Optické metody Mgr. Jana Gottwaldová Optické analytické metody •Fyzikální metody, které získávají potřebné informace z měření optických vlastností a spekter zkoumaných látek. •využívá interakce analytu se světlem - optických vlastností molekul a atomů měřené soustavy •může jít o změnu barvy či její intenzity, luminiscenci, fluorescenci, změnu optické otáčivosti nebo o změnu rozptylu světla při průchodu vzorkem Spektrofotometrie x fotometrie lPatří mezi nejpoužívanější optické metody v biochemii lStanovení vlastností vzorku, např. koncentrace určité látky, na základě pohlcování světla určité vlnové délky se označuje jako fotometrie. l l l l l Spektrofotometrie-rozdělení lPodle frekvence elektromagnetického záření: lUV spektr. – zahrnuje oblast záření λ=190-400 nm lVIS spektr. – oblast viditelného záření λ=400-800 nm lIČ spektr. – oblast IČ spekter se dělí na blízkou IČ λ=800-2000 nm, dalekou IČ λ=105 nm l l l l l Spektrofotometrie-rozdělení lPodle typu interakce lelektromagnetického záření: lAtomovou absorpční spektrofotometrii lAtomovou emisní spektrofotometrii lTurbidimetrii, nefelometrii lLuminiscenční metody: fluorimetrie,fosforescence, chemiluminiscence l l Optické metody l l ljsou založeny na výměně energie mezi látkou a zářením lSvětlo je druhem elektromagnetického záření lVlastnosti elektromagnetického záření - má duální charakter l l l lSložku magnetickou a elektrickou lVzdálenost mezi dvěma vrcholy vln se nazývá vlnová délka- λ, udává se v nm Export1 Elektromagnetické záření Popisující veličiny elektromagnetického záření Ø •rychlost – c (m/s), ve vakuu 3x108 m/s • •vlnová délka - l (nm) l l •Frekvence světelných vln (=počet vln za sekundu) - n(Hz,s-1) • Ø Export1 Popisující veličiny elektromagnetického záření •energie fotonu světelného záření ε •Energie fotonu je přímo úměrná jeho kmitočtu, h je Planckova konstanta (6,625x10-34 J/s) l •Energie fotonu je nepřímo úměrná vlnové délce tzn. že světelné záření o kratší vlnové délce má vyšší energii, než světlo s delší vlnovou délkou l • Elektromagnetické záření lSvětlo v UV a VIS oblasti má kmitočet (počet vln za s) 1014 -1015 Hz l lMonochromatické - světlo, které se skládá pouze z jedné vlnové délky lPolychromatické – skládá se z mnoha vlnových délek (sluneční světlo, světlo wolframové žárovky) Barevnost látek lPokud absorbované záření má λ ležící v oblasti viditelné části spektra, látka se jeví lidskému oku jako barevná lMá vždy barvu doplňkovou k barvě absorbovaného světla l Barevnost látek Barevnost látek Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii l l l lPropustnost (transmitance): lMnožství světla určité vlnové délky, které prošlo lvzorkem lKde I0 je intenzita světla vstupujícího do vzorku a I lje intenzita světla ze vzorku vystupujícího l Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii lAbsorbance: l l lBezrozměrná veličina, definovaná na základě lTransmitance, udává jaké množství světla bylo lpohlceno vzorkem. l Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii lZákon Lambertův-Beerův: l lI = I0 . 10-ε l c l lIntenzita světelného záření procházející labsorbujícím prostředím klesá exponenciálně v lzávislosti na délce absorbující vrstvy a lkoncentraci absorbující látky l l(Johan Heinrich Lambert, 1728-1777) Zákon Lambertův-Beerův Ø Ø Øabsorbance při dané vlnové délce přímo úměrná tloušťce absorbující vrstvy l Økoncentraci absorbujících částic ve vrstvě c ØKonstanta úměrnosti pro danou látku a danou vlnovou délku absorbovaného záření je molární absorpční koeficient ελ l Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii lmolární absorpční koeficient ελ: fyzikální konstanta, která udává jak daná látka při určité koncentraci absorbuje monochromatické