Moderní metody analýzy genomu
NGS aplikace
Veronika Navrkalová
Středoevropský technologický institut (MU)
a
Interní hematologická a onkologická klinika (FN Brno)
Obsah
• Obecné využití NGS
• Aplikace v různých biologických oborech
• Využití v biomedicíně a onkologii
• Hematoonkologie
• Aplikace při studiu CLL a využití na našem
pracovišti
Stratton 2009
Vývoj sekvenování
• SNV = single nucleotide variants (mutace/SNP)
• CNV = copy number variation (inzerce/delece)
• strukturní aberace (translokace/inverze)
• genová exprese (mRNA)
• epigenetika (metylované oblasti)
• interakce DNA-protein
Obecné využití NGS
Simon 2013
Přístupy NGS
Genom Exom Amplikon Transkriptom
Celogenomové sekv. = WGS
Sekvenace celé chromozomální DNA  úplná
informace o genomu (pokryty i promotorové a
regulační sekvence)
1. De novo asembly - využívá překryvů
sekvencí, předpokladem dostatečné pokrytí
(>10x)
2. Resekvenování - mapování na referenční
sekvenci
Exomové sekv.
• WES = whole exome sequencing
• Sekvenování jen kódujících oblastí = exom (asi
1 % genomu)
• Efektivnějsí: rychlost, cena,
vyšší pokrytí
Cílené sekv.
• Targeted sequencing
• Identifikace vzácnějších variant pod detekčním
limitem Sangera (až 1% při vysokém pokrytí)
• Výhody: rychlost, cena, méně prostoru pro
skladování dat
• Pro sekvenování velkého počtu vzorků
(screening) nebo validaci genetických variant v
populaci
Tři způsoby přípravy knihovny
1. multiplex PCR: AmpliSeq (Life Tech.) až 6144 párů
primerů
2. single-plex PCR: Microdroplet PCR (RainDance
Tech.), Access Array System (Fluidigm)
3. targeted capture (cílený „záchyt“ sondami) s
následnou multiplex PCR: TrueSeq Amplicon
(Illumina), HaloPlex (Agilent Tech.), SeqCap EZ
technology (Roche NimbleGen)
Klinické využití
• Nejvhodnější „targeted capture“
• Komerční kity:
• diagnostické kity (panely genů různých
onemocnění)
• nádorové panely (záchyt hereditárních nádorových
onemocnění)
• panely genů dle přání zákazníka
Transkriptom =
soubor všech
molekul RNA
(mRNA, rRNA,
tRNA a noncoding
RNA)
Sekv. transkriptomu = RNA seq
Wang 2009
• Detekce somatických mutací, mezigenových
fúzí a alternativních sestřihových variant
• Studium ncRNA: regulace proliferace,
diferenciace a apoptózy, regulace genové
exprese (miRNA)
• Na rozdíl od čipových technologií není
limitována předchozí znalostí genomu,
dynamickým rozlišením nebo zkříženou (cross)
hybridizací
NGS a epigenetika
Metylace DNA: 80% C, umlčení transkripce genů
Bisulfitová konverze + NGS:
• konverze C  U, Met-C se
nemění
• přesná identifikace jednotlivých
metylovaných bazí
ChIP- Seq
• Sledování interakcí
mezi proteiny, DNA a
RNA  vazebná místa
pro TF, histony, a další
proteiny
• Regulace genové
exprese, epigenetické
modifikace chromatinu
Mundade 2014
Studium druhové diverzity (genotypizace):
• fylogeneze živočišných druhů (Ellegren 2012)
• identifikace nových virových variant (Kapgate 2015)
• šlechtění plodin v zemědělství (Fridman 2012)
Mezioborové využití NGS
Metagenomika: studium mikrobiálního složení v
různých typech prostředí (střevní mikroflóra,
zubní plak, půda, korálové útesy, mořské dno)
• bez potřeby kultivace
• identifikace patogenů,
virulence, rezistence, atd.
Padmanabhan 2013
Forenzní
genetika:
Yang 2014
Využití v medicíně
• molekulární diagnostika dědičných chorob a
infekčních onemocněních
• prenatální diagnostika (neinvazivní, z fetální
DNA v mateřské plazmě)
• farmakogenomika (identifikace nových
terapeutických cílů, studium rezistence)
• onkologie!
