•1 •Syntéza a postranskripční úpravy RNA • •2016 •2 •Proces tvorby RNA na podkladu struktury DNA •Je přepisován pouze jeden řetězec dvoušroubovice DNA – templátový řetězec •Druhý řetězec se nazývá kódující (jeho sekvence bází odpovídá transkriptu, pouze místo U je T) •Transkripce •3 •5´ •3´ •G G A T C •3´ •5´ •C C T A G •5´ •3´ •G G A U C •Kódující řetězec •Templátový řetězec •DNA •RNA •Syntéza RNA probíhá opět ve směru 5´® 3´ •4 •Replikace x transkripce Replikace Transkripce Enzymy: Kde probíhá: Zahájení: Průběh: Kontrola: Nukleotidy: DNA-polymerasy na chromosomu v S fázi vyžaduje RNA primer kopírována obě vlákna polymerasa má zpětnou kontrolu správného zařazení posledního nukleotidu dATP, dGTP, dCTP, dTTP RNA-polymerasy vybraný segment DNA nevyžaduje primer kopírováno pouze jedno vlákno polymerasa nemá zpětnou kontrolu správného zařazení posledního nukleotidu ATP, GTP, UTP, CTP •5 •Transkripce u prokaryontů a eukaryontů •Prokaryonty •Eukaryonty •6 •Enzym zopovědný za transkripci je DNA-dependentní RNA polymerasa (transkriptasa) •Prokaryonty: • 5 podjednotek plus sigma faktor. • Přepisuje všechny formy RNA •Eukaryonty •4 různé RNA polymerasy •7 •RNA polymerasy u eukaryontů •RNA pol I – syntéza r RNA (v jadérku) •RNA pol II – syntéza mRNA (jádro) •RNA pol III – syntéza tRNA, 5S RNA (jádro) •RNA pol IV - syntéza mitochondriální RNA •Mají stejný mechanismus účinku, rozlišují různé promotory •8 •Amanitin •Inhibitor eukaryontních RNA polymeras (hlavně typu II) Strukt_vzorec_a-amanitin •9 •3 fáze transkripce • • iniciace • elongace • terminace • •10 •Účinek RNA polymeras •Syntéza nové RNA probíhá ve směru 5´→3´ •K syntéze jsou potřebné ATP,GTP,CTP,UTP •Každý nukleotid se páruje s komplementární bází na templátovém vlákně •Polymerasa tvoří fosfoesterovou vazbu mezi 3´-OH ribosy na rostoucím RNA vláknu a a-fosfátem navázaným na 5´OH ribosy vstupujícího nukleotidu • energie polymerace je kryta štěpením NTP • neexistuje zpětná kontrola řazení bází •+ PPi •OH •OH •11 •Rozpoznání templátu • •– RNA polymerasa (RNAP) vytvoří stabilní komplex s templátovou DNA v místě promotoru •V místě promotoru se nachází konvenční sekvence •(sekvence, které se obecně najdou v určité oblasti mnoha zkoumaných genů) •12 •Promotor u prokaryontů •V pozici ~ -10 obsahuje Pribnowův box TATAAT •V pozici ~ -35 další sekvence TTGACA •Tyto sekvence jsou rozeznány s -faktorem prokaryotické RNA polymerasy • •Sekvence v promotoru prokaryontů •-35 •Pribn.box •~ 15 b •Start transkripce •~ 10b •13 •Transkripce u prokaryontů •Iniciace: •Vazba RNA-polymerasy do promotorové oblasti DNA prostřednictví sigma podjednotky •Lokální rozvinutí vláken DNA RNA polymerasou •Párování bází z ribonukleotidů s templátovým vláknem a tvorba fosfodiesterových vazeb mezi prvními ribonukleotidy • • •promotor •Počátek syntetizované RNA •Směr pohybu RNA polymerasy • •s •14 •Transkripce u prokaryontů •Elongace: •Uvolnění podjednotky sigma z RNA polymerasy •pohyb RNA polymerasy podél DNA ve směru transkripce, rozvíjení dvoušroubovice i opětné svinování (vytváření transkripční bubliny) •Tvorba kovalentních vazeb mezi nukleotidy •Vznikající RNA je vytěsňována z templátového vlákna • •Terminační signál – ukončení elongace •15 •Promotor u eukaryontů (RNA polymerasa II) • •Transkripce eukaryontních genů je mnohem komplikovanější •Je zapojena řada transkripčních faktorů, které se váží k různým úsekům DNA • •Promotor obsahuje TATA box analogický Pribnowově sekvenci (ATATAA) – určuje pravděpodobně místo startu – vazba bazálních transkripčních faktorů •V pozici ~ -100-200 jsou 1-2 další regulační sekvence (CAAT box, GC box) – určuje pravděpodobně frekvenci startu (promotorové proximální sekvence) •Vzdálené regulační sekvence (mimo promotor) – vážou specifické transkripční faktory • •16 •Start transkripce •~ -25 b •~ -40 b •Některé sekvence v promotoru eukaryontů • •TATA • •CAAT •Promotor u eukaryontů •17 •Bazální transkripční faktory u eukaryontů •Musí být navázány na RNA polymerasu před startem transkripce a jsou současně asociovány s promotorovými sekvencemi •Samotná RNA-polymerasa nemůže zahájit transkripci •Jsou nezbytné pro rozpoznání promotoru a místa startu • •Bazální = jsou potřebné pro transkripci všech genů •18 •Bazální transkripční faktory •TFIID – největší z bazálních faktorů transkripce •Má celkem 11 podjednotek •Jednou podjednotkou je TBP (TATA box binding protein). •TBP se váže k TATA boxu, na ni nasedají další podjednotky TXIID. •Po té se navazují další TF (TFIIA,B,F,E,H) a RNA polymerasa •19 • • • • • • •TFIIB •TFIIF •TFIIE •TFIIA •TFIIH •RNA polymerasa • •TBP • • • • • • •TFIID •Bazální transkripční faktory • •transkripce •TBP •20 •Genově specifické regulační proteiny •Specifické transkripční faktory - proteiny, které se vážou v regulačních sekvencích mimo promotor, často velmi vzdálených. •Působí jako aktivátory nebo represory transkripce příslušného genu. •Specifické transkripční faktory interagují s mediátorovými proteiny (koaktivátory, korepresory), které jsou v kontaktu s bazálními transkripčními faktory. •Typický gen kódující syntézu proteinu u eukaryontů má na DNA vazebná místa pro řadu specifických transkripčních faktorů •21 •Specifické regulační sekvence (enhancery, silencery, HRE, HSRE) • jsou na stejném chromosomu jako daný gen • ale mohou být vzdáleny „upstream“ nebo „downstream“ od místa transkripce • mohou blízko promotoru, ale také několik tisíc bází vzdáleny •22 • •TF IID • •Pol II • •CTD •~ 2 000 bp • • • • • •Mediatorové proteiny • •TF IID • •Pol II • •CTD •Regulační sekvence •~ 2 000 bp • •promotor •Specifický transkripční faktor •Bazální transkripční komplex •(Pol II a bazální faktory) • •upstream •Specifické transkripční faktory •23 •Jaderné receptory hormonů jsou specifické transkripční faktory • receptory hormonů se nachází v neaktivní formě v jádře nebo v cytoplazmě. V neaktivní formě vážou inhibiční protein (např. heat shock protein). • hormon pronikne cytoplazmatickou membánou do buňky a specificky se váže k receptoru v cytoplazmě nebo jádře • inhibiční protein se oddělí, vzniká komplex hormon-receptor, konformace receptorové bálkoviny se mění • cytoplazmatický komplex hormon receptor je translokován do jádra • v jádře působí komplex hormon-receptor jako specifický transkripční faktor a váže se na DNA v místě specifické regulační sekvence ( = hormon response element HRE) •receptor s hormonem navázaný na DNA reaguje rovněž s koaktivátorem (mediátorový protein), který je v kontaktu s bazálním transkripčním komplexem. Tím se vypíná nebo zapíná proces transkripce • •24 • •TF IID • •Pol II • •CTD •> 1 000 bp • • • •mediatorové proteiny • • •GRE • • • •kortisol-GR •promotor • •basalní •transkripční •komplex •Účinek kortizolu •GRE – glukokortikoid response elememnt •25 •Transkripční faktory a zahájení transkripce u eukaryontů •Transkripce je zahájena teprve po navázání všech transkripčních faktorů •RNA polymerasa se