záření určité vlnové délky lTakto lze zjistit koncentraci látek barevných, nebo látek absorbujících světlo v UV oblasti lPokud látka v těchto oblastech neabsorbuje, je třeba ji převést na látku, která absorbuje více lVztah mezi signálem ( absorbancí) a koncentrací se určuje kalibrace Kalibrační závislost lPraktické využití Lambertova-Beerova zákona lProvedení: lzměříme obvykle 5 standardních roztoků o známé vrůstající koncentraci při určité vlnové délce lvšechny roztoky se měří za stejných experimentálních podmínek (spektrometr,kyveta,pipety,doba inkubace..) lblank = slepý pokus, obsahuje vše kromě stanovované látky l l l Kalibrační závislost lSestrojení kalibrační křivky lnaměřené hodnoty absorbance standardů na ose y lhodnoty koncentrace na ose x l lPokud je závislost lineární, je lmožné změřit absorbanci a lvypočítat koncentraci lneznámého vzorku Kalibrační závislost lVzhledem k tomu, že poměr lcst/Ast je pro měřenou sérii lkonstantní používáme ho pro lzměřenou sérii jako kalibrační lfaktor, kterým vynásobíme lnaměřené hodnoty absorbance lvzorků o neznáme koncentraci l lLOD-dolní mez detekce lLOL- horní mez detekce lLOQ-mez stanovitelnosti Limitace Lambertova-Beerova zákona lOdchylka ελpři vysokých koncentracích (>0,01 mol/l) vlivem elektrostatických interakcí lČástečný rozptyl světla na částicích přítomných ve vzorku lFluorescence nebo fosforescence vzorku lNedokonale monochromatické záření lNekoherentní světelné záření l Nejpřesnější výsledky jsou získávány v rozsahu l absorbancí 0,2-0,7 . Od hodnot absorbance > l výrazně narůstá chyba měření Spektrofotometry l lPřístroje, které se používají k měření intenzity l záření v ultrafialové (UV) nebo viditelné (VIS) l oblasti spektra l lSlouží pro měření absorpce světla vzorkem l lAbsorbance je měřena při různých vlnových délkách l Uspořádání spektrofotometru •Zdroj světla •Optický systém: štěrbiny, zrcadla, čočky •Monochromátor nebo filtr: k výběru určité vlnové délky •Absorpční prostředí: kyveta s měřeným vzorkem •Detekční systém: zařízení k měření světelného záření, které prošlo vzorkem • Zdroje záření a jejich použití l lWolframová žárovka – měření absorpce ve viditelném spektru lDeuteriová (vodíková) výbojka - měření absorpce v UV spektru lXenononová výbojka- měření absorpce v oblasti VIS UV spektru lRtuťová výbojka – měření v oblasti spektra 200-400 nm l l l Wolframová žárovka – VIS oblast spektra lSkleněná baňka naplněná inertním plynem obsahující páry jódu lUvnitř je wolframové vlákno, které je zahříváno stejnosměrným proudem Deuteriová výbojka – UV oblast spektra lNízkotlaké, produkují světlo o vlnové délce 160-360 nm Xenonová výbojka – blízká UV oblast nebo IČ oblast spektra lVysokotlaká (pevnější plášť), výboj vzniká mezi dvěma wolframovými vlákny, potřebuje intenzivní chlazení l Rtuťová výbojka – blízká UV a VIS oblast lNízkotlaká, poskytuje přesně definované čárové spektrum (200-400 nm) lPro klinickou biochemii je významná spektrální čára o vlnové 334 nm – pro měření redukované formy NADP (absorpční maximum 340 nm) Spektrofotometr - fotometrické filtry lSlouží k vymezení určitého ( co nejužšího) pásu monochromatického světla ze spojitého záření. l lCharakteristikou filtru je tzv. spektrální pološířka lfiltru (h, nm) - odpovídá intervalu vlnových délek záření v lpolovině maximální propustnosti filtru (je odvozena z křivky lpropustnosti). Čím je rozsah pološířky filtru užší, tím je filtr llepší. lFotometrické filtry dělíme na dvě základní skupiny: lbarevné absorpční a interferenční l Spektrofotometr - fotometrické filtry lSpektrální pološířka lfiltru (h, nm) - odpovídá lintervalu vlnových délek záření lv polovině maximální lpropustnosti filtru – ltransmitance,je