Biofilm a jeho význam Filip Růžička Mikrobiologický ústav LF MU a FN u sv. Anny v Brně Přednáška pro II. r. VL 2015 HISTORIE • 1676 Antony van Leeuwehoek sledoval bakterie v zubním povlaku • Od dob Pasteura a Kocha 100 let nikoho nenapadlo, že mikrobi v přírodě rostou jinak, než jako volně se vznášející plankton v tekutinách nebo jako kolonie na pevných půdách • 1935 C. E. Zobel první popis biofilmu u mořských bakterií • 1950 – 1960 první zprávy o problémech s biofilmem • 1978 J. W. Costerton upozornění na všudypřítomnost biofilmu a jeho možná účast na perzistentních infekcích BIOFILM Mikrobiální biofilm je společenství mikroorganizmů, které se tvoří na rozhraní fází. Pevně lne k inertním i živým povrchům. Vedle mikrobiálních buněk bývá důležitou stavební složkou biofilmu i mezibuněčná hmota. V biofilmu probíhá komunikace a kooperace mezi jednotlivými buňkami i celými populacemi Biofilm Planktonická forma Biofilm – adheze, kooperace, gradient Mechanická ochrana Vliv na účinek ATB Ochrana před chem. látkami Šíření mikroorganizmů Způsob života mimo rozhraní fází Výměna genetické informace Homeostáza - mikroprostředí Kooperace a specializace buněk Ochrana před imunitním systémem Regulace tvorby biofilmu hustota populace, složení společenstva, koncentraci živin aj. Systém quorum-sensing – malé extracelulární signální molekuly → akumulace → transkripce cílových genů. Jeden druh může mít více QS systémů a více signálních molekul FARNESOL – vliv na expresi min. 274 genů inhibice biofilmu tvorba klíčků, časná fáze tvorby biofimu - TYROSOL G- bakterie - N-acyl-L-homoserin laktony G+ bakterie - signální peptidy (s cyklickou thionolaktonovou strukturou) Kandidy - X Biofilm – významný faktor virulence  mechanická ochrana buněk (adheze k povrchům a matrix)  Vrstva biofilmu tvoří vhodné mikroprostředí v okolí mikrobů  Kooperace a specializace buněk, přenos genů  Ochrana před účinky imunitního systému  Vliv na účinek antimikrobiálních látek − Snížená difúze do biofilmové vrstvy, vazba na struktury biofilmu, − Zvýšená degradace ATB účinkem enzymů − Změny vlastností mikroba, exprese odlišných genů (multidrug efflux pumps CDR, MDR) − Heterogenita populace (genetická variabilita), perzistoři −Změny mikroprostředí − Změny rychlosti růstu BIOFILMOVÁ ONEMOCNĚNÍ  pomalý, chronický průběh  často bez výraznějších příznaků  občas akutně exacerbují  antibiotická terapie mívá omezený efekt  po vysazení antibiotik infekce rekurují izolovaná agens se mohou jevit dle MIC jako citlivá Biofilmové infekce spojené s přítomností implantátů biofilmové infekce krevního řečiště (katétrové sepse, infekce chlopenních náhrad, aj. ….), endotracheální kanyly, chirurgické stehy, infekce močových katetrů, inf. kloubních náhrad, kontaktní čočky aj… aj... kolpitidy, zubní kaz, rány otitis, osteomyelitidy, pneumonie u cystické fibrózy subakutní endokarditidy, cholecystitidy Biofimové infekce nativních povrchů BIOFILM V MAKROORGANISMU HRAJE I PROSPĚŠNOU ROLI normální mikroflóra tvoří vrstvu biofilmu na sliznicích Problémy s biofilmem jsou i mimo medicínu  Znečištění povrchů  Zvýšení turbulence protékající tekutiny  Zúžení průsvitu až ucpání potrubí  Koroze ropovodů, nádrží paliva v letadlech  Černání tekutin redukovanými kovy  Tvorba izolační vrstvy v tepelných výměnících  Zvýšení odporu lodního trupu při plavbě aj. Jak diagnostikovat infekce s přítomností biofilmu? Jak interpretovat schopnost agens tvořit biofilm? Jak léčit infekce spojené s přítomností biofilmu? Laboratorní diagnostika biofilmových infekcí Pevné přilnutí k povrchu -  záchytu mikroba. Je přítomen biofilm? Jakou hraje roli v patogenezi? Jak ovlivní biofilm terapii? Průkaz infekce implantátu A) Nevyžadující vyjmutí implantátu B) Průkaz kolonizace implantátu po jeho vyjmutí Průkaz schopnosti tvořit biofilm Účinnost antimikrobiální terapie na biofilm Fenotypové metody průkazu tvorby biofilmu Vizualizace Kultivační průkaz Průkaz klíčových složek biofilmu Povrchové vlastnosti mikroba Průkaz genů zodpovědných za biofilm Adheze Biofilmová vrstva Kultivační průkaz tvorby biofilmu Modifikace Christensenovy metody (Christensen et al., 1982,1985) 1) Kultivace mikroba v přítomnosti vhodného kutivačního povrchu Zkumavková metoda Mikrodestičková metoda Disková metoda 2 ) Promytí - odstranění planktonických buněk 3) Průkaz vytvořené biofilmové vrstvy Zjištění počtu CFU Barvení + spektrofotometrické měření Sušina Kolorimetrická média (redukce tetrazoliových solí, resazurin aj.) a další ++ + 0 - Klinický význam průkazu tvorby biofilmu Marker klinické významnosti kmene Je kmen izolovaný z hemokultur klinicky relevantní? Nejde o kontaminaci? Průkaz tvorby biofilmu může přinést cenné klinické informace Prognóza. Jak postupovat v další léčbě? Citlivost biofilmu k antimikrobiálním látkám Jaké antimikrobiální látky použít na katétrovou infekci? MIKROBY V BIOFILMU JSOU VŽDY ODOLNĚJŠÍ NEŽ FORMY PLANKTONICKÉ MIC neodpovídá koncentracím antimikrobiálních látek schopných zasáhnout biofilm (MBIC a MBEC) Zvýšená odolnost se týká dezinfekčních látek i antibiotik/antimykotik Rozdíly v citlivost činí až několik řádů Předpokládá se více mechanizmů, které se na rezistenci BF podílí MIC nemá přímý vztah k MBIC a MBEC MBIC - minimální biofilm inhibující koncentrace MBEC - minimální biofilm eradikující koncentrace ZHORŠENÝ PRŮNIK EXTRACELULÁRNÍ MATRIX - PENETRAČNÍ BARIÉRA SNÍŽENÍ DIFÚZE ANTIMIKROBIÁLNÍ LÁTKY nelze však vždy prokázat VLIV POVRCHOVÉHO NÁBOJE zdá se důležitější např. aminoglykosidy (+) se vážou na alginát (-) P. aeruginosa SNÍŽENÁ DIFÚZE ENZYMŮ jako jsou ß-laktamázy Snazší degradace antibiotik ZMĚNA PROSTŘEDÍ  vyčerpání O2 v určitých oblastech  zvýšení osmotického tlaku  nahromadění kyselých zplodin metabolismu přímý účinek - potlačení účinku antibiotika chinolony, aminoglykosidy nepřímý účinek - snížení růstové rychlosti beta-laktamy, glykopeptidy ZMĚNA MIKROBIÁLNÍ POPULACE toxická látka zabije většinu mikrobů v biofilmu zůstane subpopulace buněk k dané látce vysoce rezistentních „Biofilmový fenotyp“ - exprese genů zodpovědných za rezistenci tato subpopulace odpovídá za zvýšenou rezistenci biofilmu PREVENCE BIOFILMOVÝCH INFEKCÍ JE VÝHODNĚJŠÍ NEŽ LÉČBA Společný zájem pacienta, lékaře i ekonomů Typ implantátu (mechanické, konstrukční a fyzikálně-chem. vlastnosti, zvl. charakter povrchu aj.) Stav pacienta (imunosuprese, věk, další onemocnění) Agens a jeho faktory virulence (adheze aj.) Způsob zavedení a péče o implantát Prevence biofilmových infekcí Vhodná volba implantátu a způsob zavedení (asepticky!) Zkušený personál + kvalitní následná péče Preventivní/preemptivní podání ATB u rizikových pacientů ??? Vhodný materiál (charakter povrchu: druh materiálu, povrchová energie, povrchový náboj, hrubost aj.) Impregnace implantátů - antimikrobiální látky a antiseptika (chlorhexidin, Ag) www.rajsmichu.cz Terapie infekcí spojených s tvorbou biofilmu Terapie infekcí spojených s tvorbou biofilmu Ponechání infikovaného implantátu Méně závažné infekce  patogenními mikroby (např. CoNS),  riziko disseminace Stabilizovaný pacient, benigní průběh, bez komplikací Reaguje na ATB terapii Pokus o likvidaci ložiska biofilmu (Vysoká pravděpodobnost selhání) (Doporučení IDSA - Mermel et al, 2009) Likvidace ložiska odstranění implantátu + následná ATM terapie Budoucnost Prevence katétrových infekcí Interference se signály typu quorum sensing (furanony, RNAIII-IP, AIP) Ovlivnění povrchových vlastností katétru Inhibice vzniku vysoce odolných perzistorů Vakcinace ? Terapie katétrových infekcí Rozvolnění mezibuněčné hmoty enzymaticky (lyasy polysacharidů) fyzikálně (ultrazvukem, elektromagnetickým polem) Molekuly vyvolávajících autodestrukci biofilmu regulátory tvorby biofilmu (quorum sensing - furanony, RNAIII-IP, AIP) ? Děkuji za pozornost