Praktikum z histologie a embryologie Program 1. praktika •obecné informace (organizace výuky) •histologie a embryologie (co je předmětem studia) •zpracování tkání (laboratorní metody) •demonstrace histologických preparátů (barvení různými metodami) Zápočet  100% účast v praktických cvičeních  Každý student je vyzkoušen 4x za semestr  Zkouší se písemně zejména znalost základních struktur a jejich odborné (latinské) názvy na základě připravených obrázků, součástí testu jsou i otázky z učiva aktuálního praktika  Pro získání zápočtu je nutné splnit všechny testy  V případě neúspěchu je možná jedna oprava, poté následuje ve stejném zkouškovém období opravný zápočtový test (dle SZŘ) pokrývající celý semestr  Obrázky jsou/postupně budou/ přístupné v MedAtlasu nebo studijních materiálech praktik  V případě neúspěchu u opravného testu, nebude zápočet udělen. Omluvenky z termínu opravného testu pouze cestou IS. Nahrazování praktik • omluvy na základě neschopenky, jinak výjimečně po předchozí domluvě se svým vyučujícím • nahrazování oznámit vedoucímu paralely (tomu, kdo má výklad) • zapsat se do sešitu (před nebo po výkladu) • na konci praktika předložit vedoucímu praktika protokol k podpisu DOPORUČENÁ LITERATURA Doporučená literatura Ústav histologie a embryologie LF MU Mikroskopická anatomie Obecná histologie ... nebo http://www.med.muni.cz/histology/education HISTOLOGIE • nauka o stavbě normálních, tj. zdravých buněk, tkání a orgánů na mikroskopické a submikroskopické úrovni • cytologie a obecná histologie • speciální histologie = mikroskopická anatomie (stavba orgánů jednotlivých systémů) • význam histologických vyšetření v klinické praxi: onkologie a chirurgie, hematologie, patologie a soudní lékařství EMBRYOLOGIE – nauka o prenatálním (intrauterinním) vývoji jedince • obecná embryologie od gametogeneze po raný embryonální vývoj, vývoj a význam extraembryonálních struktur • speciální embryologie organogeneze (vývoj orgánů v jednotlivých systémech) do konce 2. měsíce – EMBRYO - zárodek od 3. měsíce do porodu – FETUS - plod EMBRYOLOGIE • teratologie – příčiny a projevy vrozených vývojových vad (VVV = malformace = anomálie); metody prenatálního screeningu – ultrasonografie, amniocentéza, genetické vyšetření chromozomálních aberací (diagnostika, prevence a terapie) • význam v klinické praxi: prenatální péče v gynekologii, porodnictví a pediatrii, asistovaná reprodukce Histologie • Rozlišovací schopnost oka – ~ 0,2 mm • Rozlišovací schopnost SM – ~ 0,2 m • Rozlišovací schopnost EM – ~ 0,2 nm Zpracování tkání a orgánů pro vyšetření ve světelném mikroskopu (příprava trvalého histologického preparátu) • ODBĚR vzorků • FIXACE tkáňových bločků • PRANÍ • ZALÉVÁNÍ - (parafinové) bločky • KRÁJENÍ - řezy • NAPÍNÁNÍ A LEPENÍ řezů • BARVENÍ řezů • MONTOVÁNÍ (uzavírání) 1. ODBĚR MATERIÁLU • malý kousek tkáně (orgánu) je odebrán a rychle vložen do fixačního media: • biopsie z živého organizmu (v průběhu chirurgických zákroků; neinvazivní odběr – stěr z povrchu sliznice) = excise (vyříznutí) = punkce (dutou jehlou – jaterní nebo ledvinný parenchym, kostní