1 Enzymy Biochemický ústav LF MU ET,JD 2016 2 •snižují aktivační energii Þ urychlují reakce •účinnost o mnoho řádů vyšší než u jiných katalyzátorů •reakce s enzymem jsou o 106-1014 rychlejší než bez enzymu •nemají vliv na rovnovážnou konstantu K •z reakce vycházejí nezměněny •poměrně málo stabilní • Kdyby reakce v biol. systémech nebyly katalyzovány enzymy, byly by tak pomalé, že by nemohly zajistit existenci živé hmoty Enzymy jsou biokatalyzátory 3 Specifičnost enzymů je dvojí •Účinková •z možných reakcí substrátu katalyzují pouze jedinou • • •Substrátová •z možných substrátů pro určitou reakci si vybírají jediný (nebo jedinou skupinu substrátů) •často stereospecifické 4 Názvy enzymů jsou dvojí •Doporučené triviální •zjednodušené •některé historické • (pepsin, amylasa, lipasa) • • •Systematické •přípona -asa •obsahují informaci o substrátu a typu reakce •číselný kód EC EC (Enzyme Commission) of International Union of Biochemistry (IUB) major class number . subclass number . sub-subclass number . enzyme number http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/ 5 Příklady názvů •Doporučený triviální název: alkoholdehydrogenasa •Systematický název: EC 1.1.1.1 ethanol:NAD+-oxidoreduktasa •Reakce: ethanol + NAD+ ® acetaldehyd + NADH + H+ •Doporučený triviální název: alaninaminotransferasa (ALT) •Systematický název: EC 2.6.1.2 L-alanin:2-oxoglutarát-aminotransferasa •Reakce: L-alanin + 2-oxoglutarát ® pyruvát + L-glutamát 6 Klasifikace enzymů: šest tříd podle typu reakce [každá třída má další podtřídy] Třída enzymu Obecné schéma reakce 1. Oxidoreduktasy Ared + Box D Aox + Bred 2. Transferasy A-B + C ® A + C-B 3. Hydrolasy A-B + H2O ® A-H + B-OH 4. Lyasy A-B D A + B (opačný směr: synthasy) 5. Isomerasy A-B-C D A-C-B 6. Ligasy (synthetasy) A + B + ATP ® A-B + ADP + Pi 7 1 Oxidoreduktasy •katalyzují oxidaci nebo redukci substrátu • podtřídy: •dehydrogenasy katalyzují transfer 2 H atomů •oxygenasy katalyzují zabudování jednoho nebo dvou O atomů do substrátu (monooxygenasy, dioxygenasy) •oxidasy katalyzují transfer elektronů mezi substráty • (cytochrom-c-oxidasa, ferroxidasa) •peroxidasy katalyzují rozklad peroxidů Příklad: laktát + NAD+ D pyruvát + NADH + H+ Doporučený název: laktátdehydrogenasa Systematický název: (S)-laktát:NAD+ oxidoreduktasa 8 2 Transferasy •katalyzují transfer skupiny za jednoho substrátu na druhý •Podtřídy: •aminotransferasy, methyltransferasy, glukosyltransferasy •kinasy - fosforylace substrátů = transfer fosforylu PO32– z ATP na substrát (hexokinasy, proteinkinasy) Příklad: glukosa + ATP ® glukosa-6-P + ADP Doporučený název: glukokinasa Systematický název: ATP:D-glukosa fosfotransferasa 9 Příklad: glukosa-6-P + H2O ® glukosa + Pi Doporučený název: glukosa-6-fosfatasa Systematický název: glukosa-6-fosfát fosfohydrolasa 3 Hydrolasy •katalyzují hydrolytické štěpení esterů, glykosidů, amidů, peptidů apod. podtřídy: •esterasy (lipasy, fosfolipasy, ribonukleasy, fosfatasy) •glykosidasy (sacharasa, maltasa, laktasa, amylasa) •proteinasy a peptidasy (pepsin, trypsin, kathepsiny, kaspasy, dipeptidasy, karboxypeptidasy, aminopeptidasy) •amidasy (glutaminasa, asparaginasa) •ATPasy (štěpí anhydridové vazby v ATP) 10 4 Lyasy katalyzují nehydrolytické štěpení nebo vznik vazeb C–C, C–O, C–N, C–S odstraněním nebo přidáním malé molekuly jako H2O, CO2, NH3 • amoniak lyasy (histidinamoniaklyasa: histidin ® urokanát + NH3) • dekarboxylasy aminokyselin (aminokyselina ® amin + CO2) • aldolasy (štěpení nebo vznik aldolu) • dehydratasy/hydratasy (karbonátdehydratasa: CO2 + H2O D H2CO3) Příklad: fumarát + H2O D L-malát Doporučený název: fumaráthydratasa Systematický název: (S)-maláthydrolyasa 11 5 Isomerasy •katalyzují intramolekulární přesmyky, příklady: •epimerasy •racemasy •mutasy Příklad: UDP-glukosa ® UDP-galaktosa Doporučený název: UDP-glukosa 4-epimerasa Systematický název: UDP-glukosa 4-epimerasa 12 6 Ligasy •katalyzují vznik vazeb C–C, C–O, C–N za současného štěpení ATP •karboxylasy •synthetasy • (glutaminsynthetasa: glutamát + ATP + NH3 ® glutamin + ADP + Pi) • • Příklad: pyruvát + CO2 + ATP + H2O ® oxalacetát + ADP + Pi Doporučený název: pyruvátkarboxylasa Systematický název: pyruvát:CO2 ligasa 13 Tři různé složky v enzymové reakci kofaktormodif enzym substrát kofaktor D produkt + + 1.substrát(y) 2.kofaktor 3.enzym katalyzuje (= koordinuje + urychluje) reakci přímo spolu reagují Poznámky: • substrát může být jeden nebo dva (dehydrogenace × transaminace) • substrát může být nízko / vysokomolekulární (hexokinasa × proteinkinasa) • některé reakce probíhají bez kofaktoru (např. hydrolýzy) • reakce může vratná i nevratná (dehydrogenace × dekarboxylace) 14 Kofaktory enzymů jsou deriváty vitaminů •Kofaktory jsou nízkomolekulární neproteinové sloučeniny •přenášejí 2 H nebo e- ® oxidoreduktasy •přenášejí skupiny ® transferasy •pevně vázané - prostetická skupina •volně vázané - koenzymy (kosubstráty) • 15 Kofaktor - oxidovaná forma Vitamin Funkce kofaktoru NAD+ NADP+ FAD Lipoát (-S-S-) Ubichinon (Q) Glutathionoxid (G-S-S-G) Niacin (B3) Niacin (B3) Riboflavin (B2) -- --- -- NAD+ akceptor 2 H NADPH+H+ donor 2 H FAD akceptor 2 H antioxidant / přenos acylu přenos 2 elektronů a 2 H+ 2 GSH donorem 2 H Příklady kofaktorů oxidoreduktas – vztah k vitamínům 16 Kofaktor Vitamin Přenášená skupina pyridoxalfosfát ATP karboxybiotin CoA-SH tetrahydrofolát Methylkobalamin Thiamindifosfát Pyridoxin (B6) (Vzniká v těle) Biotin (H) Pantothenová kys. (B5) Listová kys. (folát) (B11) Kyanokobalamin (B12) Thiamin (B1) -NH2 (transaminace) -PO32- (fosforyl) CO2 acyl C1 skupiny -CH3 zbytek některých oxokyselin Příklady kofaktorů transferas – vztah k vitaminům 17 17 Přehled hydrofilních vitaminů vitamin název zdroj účinek deficit DDD (mg) C L-askorbát Čerstvé ovoce, zelenina antioxidant Únava, infekce, krvácení z dásní 60 B1 thiamin Maso, vejce, celozrnné obilniny, kvasnice Koenzym thiamin-difosfát Únavnost, svalová slabost, sklon k neuritidám 1,5 B2 riboflavin Vejce, mléko, játra, obilniny, kvasnice Kofaktor FMN, FAD Postižení sliznic 1,8 B6 pyridoxin Maso, játra, obilné klíčky, kvasnice Kofaktor transaminace Postižení sliznic, zmatenost, deprese 2 B3 niacin Maso, játra (částečně vzniká v buňkách) Kofaktory NAD,NADP Diarhea, demence, dermatitis – 3D 20 B12 kobalamin Živočišné potraviny Kofaktor methylací anemie 0,002 B11 Listová kyselina Listová zelenina, játra Kofaktor přenašející jednouhlíkaté zbytky anemie 0,2 B5 Panthothenová kys. Játra, mléko, vejce Součást koenzymu A Deprese, nespavost 10 H biotin Žloutek, játra (částečná syntéza ve střevech) Kofaktor karboxylace Anorexie, ztráta vlasů 0,1 18 Metaloenzymy •obsahují funkční kovové ionty, které se přímo účastní katalyzované reakce, ionty kovu vázány poměrně