odvozena z lkřivky propustnosti). lČím je rozsah pološířky filtru lužší, tím je filtr lepší. l Křivka propustnosti Fotometrické filtry l lBarevné absorpční filtry - mají nižší spektrální lčistotu filtrovaného záření, jejich pološířka je 30-80 lnm l lPevné - skla vyrobená z oxidy kovů, nebo pokrytá vrstvou želatiny s organickým barvivem l lKapalné – obvykle kyvety s roztoky anorganických solí l Fotometrické filtry-interferenční filtry interferfiltr lInterferenční filtry využívají mnohonásobnou linterferenci záření mezi hraničními plochami ls výbornými odrazovými vlastnostmi, mají užší šířku lpásma a vyšší pík transmitance (lepší propustnost) lnež barevné absorpční filtry. Nejvíce rozšířený je lkovový Fabry-Perotův filtr. a, c – polopropustné vrstvičky b – vrstva dielektrika o tloušťce l/2 d, e – krycí vrstvy Spektrofotometr - monochromátory lOptická zařízení pomocí kterých se ze spektra lpolychromatického světla mechanicky vymezí lpouze jeho určitá část. lSlouží pro kontinuální výběr různých vlnových ldélek l l l spec_fig1%20scanning Monochromátor l l lMonochromátor se skládá: lvstupní štěrbiny lpomocné optiky (zrcadla, čočky) ldisperzního prvku - mřížka,hranol lvýstupní štěrbiny l spec_fig1%20scanning Monochromátor- vstupní a výstupní štěrbina lVstupní – vymezuje malou část světelného toku lze zdroje záření lVýstupní štěrbina – slouží k výběru záření určité lvlnové délky, čím je užší tím užší je šířka pásma l(bandpass) a větší monochromatičnost záření. l lPoloha štěrbin je neměnitelná, požadovaná vlnová ldélka se nastavuje přímým otáčením disperzního lprvku. l Monochromátor - pomocná optika lZrcadla - jsou to plochy odrážející záření, jsou lpotažena obvykle vrstvou hliníku •Rovinná – nejvíce používaná •Dutá, kulová , parabolická • l Čočky – optický zaostřovací systém l l Optická vlákna – skleněná, křemenná lusměrňují transport světla ve stísněných prostorách l(vertikální fotometry k měření mikrotitračních ldestiček), mají větší světelné ztráty než zrcadla l lClony – používají se k omezení průřezu svazku paprsků, k odstínění okrajové oblasti čoček a zrcadel l Disperzní prvek - optický hranol lrozkládá polychromatické světlo na principu lomu světla lsvětelné paprsky o kratší vlnové délce (modré světlo) se lámou více než paprsky s delší vlnovou délkou lSkleněný hranol - pro rozklad světla ve VIS oblasti spektra (400-800 nm) lKřemenný hranol – pro UV oblast (do 200 nm) l Disperzní prvek – difrakční reflexní mřížka lpracuje na principu odrazu světla lJe tvořena soustavou jemných rovnoběžných l vrypů na skleněné destičce (nejkvalitnější až 1700 /1 mm) lNa vybroušených ploškách mřížky dochází k složitým optickým procesům-odraz, interference světla, které vedou k tomu, že z mřížky vychází jednotlivé vlnové délky pod rozdílným úhlem, který závisí na vlnové délce záření lRozklad záření je lineární u všech vlnových délek lMá lepší rozlišovací schopnost než hranol Výběr požadované vlnové délky lPřesným pohybem ldisperzního prvku lmonochromátoru je vzniklé lsvětelné spektrum lnasměrováno na výstupní lštěrbinu tak, aby jím lprošlo záření požadované lvlnové délky ☼ optické zrcadlo zdroj světla difrakční reflexní mřížka mikrometrický šroub kyveta detektor Spektrofotometr - Absorpční prostředí lKyveta s měřeným vzorkem lRozdělení: ldle velikosti: Makro- (1-2 ml), semimikro- l(<0,5 ml), mikro-(<100 μl) ldle typu: nalévací, průtokové ldle materiálu: skleněné, plastové (akrylátové, polystyrenové), křemenné (UV oblast) l automatických bioch. analyzátorech: •kyvety na jedno použití •trvalé – po změření se promyjí mycí stanicí Absorpční prostředí spektrofotometru l Instr_tech_spektrofotom 008a Instr_tech_spektrofotom 006 zatavené kyvety z plastické