dřeň) = kyretáž (např. endometrium) • nekropsie z mrtvého organizmu (pitva); laboratorní zvíře • velikost odebraného vzorku do 1 cm3, fixace následuje bezprostředně! • označení Pomůcky k odběru: kyreta trokar – dutá jehla s mandrenem 2. FIXACE • Definice: denaturace a stabilizace proteinů v buňce („šetrné usmrcení buňky“ s minimem artefaktů) • Důvod fixace: chemická nestabilita tkáně – vysoušení, svraštění, autolýza v důsledku působení bakterií, hypoxie; • Fixace má zabránit těmto změnám a stabilizovat strukturu vzorku. Během fixace jsou proteiny konvertovány do inaktivní, denaturované formy. Fixace – fyzikální: vysokou teplotou (var, žíhání nad plamenem), nízkou teplotou (lyofilizace, mrazová substituce – kryoprezervační látky) – chemická Roztoky organických a anorganických látek • imerze – ponoření do fixativa • perfuze – promývání intravenózní aplikací fixativa Požadavky na fixační činidlo • zachovat strukturu • rychle penetrovat do tkáňového bločku • neovlivňovat výsledek barvení Fixační činidla: • organická – ALDEHYDY – formaldehyd (LM) – glutaraldehyd (EM) – ALKOHOL – 96 – 100 % (absolutní etanol) – ORGANICKÉ kyseliny – led. octová, pikrová, trichloroctová • anorganická – ANORGANICKÉ kys. – chromová, osmium tetroxid (OsO4) – SOLI TĚŽKÝCH KOVů – HgCl2 • směsi: FLEMMING (OsO4), ZENKER, HELLY, SUSA (HgCl2), BOUIN (kys. pikrová), CARNOY (alkohol) Postup: fixace – při pokojové teplotě, 12 – 24 hodin, vzorek musí být přelit 20 – 50násobným množstvím fixačního činidla: (1 cm3 : 20 – 50 cm3) PRANÍ a ZALÉVÁNÍ • odstranění fixačního činidla ze vzorku; výběr vypíracího media závisí na fixaci: voda nebo alkohol (70-80%) • důvod zalévání: homogenizace tkání, „tvrzení“ měkkých tkáňových vzorků dobře krájitelnými médii Zalévací média • ve vodě rozpustná – želatina, celodal • ve vodě nerozpustná – parafin, paraplast, celoidin Zalévání do parafinu • dehydratace – odvodnění fixovaných vzorků (parafin se s vodou nemísí) vzestupnou řadou etanolu (50%, 70%, 90%, 96%, 100%, každá lázeň alkoholu 2 – 6 hodin) • projasnění – vytěsnění alkoholu mediem, které se mísí s parafinem – benzen nebo xylen • prosycení (infiltrace) – rozpuštěným parafínem (bod tání 56C); provádí se v TERMOSTATU: parafinová lázeň – 3 x 6 hodin. • vlastní zalití – do komůrek (plastové, papírové nebo kovové). Do komůrek se nalije rozpuštěný parafín a do něj se vloží tkáňové vzorky. Komůrky jsou rychle ochlazeny ponořením do studené vody. Parafinové bločky se po vynětí z komůrek zbaví přebytku parafínu a jsou připraveny ke krájení. odvodňovací tkáňový automat Leica TP 1020 Zalévací komůrky - papírové - kovové s orientačními plastovými prstenci výsledek zalití KRÁJENÍ •Mikrotom – regulace tloušťky řezů: 5 – 10 μm Sáňový mikrotom – blok je upevněný v držáku, nůž nebo břitva se pohybuje horizontálně Rotační mikrotom – nůž je fixní, držák s bločkem se pohybuje vertikálně kryostat = rotační mikrotom v mrazicím boxu (– 60º C); zmrzlou tkáň lze krájet bez zalévání páska řezů parafinový bloček NAPÍNÁNÍ A LEPENÍ ŘEZŮ • Napínání: na hladině teplé vody (45ºC) se řezy narovnají a vypnou • Lepení: z vody jsou řezy přeneseny na podložní skla s adhezivním filmem (želatina nebo směs glycerinbílek) a uloženy do termostatu (37º C). Před barvením se z řezu na skle musí odstranit zalévací medium, které by bránilo průniku barviv. Např. parafin – deparafinace rozpustidlem parafinu, obvykle xylénem. 