pevně (Enz-M) •některé enzymy potřebují ionty kovů pouze k aktivaci, v tom případě jsou vázány slabě (Enz …M), ionty dvojmocných kovů, Ca2+ (koagulační faktory), Mg2+ (kinasy) 19 Vazba substrátu na enzym •vazba substrátu do aktivního místa vyvolá odpovídající konformační změnu molekuly enzymu (indukované přizpůsobení) •vytvoří se komplex enzym-substrát (ES), který se rozpadne na produkt a enzym 20 Faktory ovlivňující enzymové reakce 21 21 Rychlost enzymové reakce •reakce: S ¾® P (S = substrát, P = produkt) •definice reakční rychlosti: • 22 22 Na čem závisí rychlost enzymové reakce? •na koncentraci substrátu •na teplotě •na přítomnosti efektoru (katalyzátoru, inhibitoru) 23 23 Koncentrace substrátu během reakce klesá Þ kinetická křivka 24 24 Z kinetické křivky se zjistí rychlost 25 25 Reakce 0. řádu je zvláštní případ •rychlost reakce nezávisí na koncentraci substrátu (S) •v = k [S]0 = k . 1 = k = konstanta •nastává při velkém nadbytku S, takže jeho úbytek je prakticky zanedbatelný 26 26 Počáteční rychlost vo •rychlost změřená dříve než vznikne produkt •nejvyšší hodnota rychlosti •není ovlivněna úbytkem substrátu •není ovlivněna vratnou přeměnou produktu 27 Faktory ovlivňující rychlost enzymové reakce Teplota S rostoucí teplotou rychlost reakce vzrůstá, optimální je kolem 40 °C, při vyšších teplotách rychlost klesá – denaturace enzymu pH Ovlivňuje stav ionizace skupin v aktivním místě enzymu a jeho okolí konstatní pH v tělesných tekutinách udržují pufrační systémy každý enzym má pH optimum, intracelulární enzymy kolem pH 7 trávicí enzymy mají odlišné: pepsin pH 2 Aktivátory Umožňují nebo urychlují enzymovou reakci Často ionty dvojmocných kovů: Ca2+, Mg2+, Zn2+, Mn2+ Inhibitory Zpomalují nebo zastavují enzymovou reakci Kompetitivní: podobné substrátu, soutěží o aktivní místo Jiné: např. ionty těžkých kovů, pevně se vážou na důležité skupiny Koncentrace substrátu Při vysoké koncentraci substrátu je enzym nasycen, reakce probíhá maximální rychlostí, graficky vyjadřuje saturační křivka 28 Inhibice enzymů •Ireverzibilní •inhibitor pevně vázán na enzym (akt. místo) •organofosfáty •ionty těžkých kovů •kyanidy • • • •Reverzibilní •inhibitor volně vázán •rovnováha E+I Û E-I •inhibitor lze odstranit (dialýza, gel. filtrace) •dva základní typy: kompetitivní, nekompetitivní 29 Přirozený substrát vs. kompetitivní inhibitor malonát je inhibitorem sukcinátdehydrogenasy 30 Otrava methanolem se léčí ethanolem Vznik toxických produktů je inhibován ethanolem, který vytěsní methanol z vazebného místa enzymu – kompetitivní inhibice dehydrogenace methanolu 31 Mnohá léčiva jsou inhibitory enzymů •Acetylsalicylová kyselina (cyklooxygenasa) •Ibuprofen (cyklooxygenasa) •Statiny (HMG-CoA reduktasa) – hypolipidemika, snižují syntézu cholesterolu (lovastatin) •Inhibitory ACE (angiotensin konvertující enzym) – léčba hypertenze (enalapril) •Reverzibilní inhibitory acetylcholinesterasy (neostigmin) – nervosvalové choroby, pooperační atonie střev •Selektivní inhibitory mozkové acetylcholinesterasy (rivastigmin, galantamin) - Alzheimerova choroba • 32 Antibiotika inhibují enzymy nutné pro určitý životní děj bakterií •Peniciliny – inhibují transpeptidasy (výstavba buněčné stěny) •Tetracykliny, makrolidy, chloramfenikol – inhibice proteosyntézy •Fluorované chinolony (ciprofloxacin) – inhibice bakteriální gyrasy (topoisomerasy II) (rozplétání