fólie postup miniaturizace kyvet 400 µl 150 µl 80 µl Spektrofotometr - detekční systém lJe složen z detektoru záření a elektronického lzařízení pro zpracování jeho odezvy l lDetektory lZařízení, které zprostředkovávají přeměnu energie záření lna jinou formu – obvykle fotochemickou, elektrickou l lHradlový selenový fotočlánek lFotodioda lFotonásobič lDetektor diodového pole Detektor – hradlový selenový fotočlánek lSkládá se z polopropustné vrstvy stříbra nanesené na vrstvě selenu (polovodič) na kovovém podkladě lSvětelné záření o vlnové délce λ dopadající na polovodič působí uvolnění elektronů, které přecházejí do vrstvičky stříbra lTím vzniká elektrický proud, který je proporcionální intenzitě světelného záření Detektor – fotodioda (fotonka) lPracuje na principu fotoelektrického efektu l lSkládá se z fotosenzitivní katody (obsahuje Ag a lrůzné alkalické kovy a jejich oxidy) a anody umístěné lve vakuu l lFotokatoda uvolňuje při ozáření světlem lelektrony, které jsou přitahovány anodou čímž lvzniká el. proud, který je proporcionální intenzitě lsvětelného záření l Detektor - fotonásobič •Elektrony z fotokatody jsou postupně přitahovány k sérii dynod, na které je vloženo postupně se zvyšující napětí •Když elektron narazí na dynodu uvolní z ní mnohem více elektronů, které jsou přitahovány k další dynodě •Obsahuje až 10 dynod, z nichž každá následující má až o 50 V vyšší napětí •Toto vnitřní zesílení signálu umožňuje převést i velmi slabé světelné záření na měřitelné hodnoty elektrického proudu • • • Detektor - fotonásobič l Detektor s diodovým polem lJe tvořen velkých množstvím miniaturních lfotodiod na malé ploše destičky, na kterou dopadá lsvětelné záření po průchodu absorpčním lprostředím a následně je rozložené lmonochromátorem na jednotlivé vlnové délky Detektor s diodovým polem spec_fig2%20diode%20array spec_fig1%20scanning • Rozdíl oproti klasickému spektrofotometru – monochromátor je umístěn až za kyvetou se vzorkem • Použití : v HPLC (UV/VIS detektor), automatické biochemické analyzátory • Usnadňuje tzv. bichromatické měření absorbance Konstrukce spektrofotomeru lJednopaprskové lUmožňují měřit absorbanci pouze v jednom labsorpčním prostředí (tj. v kyvetě s měřeným vzorkem lnebo v kyvetě s blankem) lZdroj světla lVstupní štěrbina lMonochromátor lVýstupní štěrbina lKyveta ldetektor Spektrofotometr Konstrukce spektrofotomeru lDvoupaprskový lDvě základní konstrukční řešení: lPaprsek určité vlnové délky z monochromátoru lje rozdělen na dvě části, jedna polovina prochází lkyvetou se vzorkem, druhá s kyvetou s blankem – lvyžaduje 2 detektory lPaprsek vycházející z monochromátoru je lrotujícím zrcadlem střídavě usměrňován na kyvetu lse vzorkem a směrován na jeden společný lfotonásobič l < ☼ M Vzorek Blank ☼ M Blank Vzorek Kontrola kvality spektrofotometru lPřesnost nastavené vlnové délky lOvěřuje, že vlnová délka nastavená na přístroji lodpovídá skutečné vlnové délce procházejí lměřeným vzorkem. lPoužití rtuťové výbojky (ostré čárové spektrum) lPoužití absorpčních filtrů (z kysličníku holmia) s lpřesně definovaným absorpčním pruhem – filtr je lpřístrojem naskenován a zjištěný absorpční pík je lsrovnán se známým píkem. Povolená tolerance je l± 1-2 nm. Kontrola kvality spektrofotometru lRozptýlené světlo lSvětlo, které může dopadnout na detektor aniž lby prošlo měřeným vzorkem (př. nedokonalé lodstínění optického systému spektrofotometru) lOvěřuje se vložením neprůsvitného bloku do nosiče kyvety a sledováním odezvy detektoru l lDrift signálu lSchopnost detektoru udržovat konstantní hodnotu lSledování nulové linie l Vertikální fotometrie Vertikální fotometrie lSpektrofotometrická metoda,s uspořádáním kdy světelný paprsek prochází