1 2 3 4 5 7 8 1 – odběr 2, 3 – fixace 4 – zalévání 5, 6 – krájení 7, 8 – napínání řezů 4 6 BARVENÍ • zviditelnění struktur ve tkáni – buňka a její součásti vykazují afinitu k barvivům dvou skupin: • zásaditá /bazická/ barviva („jaderná“) – reagují s kyselými strukturami buněk a tkání (NK v jádře aj.) bazofilie – schopnost vázat bazická barviva • kyselá barviva („cytoplazmatická“) – reagují se zásaditými strukturami acidofilie – schopnost vázat kyselá barviva - struktury chromofilní x chromofobní Hematoxylin a eosin (HE) H (modrý) = zásadité barvivo, E (červený) = kyselé barvivo cytoplazma jádra kolagenní vazivo • ORTOCHROMAZIE- buněčné struktury se barví stejnou barvou, jakou má barvivo (HE) • METACHROMAZIE- posun barevného spektra, buněčné struktury se barví jinou barvou, než jakou má barvivo Příklad: toluidinovou modří se v žírných buňkách barví jádra modře (ortochromaticky) a granula červenofialově (metachromaticky) xylen I xylen II 100% 96% H2O hematoxylin kyselý etanol etanol etanol xylen IV xylen III 100% 96% H2O eosin H2O etanol etanol HEMATOXYLIN – EOSIN (HE) deparafinace rehydratace praní barvení diferenciace projasnění dehdyratace praní barvení praní RUTINNÍ BARVENÍ: HEMATOXYLIN – EOSIN (HE) Postup: • Odstranění parafinu xylenem • Rehydratace „sestupnou“ řadou alkoholů (100% (100%  96%) • Barvení hematoxylinem  jádra - modro-fialová • Diferencování kys. alkoholem a vodou (odstranění přebytku barviva) • Barvení eosinem  růžová - cytoplazma, vazivo, svaly • Praní ve vodě (odstranění přebytku barviva) • Dehydratace „vzestupnou“ řadou alkoholů (96% 100%) • Projasnění v xylenu • Montování ≈ řada boxů (kyvet) s barvivy Barvicí automat MONTOVÁNÍ • uzavření preparátu – kapkou montovacího media a krycím sklíčkem  trvalý preparát • rozpustná v xylenu – kanadský balzám, pertex,.... • rozpustná ve vodě – glycerin-želatina, arabská guma trvalé histologické preparáty ke studiu v SM TYPY BARVENÍ •rutinní, přehledná – HE, AZAN (demonstrují všechny zákl. složky tkáně) •speciální – vizualizace vybraných struktur • Massonovy trichromy: žlutý - HEŠ, modrý AZAN, zelený (kolag.vlákna) • orcein, aldehydový fuchsin (elast.vlákna) aj. •impregnační – AgNO3 (nervová nebo retikulární vlákna) Barvicí metody: přehledné – HE, AZAN demonstrují všechny složky tkání speciální zdůrazňují určité buněčné nebo tkáňové složky impregnační soli Ag, Au nebo Os HE – nejpoužívanější barvení Výsledky barvení: • HE = Hematoxylin – Eosin jádra – modro-fialová cytoplazma a kolagenní vlákna – růžová svalová tkáň – červená • HEŠ = Hematoxylin – Eosin – Šafrán kolagenní vlákna – žlutá • AZAN = AZokarmín – Anilinová modř – oranž G jádra – červená erytrocyty – oranžové svalová tkáň – červená kolagenní vlákna – modrá Hematoxylin a eosin (HE) basofilní x