LÉKAŘSKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERSITY
Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno
Centrum molekulární biologie a genové terapie
Moderní metody analýzy genomu
Masivně paralelní sekvenování III
25.11. 2011
Boris Tichý
Sekvenování (hybridizací a) ligací
Masivně paralelní sekvenování
Masivně paralelní sekvenování
Technologie SOLiD (Life Technologies (Applied Biosystems))
emPCR
Sekvenování ligací
Velká kapacita, krátké fragmenty (75)
Silné zázemí, nízká cena za bázi
Dvoubázové kódování, řetězení ligací
Chemie
Fluorescenčně značené oligonukleotidy (4 barvy)
Pool všech oligonukleotidů/cyklus
Masivně paralelní sekvenování Technologie SOLiD
Masivně paralelní sekvenování Technologie SOLiD
Masivně paralelní sekvenování Technologie SOLiD
Masivně paralelní sekvenování Technologie SOLiD
Masivně paralelní sekvenování Technologie SOLiD
Výhody
Velká kapacita (desítky Gb)
Automatizace ?
Rozšíření
Množství aplikací
Cena za bázi
Přesnost ?
Nevýhody
Rychlost (1 běh až 10 dní)
(Cena)
Dostupné přístroje
5500 xL
5500
SOLiD 3
SOLiD 4
Masivně paralelní sekvenování
Technologie Polonator
emPCR
Sekvenování ligací
(zatím) krátké fragmenty (26 ← 2x 13)
Otevřená technologie
Kapacita až několik Gb
Chemie
Fluorescenčně značené oligonukleotidy (4 barvy)
Pool nukleotidů/cyklus
Masivně paralelní sekvenování Technologie Polonator
Masivně paralelní sekvenování Technologie Polonator
Masivně paralelní sekvenování Technologie Polonator
Dostupné přístroje
G.007
Výhody
Otevřená technologie
Pořizovací cena ($170k)
Cena za bázi ?
Nevýhody
Velmi krátké sekvence (7-8 nukleotidů)
Rozšíření ?
Masivně paralelní sekvenování
Technologie cPAL (Complete Genomics)
Rolling circle amplification (RCA)
Sekvenování ligací
“DNA nanoballs” uspořádané do mřížky na sklíčku
(zatím) krátké fragmenty (2x 35)
Pouze služba – Complete Genomics
Velmi nízká cena (< $2000/lidský genom)
Chemie
Fluorescenčně značené oligonukleotidy (4 barvy)
Pool oligonukleotidů/cyklus
Class IIs restriction
endonucleases
400 – 500 bp
Masivně paralelní sekvenování Technologie cPAL
Masivně paralelní sekvenování Technologie cPAL
Masivně paralelní sekvenování Technologie cPAL
> 2,5 miliardy jamek na ploše velikosti podložního sklíčka (rozestup 0,7 mikrometru)
Masivně paralelní sekvenování Technologie cPAL
Sekvenování - 10 bazí na obě strany od každého adaptoru
Masivně paralelní sekvenování Technologie cPAL
Dostupné přístroje
Pouze služba
Výhody
Nízká cena
Nevýhody
Pouze služba
Krátké fragmenty
Spektrum aplikací
Masivně paralelní sekvenování
Technologie SMRT (Pacific Biosciences)
Single Molecule Real Time
Sekvenování syntézou
ZMW – Zero Mode Wavelength – velmi malé reakční jamky
I velmi dlouhé fragmenty – až několik kb
Opakované čtení stejné molekuly – Circular consensus sequencing
4tení pouze částí velmi dlouhých fragmentů – strobe sequencing
Krátce na trhu
Chemie
Fluorescenčně značené nukleotidy (4 barvy)
Nemá cykly ← real-time
Masivně paralelní sekvenování Technologie SMRT
With an active polymerase
immobilized at the bottom of each
ZMW, nucleotides diffuse into the
ZMW chamber. In order to detect
incorporation events and identify
the base, each of the four
nucleotides A, C, G and T are
labeled with a different fluorescent
color. Since only the bottom 30nm
of the ZMW is illuminated, only
those nucleotides near the bottom
fluoresce.
http://www.pacificbiosciences.com/aboutus/video-gallery
http://www.dnatube.com/video/3003/SMRT-DNA-Sequencing
Masivně paralelní sekvenování Technologie SMRT
Výhody
Velmi dlouhé fragmenty
Single molecule
Nevýhody
Nová technologie
Chybovost ?
Dostupné přístroje
PACBIO RS
Masivně paralelní sekvenování
Oxford Nanopore
Nanopores – exonuclease, strand sequencing
http://www.nanoporetech.com/sequences
Life Technologies
technologie podobná SMRT
fluorescence generovaná během inkorporace nukleotidu
Přenos energie z Qdot nanokrystalu na polymeráze
ZS Genetics, Halcyon Molecular, Toste research group at UC Berkeley
Elektronová mikroskopie vlákna DNA