Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno
NÁVAZNOST METOD
KLASICKÉ A MOLEKULÁRNÍ
CYTOGENETIKY
Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno
TYPY CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ,
kterých se týká vyšetření metodami
klasické i molekulární cytogenetiky
- VYŠETŘENÍ VROZENÝCH CHROMOSOMOVÝCH
ABERACÍ – prenatální a postnatální vyšetření
- VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH
ABERACÍ (u onkologických onemocnění)
vyšetření z kostní dřeně a tkáně solidních tumorů
Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno
NÁVAZNOST METOD KLASICKÉ
A MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY
- metodami molekulární cytogenetiky upřesňujeme a potvrzujeme patologické
nálezy detekované metodami klasické cytogenetiky
- metody molekulární cytogenetiky odhalí velmi malé změny v karyotypu, které
nelze detekovat metodami klasické cytogenetiky (nízká rozlišovací schopnost
klasických metod)
při vyšetřování - vrozených chromosomových aberací
- získaných chromosomových aberací u onkologických
pacientů
Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno
METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY
• vykapání suspenze na podložní sklíčka
Obr. 5 (Dokumentace OLG FN Brno)
Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno
METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY
G -pruhování chromosomů
• G - pruhování chromosomů
1 – inkubace
preparátu
v roztoku
trypsinu
(natrávení
proteinů na
povrchu
chromosomů)
2 – barvení
barvivem
Giemsa-
Romanowski
Obr. 6 (Dokumentace OLG FN Brno)
Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno
METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY
hodnocení
chromosomy s G-pruhy hodnotíme ve světelném mikroskopu
zdroj světla - viditelná část spektra (halogenová žárovka)
(stanovení karyotypu)
Obr. 7 (Dokumentace OLG FN Brno)
Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno
METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY
hodnocení
zvětšení 1000 - 1250x
Obr. 8 (Dokumentace OLG FN Brno)
Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno
METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY
hodnocení
světelný mikroskop
s CCD kamerou
napojený na počítač
ke třídění chromosomů a sestavení karyotypu lze využít
počítačové analýzy obrazu
Obr. 9 (Dokumentace OLG FN Brno)
Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno
METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY
hodnocení
• karyotyp = utříděný a zhodnocený
soubor chromosomů v somatických
buňkách pacienta, v zápisu označujeme
počet chromosomů, typ pohlavních
chromosomů a případné aberace (zápis
karyotypu např. 46,XY)
• normální lidský karyotyp se skládá
ze 46 chromosomů - 22 párů
autosomů (nepohlavních chromosomů),
2 gonosomů (pohlavních chromosomů)
• chromosomový pár je tvořen homologními
chromosomy (jeden zděděn od otce, druhý
od matky), nepárové chromosomy jsou
nehomologní (somatické diploidní buňky)
obrázek karyotypu = utříděný a zhodnocený
soubor chromosomů jedné buňky, který
charakterizuje i chromosomy v ostatních
buňkách pacienta ve vyšetřované tkáni
Obr. 10 (Dokumentace OLG FN Brno)
Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno
Při vyšetření karyotypu analyzujeme určitý počet mitóz s chromosomy
s G-pruhy, podle požadavku lékaře a nalezené patologie (10, 50). Ve
spolupráci s molekulární cytogenetikou (metoda FISH) analyzujeme
obvykle 200 interfázních jader (vyšetření % zastoupení buněčných linií
u mozajek). Metody molekulární cytogenetiky mohou vyšetřovat i mitózy
(potvrzování strukturních aberací metodou FISH) nebo pracují
s izolovanou DNA pacienta (metody CGH, MLPA) .
