Luminiscence _ 2013 LUMINISCENČNÍ metody Petr Breinek Bioluminiscence v přírodě medúza Světlušky, medúzy, dřevokazné houby, hlubokomořské ryby,…… Jellyfish Světluška princip: oxidace luciferinu luciferin Luciferin + ATP ® Luciferyl adenylát (enzym luciferáza) Luciferyl adenylát ® Oxyluciferin + AMP + CO2+ světlo Reakcí jedné molekuly luciferinu je produkován jeden foton o vlnové délce odpovídající namodralému světlu. Při reakci se pouhé 4 % energie mění na energii tepelnou a zbytek, tedy 96 % energie je vyzářen. Světluška je tedy daleko účinnější zářič než běžná výbojka, která má tento poměr 9:1 (tedy jen 10 % energie přechází na světlo). světluška Luminiscence je jev, při kterém vzniká světlo (fotony) po předchozím dodání energie (excitaci) materiálu (luminoforu) Luminiscence je charakteristická svojí dobou trvání, která o několik řádů převyšuje doby života termálních kmitů (záření černého tělesa), t.j. tepelné záření není luminiscence! LUMINOFOR/ FLUOROFOR TEPLO SVĚTLO EMITOVANÉ záření LUMINISCENCE EXCITAČNÍ záření 5 Rozdělení luminiscence podle zdroje excitace ü Fotoluminiscence - absorpce energie ve formě světla ü Chemiluminiscence a bioluminiscence - zdrojem energie je chemická reakce ü Elektroluminiscence – zdrojem je el. proud; Katodoluminiscence – zdrojem je proud elektronů ; Thermoluminiscence; Radioluminiscence – zdrojem je radioaktivní záření; Mechanoluminiscence – zdrojem je mechanická energie; Krystaloluminiscence – krystalizace je doprovázena luminiscencí; další zdroje •Stanovované analyty Porfyriny Hormony Tumorové markery Kostní markery Srdeční markery Vitamíny Léky Prokalcitonin,… Výhody: vysoká citlivost Luminofory/fluorofory jsou molekuly nebo jejich části, které vyzařují luminiscenční záření (fluoreskují) üPřirozené üAnalytické (fluorescenční značky nebo sondy) Přirozené luminofory/fluorofory • •Polyaromatické uhlovodíky •Vitamin A, E •FAD, FMN (450/525 nm) x FADH, FMNH •NADH (340/460 nm) x NAD+ •Karoteny •Chinin •Steroidy •Aromatické aminokyseliny •Nukleotidy •Fluoreskující proteiny - GFP (green fluorescent protein ) Nositelé Nobelovy ceny 2008 za chemii •Osamu Shimomura jako první izoloval zelený fluoreskující protein z medúzy Aequorea victoria (GFP) •Martin Chalfie první prakticky využil fluorescenčního proteinu (značení neuronů pro hmatové receptory) •Roger Y. Tsien objasnil fluorescenční mechanizmus GFP a různými modifikacemi rozšířil paletu barev (emitovaného záření) Struktura GFP • •Protein má celkem 238 aminokyselin (26,9 kDa) •GFP obsahuje běžné aminokyseliny, ale ve slunečním světle jeví lehce nazelenalou fluorescenci (kolem 500 nm), stejně jako živá Aequorea Victoria v moři... •Klíčová sekvence (Ser-Tyr-Gly) se nachází „uvnitř plechovky“ GFP_structure Použití GFP v chemii a biologii •Lze připravit protein, který obsahuje sekvenci (např. Ser-Tyr-Gly) • •Sekvenci z DNA medusy, která je zodpovědná za tvorbu GFP lze vpravit do DNA jiného organismu, např. i savce... albagreen Použití GFP v chemii a biologii •Nejde o bioluminiscenci (chemiluminiscenci), ale o fotoluminiscenci (excitace lampou, nebo laserem) •obecně lepší rozlišení při sledování mikroskopem •sledování genové exprese •medicína a biologie: sledování metastáze tumoru Analytické luminofory/fluorofory • Luminol, isoluminol • Fluorescein • Methylumbelliferon (MU) • Akridin a jeho estery • Adamantyl dioxetan • Cheláty lanthanoidů (Europium) Nejčastěji jsou navázány jako značka (na protilátky nebo antigeny) nebo jsou použity jako substrát. Luminol (5-aminoftalhydrazid) •2H2O2 = 2 H2O + O2 (peroxidasa) •Luminol + 2H2O +O2 ® aminoftalát + N2 +3H2O+ světlo • (1928) – oxidace v bazickém prostředí příklad použití: intenzivní reakce s hematinem detekce krevních skvrn) luminol2 Fluorescein fluorescein Methylumbelliferon (MU) •MUP MU + P + luminiscence •4-metylumbelliferyl fosfát 4-metylumbelliferon + fosfát • + luminiscence • • • • •(defosforylace substrátu) MFCD00016969 •Rychlost tvorby MU je přímo úměrná koncentraci analytu. •Zdroj světla - rtuťová výbojka , l = 365 nm •Fluorescence ® vybrána vlnová délka 448 nm •Měří se rychlost přeměny MUP na MU •Kalibrací se vypočítá směrnice kalibrační závislosti a její převedení na koncentraci analytu. Ester akridinu → Akridin + světlo Akridin a estery akridinu Akridin phenyl ester Chemiflex™ (Abbott) Patentovaný ester akridinu akridinium(N-sulfonyl)karboxamid Sloučenina je velmi stálá Reakce: - oxidace v kyselém prostředí (pH=2; HNO3 a H2O2) - změna prostředí na zásadité (NaOH) - vznik nestabilní N-sulfonylpropylakridon v excitovaném stavu - při přechodu do stabilní formy se uvolní CO2 a energie v podobě světla (430nm) Lumigen® (Siemens, DPC) Fosfátový ester adamantyl dioxetanu Reakce: - defosforylace substrátu účinkem ALP - vznik nestabilního meziproduktu v excitovaném stavu - při jeho tvorbě je emitován tok fotonů 21 Luminiscence lanthanoidů Některé komplexy Ln(III) mají velmi neobvyklé spektrální vlastnosti: ü dlouhý čas vyhasínání luminiscence ü Stokesův posun může být i více než 100 nm ü emisní spektrum obsahuje ostré píky Fotoluminiscence •Podle dosvitu sekundárního záření dělíme fotoluminiscenci na: • Fluorescenci (10-9 -10-5 s ) • Fosforescenci (10-2 s až dny) •Absorpce primárního záření v oblasti gama, rentgenového, ultrafialového nebo viditelného spektra • Fluorimetrie – absorpce UV záření • Přístrojová technika •Zdroj exitačního záření (Hg výbojka, halogenové výbojky, Xe výbojka, lasery). •Filtr (Woodův fitr skla s příměsí NiO, CuO, CoO). •Měřicí prostor •Interferenční filtr propouštějící fluorescenční signál. •Detektor • 24 Fluorescence Měření fluorescence •Fluorimetry •Spektrofluorimetry •Fluorescenční skenery •Fluorescenční mikroskopy •Průtokové cytometry vzorek emisní monochromátor detektor zdroj excitační monochromátor čtecí zařízení Veličiny fluorescence •Kvantový výtěžek • poměr počtu vyzářených kvant fluorescence k počtu pohlcených fotonů •Doba života • doba mezi pohlcením kvanta budícího záření a vyzářením kvanta fluorescence •Polarizace (anizotropie) • může dát informaci o pohyblivosti molekuly fluorescenční látky v daném prostředí 27 Emisní spektrum Stokesův posuv Rozdíl vlnových délek absorpčního (excitačního) a emisního maxima Emitované záření má větší vlnovou délku a tudíž nižší energii Stokesův posuv l 29 Zhášení luminiscence • luminiscenci konkuruje jiný děj, který vede k poklesu intenzity luminiscence • všechny možné procesy zhášení ještě nejsou zcela vysvětleny Principy fluorescenčních stanovení •1. Přímé metody • měříme přirozenou fluorescenci vzorku • •2. Nepřímé metody • nefluoreskující vzorek přeměníme na fluoreskující derivát 1. •3. Zhášecí metody • sledujeme pokles intenzity fluorescence určitého • fluoroforu, která v nastává v důsledku zhášecí schopnosti vzorku •Použití luminiscence v KB •Fotoluminiscenční metody (fluorescenční metody) •Imunoanalytické metody (s fluorescenčním markerem) •Chromatografické metody (s fluorescenčním detektorem) • je vyvolána energií chemické reakce (většinou oxidace) •Jednoduché přístrojové vybavení bez zdroje primárního záření, nižší vliv matrice, stanovení nižších koncentrací •Elektrochemiluminiscence • je modifikace chemiluminiscence, kdy luminiscence je generována chemickými reakcemi iniciovaných elektrochemicky • Chemiluminiscence Chemiluminiscence Molekula v základním stavu Molekula v excitovaném stavu Molekula v základním stavu + Luminiscence Chemická reakce A + B à X* à P + hν •CMIA (chemiluminiscenční imunoanalýza na mikročásticích) CHEMILUMINISCENT MICROPARTICLE IMMUNOASSAY •ECLIA (elektrochemiluminiscence) •FPIA (fluorescenční polarizační imunoanalýza) FLUORESCENCE POLARIZATION IMMUNOASSAY •MEIA (enzymová imunoanalýza na mikročásticích) MICROPARTICLE ENZYME IMMUNOASSAY Fluorescenční imunoanalytické metody (FIA) FIA Fluoroimunoanalýza •= kombinace fluorometrie s imunoanalytickými metodami, kde značkovacím činidlem je fluorescenční látka • •Kompetitivní FIA • Naměřená fluorescence je nepřímo úměrná koncentraci stanovovaného analytu •Nekompetitivní FIA (sendvičová technika) • Naměřená fluorescence je přímo úměrná koncentraci stanovovaného analytu • Dissociation-enhanced Lanthanide