DNA během replikace) 33 Michaelisova konstanta Km •Závislost reakční rychlosti na koncentraci substrátu vyjadřuje rovnice Michaelise a Mentenové •vo je počáteční rychlost (nejvyšší hodnota) • Vmax = maximální rychlost (pro danou koncentraci enzymu) Km = Michaelisova konstanta 34 Grafickým vyjádřením předchozí rovnice je saturační křivka 35 35 Biochemický význam Km •koncentrace substrátu, při níž reakce probíhá polovinou maximální rychlosti •při této koncentraci je enzym z 50 % nasycen •Km má rozměr koncentrace (mol/l) •Km je nepřímo úměrná afinitě enzymu pro daný substrát •existuje-li více strukturně podobných substrátů, ten který má nejmenší Km se považuje za nejpřirozenější pro daný enzym 36 36 Jestliže [S] << Km Při nízkých koncentracích substrátu se reakce řídí kinetikou 1. řádu 37 37 Jestliže [S] >> Km Při vysokých koncentracích substrátu se reakce řídí kinetikou 0. řádu 38 38 Dvě oblasti v saturačním grafu 39 39 Jestliže [S] = Km Jak lze zjistit Km 40 Jak zjistit množství enzymu v biologickém materiálu? 41 Množství enzymu v biologickém materiálu lze stanovit dvojím způsobem •katalytická koncentrace •μkat/l •stanoví se produkt enzymové reakce •většina klinicky významných enzymů •hmotnostní koncentrace •μg/l •stanoví se enzym (jako antigen, imunochemicky) •jen některé, např. tumorové markery 42 Katalytická aktivita enzymu •zavedena jednotka katal, 1 kat = mol/s •jeden katal je katalytická aktivita enzymu, při které se v reakci přemění jeden mol substrátu za sekundu • • mezinárodní jednotka IU (international unit) 1 IU = μmol/min Převodní vztahy: 1 μkat = 60 IU 1 IU = 16,6 nkat 43 Katalytická koncentrace enzymu •aktivita je vztažena na objem biologické tekutiny (krevní sérum) •jednotky mkat/l, mkat/l • 44 Koncentrace substrátu během reakce klesá Þ kinetická křivka z kinetické křivky se zjišťuje rychlost 45 Dvě metody pro zjištění katalytické koncentrace Charakteristika Kinetická metoda Metoda konstantního času Co se měří [S] nebo [P] [P] Jak kontinuálně (např. po 10 s) po urč. čase (např. 10 min) je reakce inhibována Kinetická křivka hodnocena ano ne Co se stanoví počáteční rychlost vo průměrná rychlost Zhodnocení metody přesná méně přesná 46 46 260 Vlnová délka (nm) 340 A Absorpční spektrum oxidované a redukované formy NAD+ - princip „Warburgova optického testu“ Redukovaná forma Oxidovaná forma Oxidovaná forma NAD+ má jediné absorpční maximum při 260 nm, redukovaná forma NADH má absorpční maxima při 260 a 340 nm Měřením změn absorbance při 340 nm lze sledovat přírůstek nebo úbytek NADH Lze též měřit fluorescenci při 450 nm (pouze redukovaná forma). 47 47 optický test LD Laktát + NAD Pyruvát + NADH + H při reakci klesá absorbance D A /D t Princip měření aktivity laktátdehydrogenasy LD 48 Dělení enzymů dle původu a funkce •Enzymy se specifickou funkcí v krvi •syntetizovány v játrech hlavně v játrech •mají svou funkci v krvi – koagulační faktory, cholinestrasa •Buněčné (intracelulární) enzymy •mají svou funkci uvnitř buňky, v místě vzniku •při poškození buňky se uvolní a dostanou se do krve, kde lze zjistit jejich zvýšenou aktivitu •příklady: ALT, AST, CK, GMT, LD ... •Sekreční enzymy •působí jinde, např. v trávícím traktu •enzymy velkých žláz (pankreas) – lipasa, amylasa ... 