NÁVAZNOST METOD KLASICKÉ
A MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY
vyšetření karyotypu
a chromosomových aberací
Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno
NÁVAZNOST METOD KLASICKÉ
A MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY
• vykapání suspenze na podložní sklíčka
pro některá molekulárně cytogenetická vyšetření - FISH
Obr. 11 (Dokumentace OLG FN Brno)
Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno
METODY MOLEKULÁRNÍ
CYTOGENETIKY
princip vazby fluorescenčně značené sondy na chromosomy
nebo interfázní jádra na podložním sklíčku
sonda
značená sonda
vazba značené sondy
na cílovou DNA
(chromosom)Obr. 12
Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno
METODY MOLEKULÁRNÍ
CYTOGENETIKY
hodnocení
chromosomy fluorescenčně značené hodnotíme ve fluorescenčním
mikroskopu, zdroj světla - krátkovlnná část spektra (např. rtuťová
výbojka); fluorescenční mikroskop je také součástí systému analýzy obrazu
zdroj krátkovlnného
vysokoenergetického zářeníspeciální filtry
Obr. 13 (Dokumentace OLG FN Brno)
Obr. 14
Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno
METODY MOLEKULÁRNÍ
CYTOGENETIKY – FISH
(preparáty k hodnocení)
Obr. 15 (Dokumentace OLG FN Brno)
na chromosomy v mitózách a na chromatin v interfázních jádrech jsou vázány
fluorescenčně značené sondy (WCP – celochromosomové sondy, tel – telomerické,
CEP – centromerické sondy)
Vyšetření 1: Vyšetření 2: Vyšetření 3:
Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABERACE (VCA) - příklady
potvrzení přítomnosti balancované
translokace v karyotypu metodou FISH
46,XY,t(5;19)(q15;p12)
G-pruhování chromosomů
metoda FISH
Obr. 16 (Dokumentace OLG FN Brno)
základní vyšetření, při kterém
je translokace detekována
potvrzení a upřesnění nalezené přestavby
(cílené vyšetření konkrétních chromosomů)
Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABERACE (VCA)
potvrzení přítomnosti delece v karyotypu
metodou MLPA
46,XX,del(5)(p14.1)syndrom Cri du Chat
G-pruhování chromosomů – základní vyšetření
Obr. 17 (Dokumentace OLG FN Brno)
Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABERACE (VCA)
potvrzení přítomnosti delece v karyotypu
metodou MLPA
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,401p36
1p362p16.1
3q29
Wolf-HirschhornCriduChat
SotosWilliams
Langer-Giedion
9q22.3
DiGeorge2
WAGR
P-W/Angelman
P-W/Angelman
15q24
Miller-Diecker
Smith-Magenis
Smith-Magenis
NF1
17q21DiGeorgeDiGeorge
Phelan-McDermid
MECP2dup
MECP2dup
metoda MLPA (metoda molekulární cytogenetiky) – potvrzení nálezu
Obr. 18
(Dokumentace
OLG FN Brno)
Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE
(VCA)
strukturní změny – nebalancované aberace
mikrodelece
(detekce delece menší než je rozlišovací schopnost vyšetření chromosomů
s G–pruhy – pomocí metod molekulární cytogenetiky)
cílené vyšetření metodami
molekulární cytogenetiky
– vyšší rozlišovací schopnost (FISH)
základní vyšetření metodami
klasické cytogenetiky G-pruhování
chromosomů
normální karyotyp 46,XX !!! nalezena delece na 22. chromosomu
v oblasti 22q11-13 (Di George syndrom – VSV)Obr. 19 (Dokumentace OLG FN Brno)
Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno
45,X[1]/46,XX[9]
Při nálezu alespoň 1 patologické mitózy (G – pruhování)
vyšetřujeme metodou FISH z interfázních jader (200 jader).
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABERACE (VCA)
MOZAICISMUS - gonosomy
3% hraniční patologický nález
Obr. 20 (Dokumentace OLG FN Brno)
Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno
VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ
ABERACE (VCA)
MOZAICISMUS - gonosomy
45,X[6]/46,XX[194]
vyšetření % zastoupení jednotlivých linií buněk v periferní krvi
pacientky metodou FISH z interfázních jader
(3% zastoupení buněčné linie 45,X)
1 signál
(přítomen
1 chromosom X
v jádře buňky)
2 signály (přítomny
2 chromosomy X
v jádře T-lymfocytu)
Obr. 21 (Dokumentace OLG FN Brno)
použita sonda na centromeru
chromosomu X
Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno
ONKOCYTOGENETIKA
komplexní karyotyp
56,XY,der(X)t(X;5),+der(1),add(2),+3,der(4)t(4;?),+6?,+8,
+10,der(11),+der(11)t(11;21)?,+der(11),+der(12)t(7;12)
qdp(12p),+17,der(18)
smíšený germinální tumor
Obr. 22 (Dokumentace OLG FN Brno)
analýza složitých a mnohočetných přestaveb u onkologických pacientů s komplexním
karyotypem 1) G-pruhování chromosomů 2) SKY
Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno
Doporučená literatura:
1) Nussbaum R.L., McInnes R.R., Willard H.F.: Klinická genetika,
Triton, 6. vydání, 2004, ISBN 80-7254-475-6
Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno
Použitá literatura
1) ISCN 1995, Mitelman (ed), S. Karger, Basel 1995,
ISBN 3-8055-6226-8
2) Kuglík P.: Vybrané kapitoly z cytogenetiky, Masarykova univerzita
v Brně, 1. vydání, 2000, ISBN 80-210-2334-1
3) Nussbaum R.L., McInnes R.R., Willard H.F.: Klinická genetika,
Triton, 6. vydání, 2004, ISBN 80-7254-475-6
1) ISCN 1995, Mitelman (ed), S. Karger, Basel 1995,
ISBN 3-8055- 6226-8
Text:
Obrázky: