Metody analýzy microRNA MUDr. Mgr.Marek Mráz Moderní metody analýzy genomu LÉKAŘSKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERSITY Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno Centrum molekulární biologie a genové terapie  krátké RNA molekuly ~22 nukleotidů  komplementární vazba k cílové mRNA  inhibují translaci a snižují stabilitu mRNA microRNA (miRNA) microRNA DNA mRNA PROTEIN • Lidské miRNA geny: cca 1000 Stovky evolučně konzervovaných microRNA Mraz et al., 2010 microRNA DNA mRNA PROTEIN mRNA neznamená, že v buňce bude i protein Historicky vždy velká neshoda mezi daty z expresních čipů a expresí proteinů (Western Blot) 1/ Izolace a stabilita microRNA Problémy: velikost 22nt, celkově cca 0,01% z celkové RNA Izolace: TRIzol/TriReagent miRvana (Ambion) PureLink (Invitrogen) a další Obohacení: PAGE FlashPAGE Fractionator (Ambion) Mraz et al., 2009 Izolace: TRIzol/TriReagent miRvana (Ambion) PureLink (Invitrogen) a další Mraz et al., 2009 Izolace: TRIReagent/TRIzol is the „gold standard“ Obohacení: PAGE FlashPAGE Fractionator (Ambion) 15min 20hours Stabilita microRNA : Stabilita po izolaci Stabilita v FFPE (formalin-fixed parafin-embedded tissue) Mraz et al., 2009 RNA cDNA Bravo et al., 2007 Stabilita microRNA : Stabilita v FFPE (formalin-fixed parafin-embedded tissue) Jung et al., 2010 Analýza microRNA • Identifikace miRNA (deep sequencing, cloning a Northern blot) • Real-Time PCR • Microarrays Cheng et al., 2007 Konstrukce cDNA knihovny malých RNA Cloning nebo deep sequencing Validace pomocí Northern blot Real-Time PCR Chronická lymfatická leukémie a microRNA  nejčastější leukémie dospělé populace !!!  Projevy: krvácení, anémie, zvětšení uzlin a sleziny, infekce, hubnutí  nádorovými buňkami jsou B lymfocyty (hromadí se v periferní krvi)  prognóza onemocnění velmi variabilní (měsíce vs. desítky let)  patogeneze není prakticky známa Rai Blood 46:219, 1975 Value Stage Risk Median Survival Lymphocytosis (wbc > 15,000/mm3) 0 Low 12.5 years Lymphocytosis + nodal involvment I Int 8.5-9 years Lymphocytosis + organomegaly II 5-6 years Anemia III High 9 months Thrombocytopenia IV 9 months CLL a microRNA Mutované IgVH Nemutované IgVHDel p53 Stilgenbauer a Dohner, 2005, upraveno měsícePřežitípacientů(%)  Exprese microRNA rozlišuje mezi jednotlivými subtypy CLL : nemutované IgVH a mutované IgVH. (Calin et al., 2005; Marton et al., 2008; Zanette et al., 2007; Fulci et al., 2007)  13q14 lokus je často deletován u CLL a miR-15a-16-1 leží v této oblasti. (Calin et al., 2002)  miR-15 a miR-16 reguluje Bcl2. (Cimmino et al., 2005; Calin et al., 2008) Blood, in press p53 abnormalities => very aggressive CLL Why are p53 abnormal samples interesting? Malcikova et al., Blood, 2010 CD5CD5 SEPARACE RossetteSep PO SEPARACI (PODÍL ≥95% CLL buněk) PŘEHLED METOD: CD19 CD19 30 PACIENTŮ (♂/♀: 0,9; medián 63 let) del/mut TP53 n=12 wt TP53 n=18 Real-Time PCR (TagMan ABI) 35 microRNA bylo vybráno pro další studování Pacienti s funkčním p53 mají ~ 10 násobně vyšší expresi miR-34a (p=0,000001) miR-34a P=0.000001 P=0.00001 a wt TP53 del/mut TP53 control miR- 34a 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 del/mutp53 del/mutp53 del/mutp53 del/mutp53 del/mutp53 del/mutp53 del/mutp53 del/mutp53 del/mutp53 del/mutp53 del/mutp53 wtp53 wtp53 wtp53 wtp53 wtp53 wtp53 wtp53 wtp53 del/mutp53 wtp53 wtp53 wtp53 wtp53 wtp53 wtp53 wtp53 wtp53 wtp53 wtp53 individual patients NormalisedmiRNA34aexpression wtp53 wtp53 wtp53 wtp53 wtp53 wtp53 wtp53 wtp53 wtp53 wtp53 wtp53 Mraz et al, Leukemia, 2009 Mraz et al., Leuk Lymphoma, 2009 miR-34a a regulace apoptózy  He et al., NATURE 2007: miR-34a je transkripčně aktivovaná proteinem p53 (studium buněčných linií)  Bommer et al., CURR. BIOL. 2007: miR-34a ovlivňuje BCL2 (studium buněčných linií)  miR-34a je abnormálně exprimována u CLL pacientů s abnormalitou p53 (Mraz et al., 2009; Mraz et al., 2009)  první potvrzení významu miR-34a přímo in vivo u pacientů  je známa úloha BCL2 v patogenezi CLL, možný význam deregulace miR-34a b P=0.03P=0.02 P=0.0006 wt TP53 del/mut TP53 control miR-29c  miR-29c reguluje expresi Tcl1 a Mcl1  Tcl1 a Mcl1 proto-onkogeny jsou známy z myších modelů vzniku CLL (Johnson et al. 2006; Zhou et al. 2001) miR-29c Mraz et al, Leukemia, 2009 Mraz et al., Leuk Lymphoma, 2009 Mraz et al., BBRC, 2009  Exprese miR-17-5p je řízena proteinem c-myc  miR-17-5p reguluje expresi E2F1, p21 a Cyclinu D1 (O’Donnell et al. 2005; Fontana et al. 2008) miR-17-5p P=0.04 miR-17-5p wt TP53 del/mut TP53 Mraz et al, Leukemia, 2009 Mraz et al., Leuk Lymphoma, 2009 Mraz et al., BBRC, 2009 Absolute quantification miR-34a is aberantly expressed in p53 abnormal samples (Mráz et al., 2009; Mráz et al., 2009; Zenz et al., 2009; Asslaber et al., 2010) unpublished data • miR-34a, miR-29c, miR-17-5p jsou sníženě exprimovány u pacientů s agresivním CLL. • Jedná se o první komplexni definování expresního profilu miRNA u pacientů s CLL a delecí/mutací p53 genu. o Rozdíly v expresi miR-34a, miR-29c, miR-17-5p mohou být významné v patogenezi/progresi agresivních subtypů CLL. Mraz et al., Leukemia 2009 Mraz et al., Leukemia&Lymphoma, 2009 Mraz et al., BBRC, 2009 SHRNUTÍ VÝSLEDKŮ Tab. 1 Exprese microRNA u pacientů s nepříznivýni prognostikými markery (nemutované IgVH a delece/mutace p53) (dle 1 Calin, 2005; 2 Mraz, 2009b) MicroRNA Chromozomáln í oblast Exprese miRNA u CLL vzorků s: nemutovaným IgVH (ZAP70+) vs. mutovaným IgVH (ZAP70-) delecí/mutací p53 (bez ohledu na IgVH) vs. wild-type p53 (bez ohledu na IgVH) miR-15a 13q14 VYSOKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-16-1 13q14 VYSOKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-16-2 3q26 VYSOKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-23b 9q22 VYSOKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-24-1 9q22 VYSOKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-29a-2 7q32 NÍZKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-29b-2 1q32 NÍZKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-29c 1q32 NÍZKÁ1 NÍZKÁ2 miR-146 5q34 VYSOKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-155 21q21 VYSOKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-195 17p13 VYSOKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-221 Xp11.3 VYSOKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-223 Xq12 NÍZKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-34a 1p36 NEZMĚNĚNA2 NÍZKÁ2 miR-17-5p 13q31 NEZMĚNĚNA2 NÍZKÁ2 miR-142 NÍZKÁ2 NEZMĚNĚNA2 Je to k něčemu dobré i v medicíně? Expression microarrays pro microRNAs: o velmi malé molekuly – 22nt – specifikum izolace, specifické značení i design sond o malé zastoupení ve vzorku – separace microRNA o v lidském genovu cca 1000 genů – menší počet sond na čipu o některé mají velmi podobnou sekvenci – rozdíl 1nt o pre-miR, pri-miR, mature-miR o málo se ví o jejich funkcích – obtížná interpretace výsledků o zatím málo zkušeností a standardizace 1. 2. 3. Li and Ruan, 2009 3/ Labeling – značení:  Není možný labeling pomocí značených polyT při reverzní transkripci  Přímé značení (direct labeling) – většinou nějaká fluorescenční barva  Nepřímé značení (indirect labeling) – probíhá krok reverzní transkripce/PCR Přímé značení: Jednoduché, rychlé a „čím méně kroků tím méně vnesených chyb a variability“ 1/ Značení guaninu v microRNA Flurochromem vážícím se na guanin jsou označeny miRNA (Ulysis Alexa Flour 546/647) Všechny lidské miRNA obsahují guanin, ale v různém množství Nemožnost usuzovat na vzájemnou expresi různých miRNA (různý obsah guaninu) (Babak et al., 2004) 2/ Značení pomocí Poly (A) polymerázy Můžu se rozhodnout jak dlouhý bude poly(A) a tím ovlivnit sílu signálu (Shingara et al., 2005) 3/ značení chemickou metodou 3‘OH skupina je oxidována na dialdehyd Následuje reakce s Biotin-X-hydraxidem –> Biotinilovaná miRNA Vazba fluoresceční molekuly-quantum dot (Liang et al., 2005) 4/ značení pomocí T4 ligasy Krátký značený oligonukleotid je připojen T4 ligásou k 3‘konci Výhodou je přednostní vazba na RNA o velikosti 18-30bp ->total RNA (Thomson et al., 2004; Castoldi et al., 2007) Nepřímé značení: Značen je produkt reverzní transkripce či RT-PCR Výhody: cDNA je pak stabilní a lze uchovat, Pre-amplifikace a tím snadnější detekce méně exprimovaných miRNA 1/ značení revezního transkriptu miRNA Reverzní transkripce pomocí náhodných 8-merů značených 2 biotiny (3‘-(N)8 – (A)12-biotin-(A)12-biotin-5‘ (Liu et al., 2004) Reverzní transkripce pomocí náhodných neznačených 7-merů, následně označeny s pomocí terminální transferázy a biotin-dideoxy-UTP (Sun et al., 2004) Nebezpečí chyb z nespecifické vazby primeru 2/ značení produktu RT-PCR Výhoda: snadná pre-amplifikace Dva adaptory fluorescenčně-značený primer (k adaptoru) (Miska et al., 2004) Nevýhoda: antisense strand přítomen při hybridizaci Rešením je různá délka sense a antisense ->PAGE (Baskerville, 2005) 3/ značení in vitro transkriptu Jeden z adaptorů je promotor T7 RNA polymerázy (Barad et al. 2004) 3/ Microarrays/ Próby: Problémy: krátké RNA, malé rozdíly v sekvenci, Tm Tm – melting temperature určité próby T – hybridizační teplota TmT ..........vyšší efektivita vazby miRNA Je třeba navrhnout próby tak,a by měly všechny podobnou Tm To se u „dlouhých“ mRNA řeší vhodným výběrem oblasti genu k němuž bude sonda komplementární nebo délkou sondy  navíc některé miRNA jsou téměr sekvenčně totožné Baskerville and Bartel, 2005 ÚPRAVA DÉLKY PRÓBY Li and Ruan, 2009 ÚPRAVA SÍLY VAZBY NUKLEOTIDŮ LNA próby (Locked Nucleic Acid) ribózový kruh je „uzamčen“ methylenovým můstkem mezi atomy 2´-O a 4´-C Použití LNA pro některé báze v próbě SPECIFITA VAZBY: LNA próba (Castoldi et al., 2006) SÍLA VAZBY: LNA vs DNA próba Tm až 720C (Castoldi et al., 2006) DÁ TO HODNĚ PRÁCE miRCURY LNA Array, Exiqon : 3 dny Co se nemusí podařit: Nekvalitní RNA Nepodaří se značení Nepodaří se hybridizace Nepodaří se promývání Technická variabilita čipů je větší než ta biologická Nepodaří se validace dat pomocí RT-PCR, atd Práce s miRNA čipy je velmi obtížná. Všeobecně nižší míra standardizace. Obtížná interpretace získaných dat z pohledu biologického smyslu např. deregulace několika miRNA (nádor vs. zdravá tkáň apod.) microRNA exprese je schopná rozlišit původ nádoru Lu et al. Nature 435: 834, 2005 Chronická lymfatická leukémie a microRNA  nejčastější leukémie dospělé populace !!!  Projevy: krvácení, anémie, zvětšení uzlin a sleziny, infekce, hubnutí  nádorovými buňkami jsou B lymfocyty (hromadí se v periferní krvi)  prognóza onemocnění velmi variabilní (měsíce vs. desítky let)  patogeneze není prakticky známa Rai Blood 46:219, 1975 Value Stage Risk Median Survival Lymphocytosis (wbc > 15,000/mm3) 0 Low 12.5 years Lymphocytosis + nodal involvment I Int 8.5-9 years Lymphocytosis + organomegaly II 5-6 years Anemia III High 9 months Thrombocytopenia IV 9 months CLL Prognóza • High Rai / Binet staging • Lymphocyte doubling time < 6 mo – Montserrat Br J Hematol 62:567, 1986 • B2M elevated – Hallek M Leuk Lymph 22:439,1996 • sCD23 elevated • Specific Genetic abnormalities – + 12 – 11q- / del 11q22-23 (ATM) – 17p- / del 17p13 (P53) • CD38 positive • Unmutated Ig Vh gene – Hamblin Blood 94:1848, 1999 • ZAP-70 positive – Crespo NEJM 348:1764, 2003 Nepříznivá: Hamblin et al., 1999 Crespo et al., 2003 NEJM 353:1793, 2005 Design • n=94 CLL pt. samples for initial dataset • Known clinical outcome data and ZAP-70 and IgVh mutation status (retrospective) – Zap-70 - >20% or < 20% – IgVh status – mutated or unmutated based on sequencing (>98% homology cutoff) • microRNA microarray analysis of 245 miRNAs (a subset of known miRNA) NEJM 353:1793, 2005 94 CLL patients Group 1 N=36 ZAP-70 + Unmutated IgVh Group 3 N=1 ZAP-70 Unmutated IgVh Group 4 N=47 ZAP-70 Mutated IgVh Group 2 N=10 ZAP-70 + Mutated IgVh miRNA micro-array (supervised) 13 miRNA signature (all mature): discriminates group 1 from group 4 (p < 0.01) NEJM 353:1793, 2005 94 CLL Patients (41 treated) Time to Initial Treatment Data Supervised PAM “Survival” Analysis: Time to Initial Treatment Short 44 +/- 39 months Long 88 +/- 42 months Děkuji za pozornost MUDr. Mgr. Marek Mráz marek.mraz@email.cz 26/11/10 CMBGT, Microarrays LÉKAŘSKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERSITY Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno Centrum molekulární biologie a genové terapie