Fluoroimmunoassay • • Protilátky nebo antigeny jsou značeny cheláty lanthanoidů: Eu (europia), Sm (samaria) a Tb (terbia) • Cheláty lanthanoidů vykazují velký Stokesův posun a delší dobu emise. • (Pozn.: použití jako luminofor v obrazovkách barevných televizorů) • Nekompetitivní sendvičová technika chráněná patentem. DELFIA • •Po imunochemické reakci se tento chelát přemění na fluoreskující sloučeninu •Detekce záření se zpožděním (odstranění interferujícího záření) •Pulzní zdroj (340nm, tisíce pulzů/s) • Po každém záblesku: • 400 µs prodleva • 400 µs měření emitovaného záření • (Nespecifická emise 10 ns) • • • • • •Kongenitální hypotyreóza (SKH) • Snížená funkce štítné žlázy vede ke zvýšení koncentrace TSH •Kongenitální adrenální hyperplazie (CAH) • Defekt steroidogeneze v kůře nadledvin; • nejčastěji deficit enzymu P450c21 (21-hydroxylázy) • zvýšení koncentrace 17 OHP (17-0H-progesteronu) • •Fenylketonurie/hyperfenylalaninémie Využití: „Celoplošný laboratorní novorozenecký screening“ • •Homogenní fluorescenční imunoanalýza •Využití kryptandů (=sloučeniny, které fluorofor Eu3+ váží v trisdipyridylové „kleci“ •Kryptandem je značený antigen nebo protilátka •Na druhou protilátku je vázán fluorofor, který je excitován při jiné vlnové délce než Eu •Imunokomplex je excitován laserem při 337 nm •Energie přenesená z kryptandu na fluorofor je detekována při 665 nm jako prodloužený signál TRACE Time Resolved Amplified Cryptate Emission Časové modulovaná detekce fluorescence CMIA Chemiluminiscenční imunoanalýza na mikročásticích •Heterogenní imunoanalýza - separace pevnou fází •Paramagnetické mikročástice •Emise světla molekulou, která je produktem chemické reakce • •Systém není ozařován zdrojem světla. Paramagnetické částice Krystaly kysličníků železa v velký povrch v magnetické vlastnosti CMIA CMIA FPIA Fluorescenční polarizační imunoanalýza Fluorescence Polarization Immunoassay •Homogenní kompetitivní immunoanalýza, měření se provádí ve dvou polarizačních rovinách •Využívá různé rychlosti rotace velkých a malých molekul, které vedou ke změně polarizace (použití pouze pro malé molekuly, např. léky) •Výsledná polarizace je nepřímo úměrná koncentraci analytu ve vzorku. •Fluorescence vyvolaná lineárně polarizovaným světlem je také lineárně polarizovaná •Je-li fluorofor vázán na velkou molekulu (komplex značený antigen-protilátka), nemůže volně rotovat a emitované světlo kmitá ve stejné rovině jako excitující – polarizace zůstane zachována • •Volný fluorofor může volně rotovat, emitované světlo kmitá v jiné rovině než excitující – polarizace se zeslabuje MEIA Enzymová imunoanalýza na mikročásticích Microparticle Enzyme Immunoassay •Heterogenní enzymová imunoanalýza na mikročásticích •Imunokomplex značený enzymem ( ALP) •Fluorogenní substrát (MUP, 4-metylumbelliferylfosfát) reaguje s enzymem (ALP) •Defosforylace substrátu (MUP MU) • (4-metylumbelliferon), luminiscence MEIA • modifikace chemiluminiscence, světlo je generováno chemickými reakcemi iniciovaných elektrochemicky • • • ECLIA Elektrochemiluminiscenční imunoanalýza Elecsys 2010 Elecsys 2010 (Roche) üCheláty ruthenia se používají jako luminiscenční značka vzniklých imunokomplexů üNa platinové elektrodě je chelát Ru2+ oxidován na Ru3+, zároveň je tripropylamin (TPA+) oxidován na radikál TPA+(má redukční vlastnosti), snadno redukuje Ru3+komplex na Ru2+, Ru kation prochází reakcí cyklicky, nespotřebovává se, chová se jako enzym üelektron z TPA přeskočí do vyšší energetické hladiny Ru kationtu, přechodem do základního stavu dojde k luminiscenci a Ru komplex je opět schopen další oxidace üTPA se rozpadá na dipropylamin, je v reakci spotřebováván, slouží jako substrát • 49 AA4 není Fish jako FISH... Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) 50 FISH •Fluorescence In Situ Hybridization je cytogenetická metoda, která umožňuje detekci a lokalizaci konkrétních sekvencí DNA v chromosomech •tato metoda je určená k mapování genů a sledování chromosomálních abnomalit, atd. •pro detekci se využívá fluorescenční mikroskopie • 51 Ukázky FISH Bcrablinter 2F96