Onkologie
• molekulární diagnostika nádorů
• analýza prognostických markerů
• objasnění mechanizmů kancerogeneze
(mutační profily nádorů)
• hledání nových rekurentně mutovaných genů
(nezachytitelných standardními metodami)
Přínos NGS v onkologii
• RNA seq: objev nových fúzí genů  mohou
být využity jako dg markery a potenciální
terapeutické cíle (tkáňově specifické nebo
univerzální)
• translokace EML4- ALK u nemalobuněčného
karcinomu plic
• translokace TMPRSS2- ERG u karcinomu prostaty
(Dong 2012)
• Identifikace germinálních mutací (WES):
• familiární nádory pankreatu (PALB2)
• dědičný feochromocytom (MAX)
• familiární melanom (MITF)
• Cílené sekvenování:
• detekce 21 nových mutací BRCA asociovaných s
hereditárními nádory mléčné žlázy a vaječníku
(neodhalitelné Sangerem a MLPA) (Walsh 2010)
NGS 
personalizovaná
léčba
Koubkova 2014;
Guan 2012
International Cancer Genome Consortium (ICGC):
Cancer GenomeProjekt – charakterizace
genomických, transkriptomických a
epigenomických změn u 50 nejdůležitějších
nádorů
Využití NGS v onkologické praxi
National Cancer Institute (NCI): projekt vytvoření
atlasu nádorových genů – The Cancer Genom
Atlas (TCGA) za účelem zlepšit nádorovou
prevenci, včasnou detekci a léčbu
Hematoonkologie
První celogenomový sekvenační projekt 2008:
porovnání nádorového a normálního vzorku
téhož pacienta s AML  identifikace osmi
nových somatických mutací (Ley 2008)
Studium klonální evoluce AML pomocí WGS:
identifikace somatických mutací objevujících se
při relapsu (pravděpodobně díky cytotoxické
terapii)
Ding 2012
DLBCL
Identifikace nových genů zahrnutých v patogenezi
 předefinování typů DLBCL a …
…. nalezení nových potenciálních terapeutických
cílů
Jardin 2014
CLL
Objev nových rekurentně mutovaných genů (WGS,
WES) – SF3B1, NOTCH1, BIRC3, MYD88 
(Wang 2011, Puente 2012, Quesada 2012)
Wang 2011
 defekty zahrnuty v
několika signalizačních
drahách
Wang 2011
Klonální architektura CLL – časné klonální
(del13q, tri12, MYD88) a pozdější subklonální
aberace (TP53, SF3B1)  selekce léčbou a
rychlejší progrese
Landau 2013
Landau 2013
Model vývoje CLL
Klinický dopad TP53 subklonů – ultra-deep
sequencing (median alel. frekvence 2%)  špatné
přežití, evoluce klonu při relapsu a účast na vzniku
chemorezistence
Rossi 2014
Naše zkušenosti (IHOK FN Brno a
CEITEC)
Přechod od čipových technologií k NGS – flexibilita,
citlivost, rychlost, cena, přesnost
• Ultra-deep sekv. (MiSeq) – klonální evoluce mutací v
TP53 u CLL (Malcikova 2014)
• Detekce ATM mutací u CLL a MCL (Miseq)
• Exomové sekv. (NextSeq) – germinální mutace u
hematologických malignit
• Celogenomové sekv. (EMBL, Heidelberg)
Nevýhody NGS
Limity zavedení do klinické praxe:
• cena celogenomového sekvenování (cíl 1 000
$ /běh/pokrytí 30x, Illumina)
• obrovské množství generovaných dat (otázka
uchovávání  vysoké náklady)
• absence standardu pro určení kvality sekv.
dat, rozdílné bioinformatické strategie
• etická otázka nakládání s NGS daty
Literatura
• Stratton 2009: The cancer genome.
• Simon 2013: Implementing personalized cancer genomics in clinical trials.
• Wang 2009: RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics
• Meaburn 2012: Next generation sequencing in epigenetics: insights and
challenges.
• Mundade 2014: Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor
binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and
beyond.
• Padmanabhan 2013: Genomics and metagenomics in medical microbiology.
• Ellengren 2012: The genomic landscape of species divergence in Ficedula
flycatchers.
• Kapgate 2015: Next generation sequencing technologies: Tool to study avian
virus diversity.
• Fridman 2012: Next-generation education in crop genetics.
• Yang 2014: Application of next-generation sequencing technology
in forensic science.
• Dong 2012: Exploring the cancer genome in the era of next-generation
sequencing.
• Walsh 2010: Detection of inherited mutations for breast and ovarian cancer
using genomic capture and massively parallel sequencing.
• Koubkova 2014: Sekvenování nové generace a možnosti jeho využití v
onkologické praxi
• Guan 2012: Application of nextgeneration
sequencing in clinical oncology to advance personalized treatme
nt of cancer.
• Ley 2008: DNA sequencing of a cytogenetically normal acute
myeloid leukaemia genome.
• Ding 2012: Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed
by whole-genome sequencing.
• Jardin 2014: Next generation sequencing and the management of diffuse
large B-cell lymphoma: from whole exome analysis to targeted therapy.
• Wang 2011: SF3B1 and Other Novel Cancer Genes in Chronic Lymphocytic
Leukemia
• Landau 2013: Evolution and Impact of Subclonal Mutations in Chronic
Lymphocytic Leukemia
• Rossi 2014: Clinical impact of small TP53 mutated subclones in chronic
lymphocytic leukemia.
Děkuji za
pozornost