49 Intracelulární lokalizace enzymů Organela Enzym Cytoplazma Mitochondrie Golgi komplex, ER Lyzosom Membrána LD, ALT, cAST (30 %) mAST (70 %) CHS, AMS ACP GMT, ALP Různé typy poškození buňky vedou k tomu, že se do krve uvolňují jen enzymy z učité subcelulární struktury. lehké poškození jater: AST/ALT < 1 těžší poškození jater: AST/ALT > 1 50 Izoenzymy (izoformy) a makroenzymy •katalyzují stejnou reakci •ale liší se primární strukturou a/nebo posttranslačními úpravami (glykosylace), tedy fyz.-chem. a kinetickými vlastnostmi •mají často různou subcelulární / tkáňovou distribuci •stanovují se elektroforézou, afinitní chromatografií, imunochem. metodami •makroenzymy – komplexy enzymů a imunoglobulinů, mají dlouhý poločas • 51 Kreatinkinasa (CK) je dimer a tvoří tři izoenzymy Izoenzym Výskyt Procento celk. aktivity Zvýšení CK-MM CK-MB CK-BB svaly srdce mozek 94-96 % do 6 % stopy svalové trauma infarkt poranění mozku 52 Trojí využití enzymů v lékařství 1.enzymy jako indikátory patologického stavu 2.enzymy jako analytická činidla v klin. biochemii 3.enzymy jako léčiva 53 Příklady enzymů v klinické diagnostice Enzym Referenční hodnoty Interpretace zvýšení ALT CK PSA do 0,9 mkat/l do 4 mkat/l do 4 μg/l hepatopatie myopatie, infarkt myokardu karcinom prostaty ALT alaninaminotransferasa, CK kreatinkinasa, PSA prostatický specifický antigen Při poškození buněk se zvyšuje aktivita intracelulárních enzymů v extracelulární tekutině 54 Enzymy jako analytická činidla Enzym Původ enzymu Stanovení Glukosaoxidasa Peroxidasa Lipasa Cholesteroloxidasa Urikasa Bilirubinoxidasa Ureasa Laktátdehydrogenasa Taq polymerasa Aspergillus niger křen (Armoracia sp.) Candida sp. Pseudomonas sp. Candida sp. Myrothecium sp. bob (Canavalia sp.) Pediocus sp. Thermus aquaticus glukosa glukosa triacylglyceroly cholesterol kyselina močová bilirubin močovina ALT, AST PCR metoda 55 Enzymové stanovení glukosy glukosa + O2 ¾¾® glukonolakton + H2O2 H2O2 + H2A ¾¾® 2 H2O + A glukosaoxidasa peroxidasa bezbarvý chromogen barevný produkt (měří se absorbance) Princip stanovení glukosy v analyzátorech 56 Pankreatické enzymy v terapii •směs enzymů (lipasy, amylasy, proteinasy) získaná z vepřových pankreatů •indikace: sekreční nedostatečnost pankreatu různé etiologie, cystická fibróza •užívání: 3 × denně při jídle •řada přípravků volně prodejných acidorezistentní tobolky, rozpadají se až v duodenu 57 Asparaginasa v terapii leukémie •Katalyzuje hydrolýzu amidové skupiny asparaginu •Asn + H2O ® Asp + NH3 •L-asparagin je nezbytný pro proteosyntézu některých nádorových buněk, Hydrolýza Asp vede k omezení proliferace •Indikace: akutní lymfoblastické leukemie • Enzymová fibrinolytika •léčiva, která rozpouštějí krevní sraženiny v cévách •urokinasa (lidská) •štěpí plazminogen na plazmin – ten vyvolá degradaci fibrinu a trombolýzu •indikace: žilní trombóza, plicní embolie, akutní IM 58 Proteasy v terapii •Lokální působení: •fibrinolyzin, chymotrypsin, kolagenasa •po lokální aplikaci vedou k lýze nekrotické tkáně, nepoškozují zdravé buňky (obsahují inhibitory proteas) •hnisavé rány, bércové vředy, diabetické gangrény, dekubity apod. •Celkové působení: •trypsin, chymotrypsin, rostlinné proteasy - papain (papaya), bromelain (ananas) •některé studie naznačují protizánětlivý účinek, ovlivnění imunity u autoimunitních onemocnění •indikace: pomocná léčiva při revmatoidní artritidě, traumatické záněty a otoky, lymfedémy, apod., volně prodejné přípravky (Wobenzym, Phlogenzym aj.)