váže k transkripčním faktorům a DNA •Dvojitý helix DNA se rozvíjí a polymerasa je „sunuta“ k místu startu •Je zahájena transkripce •Po zahájení transkripce se většina transkripčních faktorů oddělí •26 •Tvorba čepičky - capping •Probíhá na počátku elongace pomocí specifických enzymů •27 • • • • • •5´ •5´ • •H •N •N •O •N •H •2 •N •N •O •O •H •O •H •C •H •2 •C •H •3 •+ •O •P •P •P •C •H •2 •O •P •O •C •H •2 •O •O •C •H •3 •base •base • •5´-5´ phosphate linkage •Čepička na 5´-konci •28 •Terminace •Proces elongace je ukončen při dosažení terminačního signálu.Transkripčnéí komplex se rozpadá a uvolňuje vzniklou molekulu BNA •U prokaryontů je terminace • závislá na r faktoru • nezávislá na r faktoru •U eukaryontů je o terminaci málo známo • •29 •RNA polymerázy dělají jednu chybu na 104 nukleotidů, •protože nevlastní nukleolytickou korigující (proofreading) aktivitu • (začínají řetězec RNA bez potřeby primeru) • •Toto chybění korekce (proofreading) odráží skutečnost, že •transkripce nemusí být tak přesná jako DNA replikace, protože • RNA není používána jako trvalá zásobní forma genetické informace. •30 •Úprava primárních transkriptů •Primární transkript je přesnou kopií transkripční jednotky •Primární transkripty tRNA a rRNA u prokaryontů i eukaryontů jsou posttranskripčně modifikovány ribonukleasami •Prokaryontní mRNA je prakticky identická s primárním transkriptem (k translaci slouží ještě před ukončením syntézy) •Eukaryontní RNA podléhá rozsáhlým následným modifikacím – probíhají kotranskripčně •31 •Úprava eukaryontní mRNA •Primární transkript je hnRNA •Je přepisem strukturního genu, v němž jsou kódující sekvence (exony) střídány sekvencemi nekódujícími (introny nebo intervenujícími sekvencemi) • • • • •Exon •1 • • •Exon •2 •Exon •3 •Exon •4 •Intron •1 •Intron •2 •Intron •3 •nekódující sekvence musí být odstraněny z primární RNA během úprav (processingu) • •32 •• Chemická modifikace (navázání 7-methylquanosinu 5´-5´fosfátovou vazbou) – na ni se váže komplex proteinů, které chrání před působením 5´exonukleas a pomáhají při zavádění RNA přes nukleární póry do cytoplasmy • •• Sestřih (odstranění sekvencí odpovídajích intronům) • •• Polyadenylace (adice 3´ polyA ) – brání účinku 3´exonukleas •Úprava hnRNA v jádře •33 •Sestřih hnRNA - splicing •Probíhá působením jaderných enzymových komplexů – splicesomů •Splicesomy obsahují pět malých RNA (U1, U2,U4,U5 a U6) •Jsou asociovány s proteiny a tvoří snRNPs (small nuclear ribonucleoprotein particles). •Sekvence AGGU určují hranice mezi intronem a exonem.Tyto sekvence jsou rozpoznány snRNPs. •5´-----AGGU-------AGGU------3´ • • •exon •exon •intron •34 •Alternativní sestřih •Při typickém sestřihu jsou všechny exony primárního RNA transkriptu spojeny dohromady za vzniku mRNA pro syntézu specifického proteinu •Alternativní sestřih – různé skupiny exonů z jednoho genu tvoří různé mRNA vedoucí k syntéze různých proteinů • • • • • • • •Exon 1 •Exon 4 •Exon 3 •Exon 2 • • • • • • • •Primární transkript •Alternativní sestřih • •Exon 1 Exon 2 Exon 3 • •Exon 1 Exon 2 Exon 4 •Protein A •Protein B •35 •Gen pro a-tropomyosin •Alternativní sestřih m RNA •Transkripce, sestřih •exony •introny •mRNA - kosterní sval •mRNA - hladký sval •mRNA - fibroblast •36 •Poruchy sestřihu •Vedou ke genetickým chorobám •Př. b - thalasemie: b-podjednotka hemoglobinu se netvoří v normálním množství •G na 5´sekvenci sestřihu je mutován na A a proto je primární transkript sestřižen nesprávně