číslo orbita s orbita p orbita d orbita f Vodík H 1 1 Helium He 2 2 Lithium Li 3 2 1 Beryllium Be 4 2 2 Bór B 5 2 3 Uhlík C 6 2 4 Dusík N 7 2 5 Kyslík O 8 2 6 Fluór F 9 2 7 Neon Ne 10 2 8 Sodík Na 11 2 8 1 Hořčík Mg 12 2 8 2 Hliník Al 13 2 8 3 Křemík Si 14 2 8 4 Fosfor P 15 2 8 5 Síra S 16 2 8 6 Chlór Cl 17 2 8 7 Argon Ar 18 2 8 8 Draslík K 19 2 8 8 1 Vápník Ca 20 2 8 8 2 Energie emitovaného světla odpovídá rozdílům mezi možnými energetickými hladinami (základní a excitovanou) a závisí na uspořádání elektronů v atomových a molekulových orbitálech Emitované světlo má pro jednotlivé prvky charakteristickou vlnovou délku, která odpovídá určité barvě spektra záření Atomová emisní spektrofotomerie l lZákladním vybavením v AES je budící lzdroj, který dodává energii potřebnou pro lvyvolání emise záření atomy vzorku. Vzorek lpřevádí z tuhé fáze nebo roztoku do plynné lfáze, ve které nastane atomizace a excitace lelektronů. l Atomová emisní spektrofotomerie lRozdělení dle použitého budícího zdroje Ø ØPlamenová – nejčastější použití v KB Øjiskrový výboj Øobloukový výboj Øplazmový výboj l Metoda AES s indukčně vázaným plazmatem lPlazma vzniká působením vysokofrekvenčního elektromagnetického pole pomocí indukční cívky v prostředí argonu a její teplota je až 10 000 K. lPlazmový hořák je z taveného křemene a je chlazen argonem nebo dusíkem. Metoda AES s indukčně vázaným plazmatem Ø ØTato metoda dovoluje analyzovat vzorky v roztoku. ØRoztok je průchodem argonu nasáván do zmlžovače, kde se vytváří aerosol (jemné kapičky v plynu), který se zavádí do plazmatu, ØTam se vysuší, částice se vypařují, atomizují (štěpí na volné atomy) a ionizuje (štěpí na kationty a elektrony) Ø vzniklé částice (atomy a ionty, z nichž byl složen vzorek) jsou excitovány Ø excitované částice emitují (vyzařují) záření příslušných vlnových délek (vystupuje záření jen s takovými vlnovými délkami, jaké jsou schopny vyzařovat atomy a iontů prvků přítomných v měřeném vzorku). Metoda AES s jiskrovým výbojem l lJiskrový výboj lVyužívá se opakující se krátkodobé vysokonapěťové elektrické výboje mezi dvěmi elektrodami l teplota je vyšší než 12 000 K (vysoká teplota –––> velký počet excitovaných stavů –––> poskytuje bohaté spektrum (hodně čar) ldnes hlavně pro analýzu kovů – kvantometry lvhodné pro kvantitativní analýzu Metoda AES s obloukovým výbojem lObloukový výboj – vzniká, pokud je vložen trvalý elektrický výboj mezi dvěma elektrodami lteplota výboje 4 000 až 8 000 K lspektrum chudší, ale intenzivní čáry (na stejné vlnové délce vyzařuje více atomů) lstanovení stopových prvků a hlavně kvalitativní analýza l(snadněji najdeme čáry prvku ve spleti spektrálních čar) Atomová emisní spektrofotometrie - plamenová lV klinické biochemii se používají plamenové fotometry, které jsou konstruované zpravidla pro paralelní stanovení koncentrace sodných a draselných iontů v séru nebo moči. Mohou být využity i pro analýzy lithia (monitorování lithných psychofarmak). l Plamenové emisní fotometry lNejvýznamnější výrobci: fy Radiometr, Coring lPrincip stanovení: měření intenzity zbarvení plamene üRoztok analyzovaného vzorku se přivádí do bezbarvého plamene ve formě jemné mlhy, která se vytváří v pneumatickém zmlžovači - atomizéru. üK izolaci spektrálních čar se používá interferenčních filtrů üjako detektor intenzity emitovaného světelného toku slouží fotonka üPro zajištění konstantních podmínek měření se ve všech plamenových fotometrech používá vnitřní standard Plamenový fotometr - analytické