acidofilní cytoplazma fundus ventriculi Hematoxylin, eosin a šafrán (HEŠ) chrupavka kolagenní vlákna žlutá Azokarmín a anilin. modř (AZAN) kolagenní vlákna modrá ren kolagenní vlákna zelená Zelený trichrom Cytologická barvení – podle Heidenhaina kosterní svalová tkáň železitý hematoxylin Cytologická barvení – podle Heidenhaina mitochondrie v hepatocytech Impregnace „stříbrem“ (AgNO3) slezina – retikulární vlákna cerebellum – nervová vlákna Zpracování tvrdých tkání (zub, kost) • dekalcifikace (odvápňování) – převedení nerozpustných vápenatých solí do roztoku pomocí kys. mravenčí, dusičné nebo chelatonu (EDTA), časově náročné – dny až týdny • výbrusy – tenké ploténky (50 – 70 μm) zhotovené postupným zbrušováním materiálu Histochemie & Imunohistochemie zjišťování povahy a lokalizace chemických látek v buňce „in situ“ (průkaz biomolekul - proteinů, AA, NA, sacharidů, lipidů, enzymů, pigmentů, anorg. látek – Fe, Ca, Zn aj.) • Provedení: detekce Ag-Pl* komplexů nebo Ag-Pl + Pl* (sekundární značená Pl) * - marker 1. fluorochromy – rhodamin, Texas red, FITC 2. enzymy – křenová peroxidáza, AF, acetylcholinesteráza, 3. radioizotopy (I125) Aktin (cytoskelet) DAPI (jádro) Mikrotubuly (cytoskelet) KI-67 In-vivo/live cell imaging - US, MRI, PET… - Buňky s fluorescenčním reportérem doi:10.7150/thno.3694 - FACS Zpracování tkání pro elektronovou mikroskopii (EM) Požadavky na pracovní podmínky: • pH všech roztoků (medií) 7,2 – 7,4 (pufry – kakodylátový, fosfátový, ...) • bezprašnost • roztoky (media) – šetrné působení na tkáně (minimum artefaktů) POSTUP • ODBĚR – okamžitá fixace, velikost tkáňového bločku do 1 mm3 • FIXACE – glutaraldehyd (vazba aminoskupin) + OsO4 (vazba lipidů) – dvojitá fixace • PRANÍ – destilovaná voda • DEHYDRATACE - alkohol • ZALÉVÁNÍ – zalévací media rozpustná nebo nerozpustná ve vodě (polymerizace – změna skupenství). Epoxidové pryskyřice (Epon, Araldit), polyestery, metakryláty. Zalévací komůrky: želatinové (1), plastové (2) nosiče (držáky) kapslí (3) silikonové ploténky s komůrkami (4, 5) bločky připravené pro krájení 1 2 3 4,5 KRÁJENÍ • ultramikrotomy, řezná plocha 0.1 mm2, uzltratenké řezy (70 – 100 nm) • skleněné nebo diamantové nože s vaničkou – řezy splývají na hladinu vody a jsou přeneseny na síťky (Cu, Ni) Ultramikrotomové nože: skleněný diamantový Krájení, nosné síťky Síťka se 3 páskami řezů typy sítěk KONTRASTOVÁNÍ • princip odlišení struktur – rozptyl svazku elektronů v závislosti denzitě struktur ; „elektronová barviva“ – směsi těžkých kovů: uranylacetát nebo citrát olovnatý Na kapce barviva je položena nosná síťka tak, aby ultratenké řezy byly vystaveny působení barviva. Rozdíly mezi SM a EM SM EM Odběr  1 cm3 minuty  1 mm3 sekundy Fixace formaldehyd 12 – 24 hod. glutaraldehyd 1 – 3 hod. Zalévání parafin epoxid. pryskyřice (Durcupan) Krájení Tloušťka řezů mikrotom 5 – 10 m ultramikrotom 50 – 100 nm Barvení (LM) Kontrastování (EM) barviva (hematoxylin – eosin) těžké kovy (uranylacetat, citrát Pb) Montování + --- Výsledek histologický preparát foto z fluoresc. stínítka - elektronogram Děkuji za pozornost