Katedra laboratorních metod LF MU
Bakalářské studium - Zdravotní laborant Instrumentální technika-praktická cvičení
Praktické cvičení č.
datum
jméno
Téma praktika:
Stanovení kyseliny vanilmandlové, homovanilové a hydroxyindoloctové v moči metodou HPLC.
Přístroje a pomůcky:
Kapalinový chromatograf (HPLC) ...BIO-RAD Elektrochemický (vodivostní) detektor Pipety, laboratorní sklo
VMA/HVA/5-HIAA by HPLC Reagent Kit Bio-Rad Úkoly:
1) Seznámit se s preanalytickou přípravou vzorku moče
2) Seznámit se s hlavními částmi chromatografu a jejich funkcemi
3) Vyhodnocení chromatografického záznamu (standard, vzorek)
4) Vypočítat odpad kyseliny vanilmandlové, homovanilové a hydroxyindoloctové v moči
1) preanalytická příprava vzorku moče na SPE kolonkách
a) příprava směsného vnitřního standardu
lOOul INT STND 1 + lOOul INT STND 2 + 0,9 ml REAG 1 - promíchat
b) příprava vzorku (kalibrátoru, kontroly)
50 u.1 moče + 50 pl směsného vnitřního standardu + 1 ml REAG 1 - promíchat
c) příprava SPE kolonky
1 ml REAG 1 - centrifugace 1 min. 2000 otáček/min. 500 pl připraveného vzorku - centrifugace lmin./2000 ot./min. 1 ml REAG 1 - - centrifugace 1 min. 2000 otáček/min. - promytí 2x - eluát vylít kolonku vložit do čisté zkumavky 1 ml REAG 2 - centrifugace 1 min. 2000 otáček/min. 1 ml REAG 2 - centrifugace 1 min. 2000 otáček/min. d) promíchaný eluát aplikovat do přístroje - 20 jul
1
Katedra laboratorních metod LF MU
Bakalářské studium - Zdravotní laborant Instrumentální technika-praktická cvičení
2) seznámit se s hlavními částmi chromatografu a jejich funkcí
demonstrace přístroje
3) vyhodnocení chromatografického záznamu (standard, vzorek)
Identifikujte jednotlivé píky ve vzorku podle retenčního času daného analytu ve standardu.
4) vypočítat odpad kyseliny vanilmandlové (VMK), homovanilové (HVK) a hydroxyindoloctové (HIOK) v moči z výšky píku
Vysvětlivky:
c = koncentrace standardu příslušného analytu
151 = vnitřní standard pro VMK/HVK
152 = vnitřní standard pro HIOK f1 = faktor pro VMK/HVK
f2 = faktor pro HIOK
RT = retenční čas
V = objem moče v litrech
Standard
analyt	RT (min.)	výška píku peak hight (mm)		koncentrace st (umol/1)
VMK				85
HVK				94
HIOK				164
IS1 - VMK/HVK				
IS2 - HIOK				--------
Vzorek diuréza
analyt	RT (min)	výška píku	faktor	koncentrace
		peak hight (mm)		(u.mol/24 hod)
VMK				
HVK				
HIOK				
IS 1 - VMK/HVK				
IS2- HIOK				
2
Katedra laboratorních metod LF MU
Bakalářské studium - Zdravotní laborant Instrumentální technika-praktická cvičení
výška píku IS1(VMK, HVK) ve standardu f1 =------------------------------------------
výška píku IS1(VMK,HVK) ve vzorku
výška píku IS2(HIOK) ve standardu f 2 =------------------------------------------
výška píku IS2(HIOK) ve vzorku
výška piku VMK ve vzorku
VMK = ------------------------------------- x c x f1 x V
umol/24 hod   výška piku VMK ve štandardu
výška piku HVK ve vzorku
HVK = ------------------------------------- x c x f1 x V
umol/24 hod   výška piku HVK ve štandardu
výška piku HIOK ve vzorku
HIOK = -------------------------------------- x c x f2xV
umol/24 hod   výška piku HIOK ve štandardu
3