fáze Nasávání zředěného vzorku a převedení roztoku na aerosol Odpaření vody z kapének aerosolu vlivem teploty plamene Vstup aerosolu s topným plynem a okysličovadlem do plamene Rozložení molekul a redukce kationtů za vzniku volných atomů ( Na+ + e - = Na ) Excitace některých atomů do vyššího energetického stavu Excitované atomy přecházejí zpět do základního stavu za vyzáření (emise) světelné energie charakteristické vlnové délky Vyzářená světelná energie je detektorem převedena na elektrickou veličinu a přepočítána na koncentraci měřeného prvku ▼ ▼ ▼ ▼ ▼ ▼ Plamenový fotometr - analytické fáze 1.Nasávání zředěného vzorku a převedení roztoku na aerosol: übiologický materiál se před měřením musí zředit (100x): l - vzhledem k vysoké citlivosti PF je nutné snížit intenzitu signálu na měřitelné hodnoty l - snížení rozdílů ve viskozitě vzorků l - snížení množství bílkovin (které by po denaturaci v hořáku mohli způsobit jeho ucpání) lŘedění vzorků probíhá buď automaticky pomocí ldilutoru, který je součástí plamenového fotometru, lnebo manuálně. Instrum_tech_foto 002 Instrum_tech_foto 003 Instrum_tech_foto 006 Plamenový fotometr - analytické fáze 1. 1. 1.Nasávání zředěného vzorku a převedení roztoku na aerosol: üPneumatický zmlžovač (nebulizér, atomizér): je součástí přístroje - vzorek je nasáván pomocí vzduchu (který slouží zároveň jako plynné oxidovadlo) do zmlžovací komory kam je zároveň přiváděno plynné palivo, vzniká jemný aerosol, který je unášen do plamene. Velikost kapének aerosolu je 10 µm ü l l l ü Pneumatický rozprašovač se zmlžovací komůrkou l 1. přívod stlačeného vzduchu 2. roztok vzorku 3. kapilára nasávající vzorek 4. rozprašující tryska 5. oddělovač kapek 6. směšovač 7. přívod výhřevného plynu 8. oddělovač kapek 9. hořák 10. plamen FLM4 Instrum_tech_foto 002 Zmlžovací komora Instrum_tech_foto 022 Plamenový fotometr - analytické fáze 2.Vstup aerosolu s topným plynem a okysličovadlem do plamene lPalivová směs: Propan - vzduch nebo Acetylen - vzduch lPlamen má několik zón, jejichž teplota, tvar a velikost závisí na vlastnostech použitých palivových plynů a hořáku. K vlastní atomizaci a excitaci dochází na rozhraní reakční zóny nesvítivé části plamene. l lPro stanovení Na, K, Li – se používá relativně studený plamen „propan – vzduch“ který poskytuje teplotu 1930 °C, l aby se předešlo excitaci i ostatních prvků přítomných ve vzorku, které by mohly vyvolat nežádoucí interferenci lpro stanovení Ca se používá palivo acetylen-vzduch, který má výhřevnější plamen (2300 °C) l •Poměr složek palivové směsi je nastaven tak, aby byla (odezva přístroje) intenzita emitovaného světla co nejvyšší l l l l Instrum_tech_foto 002 Instrum_tech_foto 014 Instrum_tech_foto 024 Plamenový fotometr - analytické fáze l3. Odpaření vody z kapének aerosolu vlivem teploty plamene üTeplota plamene způsobí odpaření rozpouštědla a disociaci molekul na volné atomy. l4. Rozložení molekul a redukce kationtů za vzniku volných atomů ( Na+ + e - = Na) ) ) l5. Excitace některých atomů do vyššího energetického stavu üPlamen je zdrojem budícího záření (excitační energie). Termicky (= srážkovým mechanismem) dojde k excitaci atomů, poté následuje deexcitační proces spojený s emisí příslušného záření. (zdroj emitujícího záření) l6. Excitované atomy přecházejí zpět do základního stavu za vyzáření (emise) světelné energie charakteristické vlnové délky l l l l Plamenový fotometr - analytické fáze l6. Excitované atomy přecházejí zpět do základního stavu za vyzáření (emise) světelné energie charakteristické vlnové délky üZáření, které je emitováno vzorkem, se rozkládá vhodnými disperzními prvky üK izolaci jednotlivých spektrálních čar, se používají nejčastěji interferenční filtry s maximální propustností a nízkou hodnotou spektrální pološířky üInterferenční filtry: základem jsou dvě reflexní plošky s výbornými odrazovými vlastnostmi, které jsou odděleny vrstvou dielektrika (průsvitný nevodivý materiál). Mnohonásobnými odrazy od zrcadlových plošek filtru a po vícenásobné interferenci dopadajících paprsků různé vlnové délky, monochromátor izoluje spektrální čáry stanovovaných prvků l Interfereční filtr la, c – polopropustné vrstvičky lb – vrstva dielektrika o tloušťce l/2 ld, e – krycí vrstvy interferfiltr Plamenový fotometr - analytické fáze l7. Vyzářená světelná energie je detektorem převedena na elektrickou veličinu a přepočítána na koncentraci měřeného prvku üDetektor: nejčastěji se používá fotočlánek l princip: založen na fotoelektrickém efektu - elektrony uvolněné z fotokatody po dopadu fotonů pohybují k anodě účinkem sacího napětí. Fotoelektrický proud je úměrný toku záření. Fotoelektrický proud přechází přes odpor RL a odpor je přímo úměrný procházejícímu proudu. Plamenový fotometr - analytické fáze lDetektor: lFotonky mohou být evakuované nebo plněné lplynem. Ve vakuových fotonkách je lfotoelektrický proud úměrný toku záření. Jsou-li lfotonky plněné plynem, mohou elektrony z lkatody ionizovat jeho molekuly a tím dochází k lzesílení fotoelektrického proudu. l Plamenová emisní fotometrie lPro zajištění konstantních podmínek měření se ve všech plamenových fotometrech používá vnitřní standard. lTímto způsobem se kompenzuje vliv změn tlaku plynné směsi a viskozity roztoku. lJako vnitřní standard se používá: pro stanovení Na, K - roztok LiCl nebo CsCl a pro stanovení lithia roztok KCl Plamenová emisní fotometrie – vnitřní standard lVlastní provedení: lVnitřní standard se ve značném konstantním lmnožství přidává ke kalibračnímu i zkoumanému lroztoku. Vždy se měří současně spektrální linie lstanovovaného kovu a kovu vnitřního standardu. lKoncentrace stanovovaného prvku je přímo lúměrná poměru intenzit stanovovaného prvku a lprvku ve vnitřním standartu. (Cs) Tento poměr lintenzit se nemění ani při kolísání plamene. Plamenová emisní fotometrie lStanovení Na, K, Li se provádí metodou kalibrační křivky – srovnává se poměr intenzity signálu ve vzorku o známé koncentraci (Na, K) a vypočítá se koncentrace v měřeném vzorku. l Plamenová emisní fotometrie l Nevýhody: lvývoj plamenových fotometrů je už uzavřený, dnes se v rutinním provozu klinické laboratoře nepoužívají lPlamenový fotometr se obtížně zařazuje do vybavení automatického analyzátoru a vyžaduje dodržování specifických bezpečnostních předpisů. lNavíc u pacientů v těžkých stavech (např. při dehydrataci) mohou výsledky zkreslovat skutečný stav aktivity iontů v organismu – tento jev se označuje jako „pseudohyponatremie“ Plamenová emisní fotometrie l lPseudohyponatremie l V případě vysokých koncentrací bílkovin a lipidů v séru, jsou výsledky měření koncentrace iontů plamenovou fotometrií nižší, než naměřená aktivita ionoselektivními elektrodami. Je to způsobeno tím, že část objemu rozhodného pro výpočet koncentrace je obsazena bílkovinami a lipidy, takže i když se aktivita ve zbylém vodném objemu nezměnila, bude koncentrace v celkovém objemu nižší. Proto u vzorků s vysokým obsahem lipidů a bílkovin se toto měření nedoporučuje. Děkuji za pozornost J