•1 Replikace a transkripce DNA •Ó Biochemický ústav LF MU •2014 (E.T.) •2 •Replikace DNA •Replikace (reduplikace) = zdvojování •Každé ze dvou mateřských vláken DNA slouží jako templát pro syntézu komplementárních vláken •V nových řetězcích se báze řadí na principu komplementarity vůči bazím v templátovém řetězci •Probíhá v jádře •3 •• Iniciace • •• Elongace • •• Spojení a terminace •3 fáze replikace DNA •Obecné rysy replikace u prokaryontů a eukaryontů •4 •Látkové faktory potřebné k syntéze DNA • • dATP, dCTP, dGTP, dTTP • Mg2+ • primer RNA • templát DNA (mateřské vlákno) •5 •Enzymy potřebné potřebné pro syntézu DNA •(různé u prokaryontů a eukaryontů) •Rozplétací enzym (DNA-helikasa) •RNA- polymerasa •DNA-dependentní DNA-polymerasa •DNA-ligasa •ATP-asa •(topoisomerasa) •6 •všechny DNA polymerasy navazují nukleotidy na 3´-konec primeru • (nová DNA vzniká ve směru 5´®3´) •Chemická reakce syntézy DNA •Vlastní syntéza je katalyzována DNA-polymerasami •Do reakcí s již vytvořenou DNA (nebo primerem RNA) vstupuje deoxyribonukleotidtrifosfát (dNTP) •Odštěpuje se difosfát a dNMP se připojí esterovou vazbou • •7 •Připojení deoxynukleotidu při elongaci řetězce DNA •dNTP2 reaguje s 3´koncem primeru • •3´konec stávajícího řetězce •8 •prodlužování řetězce •dNTP3 •+ PPi •Vzniká esterová vazba mezi 3´-OH skupinou stávajícího řetězce a 5´-fosfátem vstupujícího nukleotidu •5´ •3´ •9 •Replikace probíhá na obou vláknech • dvoušroubovice musí být rozvinuta – enzym helikasa • vytváří se replikační vidlice • reasociaci řetězců zabrání ssb-proteiny (single strain binding protein) • podle matrice obou mateřských vláken probíhá syntéza vláken nových • •10 •rozplétací protein (ATP-dependentní) (helikasa) •ATP •ADP • •proteiny stabilizující jednovláknovou strukturu •(ssb-proteiny •single strain binding) •Proteiny podílející se na oddělení řetězců a udržování jednovláknové struktury •3´ •5´ • • • •11 •K syntéze DNA je potřebný RNA primer •DNA polymerasa neumí iniciovat syntézu nových řetězců •Pro svou funkci vyžaduje volnou 3´-OH skupinu •Tuto skupinu zajišťuje RNA primer (10-20 bází) •RNA primer je syntetizován ve směru 5´®3´účinkem RNA polymerasy (primasy) •Primer je kódován podle odpovídající sekvence templátu • •3´ •RNA-DNA hybrid • • •12 •Po vytvoření primeru se na 3´-konci RNA syntetizuje DNA působením DNA polymerasy • • •3´ •5´ •Primer RNA •Nová DNA •13 •Po ukončení syntézy DNA se primer RNA odbourá 5´®3´exonukleasovou aktivitou a vzniklá mezera je nahrazena DNA působením 5´®3´polymerasové aktivity •Odbouraná RNA •Oba úseky DNA se spojí DNA-ligasou • • •3´ •5´ •14 •Syntéza nové DNA probíhá vždy ve směru 5´® 3´ •Bez problému tedy proběhne podél řetězce A •3´ •Mateřský řetězec A •Mateřský řetězec B •Jak bude probíhat podél řetězce B ? •5´ •5´ •15 •Řetězec A – označuje se jako vedoucí vlákno (leading strand) •Řetězec B – opožďující se (otálející) vlákno (lagging strand) •Terminologie •Vedoucí vlákno se syntetizuje kontinuálně •16 • • • •Na otálejícím řetězci vznikají Okazakiho fragmenty • • • •Okazakiho fragmenty •Okazakiho fragmenty se syntetizují ve směru 5´®3´ primasou •3´ •5´ •5´ •3´ • •primer RNA •nová DNA •17 • •Okazakiho fragmenty •3´ •5´ •5´ •3´ •Při pokračující replikaci jsou úseky RNA v Okazakiho fragmentech odstraněny exonukleasou, polymerasa vyplní prázdná místa a ligasa spojí fragmenty DNA •otálející řetězec - replikace probíhá diskontinuálně • •18 • replikace je prekaryontů i eukaryontů vždy zahájena v počátku • počátek je určitá specifická sekvence bází a váží se k němu specifické proteiny (předprimerové proteiny) • replikace probíhá v obou směrech od každého počátku, vznikají dvě replikační vidlice, které se od sebe vzdalují • vznikají replikační bubliny - replikony •5´ •3´ •3´ •5´ •Iniciace replikace •počátek •Rozdíly mezi eukaryonty a prokaryonty •19 •Iniciace replikace u prokaryontů •Ori-vážící proteiny • • • • •Počátek (bohatý na A,T sekvence) •Denaturace v A,T oblasti •Replikace začíná v počátku a pokračuje, dokud se obě vidlice nesetkají •20 • • eukaryotické chromozomy jsou tvořeny dlouhými molekulami DNA, který nemohou být replikovány kontinuálně. Proto replikace těchto velkých molekul vyžaduje zahájení na několika místech současně. •Sekvence počátků u eukaryontů dosud podrobně nepopsány • • počátek replikace - až 30 000 míst současně • zahájení je řízeno prostorově i časově, nemusí být zahájeno na všech počátcích současně • rychlost replikace je menší než u prokaryontů • probíhá v S fázi • •Iniciace replikace u eukaryontů •21 •Iniciace replikace u eukaryontů •3´ •5´ •zahájení replikace •směr replikace •replikační počátek •replikon •spojení replikonů •22 •Enzymy prokaryontní replikace Polymerasa Polymerázová aktivita (u všech 5´ → 3´) Exonukleasová aktivita DNA polymerasa I Vyplnění místa po RNA, opravy DNA, odstranění RNA primerů 5´→3´ i 3´→5´ DNA polymerasa II Opravy DNA 3´→5´ DNA polymerasa III Replikace 3´→5´ DNA polymerasa IV Replikace poškozené DNA DNA polymerasa V Replikace poškozené DNA •23 •Enzymy eukaryontní replikace* Polymerasa Polymerázová aktivita (u všech 5´ → 3´) Exonukleasová aktivita DNA polymerasa a Primasa, opravy DNA žádná DNA polymerasa b opravy DNA žádná DNA polymerasa g replikace v mitochondriích 3´→5´ DNA polymerasa d replikace, opravy DNA 3´→5´ DNA polymerasa e replikace 3´→5´ •* Je známo kolem 13 polymeras •24 •Korekce struktury DNA •Přesnost duplikace struktury ~ 1chyba/109 •Zajištěno korekční aktivitou DNA-polymeráz. •Kontrola konců vznikajících řetězců – srovnání nově zařazené báze na 3´konci s templátem. •Pokud je zařazena chybná báze, nedojde ke vzniku kovalentní vazby (polymerace), ale pomocí 3´®5´ exonukleázové aktivity se chybně spárovaný nukleotid odštěpí • • •25 •Další enzymy podílející se na replikaci Helikasa Oddělují vlákna DNA SSB-proteiny Zabraňují reasociaci vláken DNA topoisomerasy Uvolňují pnutí vyvolané superstáčením Enzymy odstraňující primer (RNA-sy) Hydrolyzují RNA z RNA-DNA hybridů DNA ligasy Telomerasy Sliding clamp (klouzavá svorka) Spojují úseky DNA fosfodiesterovou vazbou úprava 3´konce templátu Udržuje DNA polymerasu ve vazbě na DNA •26 •Okazakiho fragmenty u ekaryontů a prokaryontů •Prokaryonty – 1000-2000 bází • •Eukaryonty - ~ 200 bází • • •27 •Topoisomerasy •(Topologie DNA = trojrozměrná struktura DNA) •U dvojité DNA dochází často k superstáčení •Superstáčení může být pozitivní (ve stejném směru jako stočení helixu, doleva) nebo negativní (v opačném směru jako helix, doprava) •Superstáčení může být odstraněno topoisomerasami •DNA topoisomerasy mají řadu funkcí (při replikaci, transkripci, ukládání DNA do buněk, při opravách) •28 •Superstáčení při rozvíjení dvojitého helixu DNA •29 •Reversibilně přerušuje fosfoesterovou vazbu v jednom řetězci, umožní otáčení kolem jednoho řetězce (uvolnění superstočení) a katalyzuje opětné spojení řetězců •Nevyžaduje energii. •Je u prokaryontů i eukaryontů. • •Topoisomerasa I • •Topoisomerasa II •Může relaxovat superstočenou DNA nebo superstáčení zavádět. •Štěpí oba řetězce. • •Je u prokaryontů (DNA gyrasa) i eukaryontů, má různou specifitu. • •Pro spojení řetězců vyžaduje ATP •. • • • •30 •Účinek topoisomerasy I •Přerušení fosfoesterové vazby následované rotací kolem druhého vlákna a opětným spojením •31 •Inhibitory lidské topoisomerasy- zabraňují replikaci •protinádorové léky •Příklady inhibitorů topoisomerasy •kamptothecin – rostlinný produkt •antracykliny (daunorubicin) -bakteriální produkty •podofyllotoxiny-rostlinné produkty •Antibakteriální léky na bázi chinolonů (norfloxacin) inhibují bakteriální gyrasu – nepůsobí však na humání gyrasu •32 •podofyllotoxin •kamptothecin Camptotheca acuminata Podophyllum peltatum ad. •N •N •O •O •O •H •H •5 •C •2 •O •H •O •O •C •H •3 •O •O •C •H •3 •O •C •H •3 •O •O •33 •Telomery •zvláštní sekvence DNA na koncích chromosomů •tandemy druhově specifických oligonukleotidů, bohatých na G •(u člověka TTAGGG až 1000x) •mají ochrannou funkci (před působením enzymů) •Při syntéze opožďujícího řetězce vyžaduje replikační aparát přítomnost určité délky templátové DNA za sekvencí, která má být kopírována. •Syntéza opožďující se DNA by se zastavila před koncem templátu. •34 •Telomerasa •dokončení syntézy DNA •připojuje preformovaný hexanukleotid na 3´-konec templátového vlákna •je reverzní transkriptasa – ve své struktuře nese RNA templát (CA), ten připojí k 3´konci templátové DNA a podle něj dosyntetizuje příslušnou komplementární sekvenci DNA • • •http://faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/Telomerase.html •35 •Dokončení syntézy DNA na 3´-koncích chromozomů •replikující se vedoucí řetězec není zakreslen • • • • • • •5´- •3´- •pol e •Templátový řetězec •Telomerní DNA •RNA-primer •Účinek telomerasy •DNA-polymerasa dosyntetizuje opožďující se řetězec •opožďující se řetězec •36 •? Délka telomer koreluje se stářím a replikační kapacitou buňky ? • buňky získané od mladších jedinců mají delší telomery a mohou podléhat většímu počtu dělení •většina somatických buněk nemá telomerasu – pokud jsou pěstovány v kulturách, přežijí určitý počet cyklů, pak odumírají • snížená aktivita telomerasy pravděpodobně souvisí se stářím organismu • buňky, které se často dělí (zárodečné, kmenové a nádorové) mají vyšší hladinu telomerasy • inhibitory telomerasy mohou být užitečné v terapii nádorů •37 •Hrubý odhad počtu poškozujících zásahů do DNA v lidské buňce: • cca104-106/den •Þ u dospělého člověka (1012 buněk) se jedná o 1016-1018 opravných kroků za den. •Poškození a opravy DNA. •38 •Poškození a opravy DNA Typ poškození Příčina Chybějící báze Depurinace (104purinů za den) Změněná báze Ionizační záření, alkylační činidla Nepřesná báze Spontánní deaminace Delece-inserce Interkalační činidla (akridiny) Formace dimerů UV záření Zlomy řetězců Ionizační záření, chemikálie (bleomycin) Meziřetězové vazby Chemické látky (deriváty psoralenu, mitomycin c) Tvorba tautomerů Spontánní a dočasná •39 •Poškozená DNA je v buňkách opravována reparačními enzymy •Buňky mají k dispozici opravné systémy : • přímá oprava (zvratem – jen u bakterií) • vystřižení porušené báze („base excision repair“) • vystřižení porušeného nukleotidu („nukleotide excision repair“) • oprava chybného párování („mismatch repair“) • opravy dvojitých zlomů - homologní rekombinace, nehomologní •spájení konců •prevence inkorporace porušeného nukleotidu do DNA • •Mutace, které vzniknou během DNA replikace jsou opravovány zpětnou kontrolu správného zařazení posledního nukleotidu (3´®5´proofreading) •40 •Příklady oprav vystřižením báze •5´-ATGCUGCATTGA •3´-TACGGCGTAACT • •5´-ATGC GCATTGA •3´-TACGGCGTAACT •5´-ATGC GCATTGA •3´-TACGGCGTAACT •5´-ATGCCGCATTGA •3´-TACGGCGTAACT •5´-ATGCCGCATTGA •3´-TACGGCGTAACT •Deaminace cytosinu na uracil •Uracil-N-glykosylasa odstraní bázi, vznik AP míst (apyrimidinové místo) •AP endonukleasa štěpí fosfodiesterovou vazbu v místě chybějící báze, zbylá ribosa je vyštěpena exonukleasou •Mezera je vyplněna inzercí cytidin fosfátu účinkem DNA polymerasy b •Spojení ligasou •41 •Příklady oprav vystřižením nukleotidu •5´-ATGCCGCATTGATAG •3´-TACGGCGTAACTATC • •5´-ATGCCGCATTGATAG •3´-TACGGCGTAACTATC • •5´-AT AG •3´-TACGGCGTAACTATC •5´-ATGCCGCATTGATAG •3´-TACGGCGTAACTATC •5´-ATGCCGCATTGATAG •3´-TACGGCGTAACTATC •Vznik thyminového dimeru radiací •Zlom vyvolaný dimerem je rozpoznán komplexem endonukleasy nazývané excinukleasa. Ta vystřihne defektní oblast zahrnující kolem 30 nukleotidů (endonukleasový a exonukleasový účinek • •Nahrazení vystřižených bází působením DNA polymerázy a. •Opětné spojení řetězce ligázou