optickým prostředím ve vertikálním směru l Využití : proměření absorbance v jamkách mikrotitračních destiček, které se používají hlavně pro imunochemická stanovení na principu ELISA (analýzy s navázaným enzymem za využití imunosorbce) ELISA - Technická instrumentace lProvádí se ve speciálních nádobkách uspořádaných do tzv. mikrotitračních destiček. l l l lKaždá destička obsahuje 96 jamek uspořádaných ve 12 řadách po 8 jamkách. l ELISA - Technická instrumentace l lPro měření výsledného produktu detekční reakce se používají speciální vertikální spektrofotometry - ELISA readry mikrotitračních destiček: je uspořádán tak, že světelný paprsek prochází optickým prostředím ve vertikálním směru. ELISA reader (vertikální spektrofotometr) lPrincip: světelný paprsek ze zdroje prochází přes zvolený interferenční filtr (podle požadované vlnové délky) do optických kabelů, lkteré zabezpečují distribuci do 9 oddělených kanálů: 8 z nich vedou přes jamky mikrotitrační destičky a dopadají na pole fotodiod, které detekují intenzitu světla. lDevátý optický kabel je použit na kontrolu intenzity záření vycházejícího ze zdroje (obrázek č.8). l Ve zlomku vteřiny se změří celá řada jamek (8), mikrotitrační destička se posune a může se měřit řada následující. ELISA reader (vertikální spektrofotometr) l Instr_tech_ELFO_Reader_mřížka 017 ELISA reader (vertikální spektrofotometr) lSoučásti vertikálního fotometru: lzdroj záření: nejčastěji používá halogenová žárovka nebo xenonová výbojka. lInterferenční filtry: jsou umístěny v posuvném držáku filtrů,obvykle se používá 6 filtrů (pro λ 400-800 nm). lOptický systém: se skládá 9 optických kabelů (světlovodiče), štěrbin a zrcadel pro vedení světelného paprsku ze zdroje do optického prostředí (jamka mikrotitrační destičky). lDetektor: používají se fotodiody. lRychlost měření je 5s (celá mikrotitrační destička - 96 ljamek). Vertikální fotometrie lVztah mezi změřeným signálem (absorpcí) a koncentrací se určuje kalibrací. Obvykle se změří absorbance 6-ti standardních roztoků o známé vzrůstající koncentraci a blank ( slepý pokus, obsahuje vše kromě stanovované látky) při určité vlnové délce. Vertikální fotometrie lPři ELISA metodě se vyžaduje měření všech vzorků v duplikátech. lPoté software přístroje sestrojí kalibrační křivku (naměřené hodnoty absorbance standardů na ose y,hodnoty koncentrace na ose x), ze které odečte hodnoty koncentrací neznámých vzorků l Při vertikální fotometrii závisí dosažené výsledky měření pouze na přesnosti pipetování kalibrátorů, kontrolních materiálů a vzorků. ELISA automatická linka lAutomatická linka provádí: l automatické pipetování vzorků, reagencií, kalibrátorů a kontrol pomocí pipetovacího systému (2, 4, 8 jehel). lMá zabudovanou čtečku čárového kódu, což umožňuje pozitivní identifikaci pacientských vzorků. lLinka má obvykle 3-4 místa pro umístění mikrotitračních destiček. lDále sestává z inkubátoru (místo pro inkubaci vzorků), l promývačky a readeru mikrotitračních destiček. lTransport destiček mezi jednotlivými částmi provádí pomocí robotického ramene. S lsystém provádí automatické ředění vzorků a je opatřen softwarem pro automatické vyhodnocení měření. ELISA automatická linka lVelkou výhodou automatické linky je použití čárových kódů, a tím zabránění záměny mezi vzorky. Dále je to přesnost pipetování vzorků a reagencií, vysoká kapacita přístroje. lNevýhodou je vyšší spotřeba používaných reagencií. l Reflexní fotometrie Reflexní fotometrie lPrincip lměření intenzity záření odraženého od neprůhledné (homogenně zbarvené) podložky. Hodnotí se poměr intenzity dopadajícího světla a světla odraženého od barevné plochy lPoužití: suchá chemie, močová analýza, denzitometrické hodnocení tenkovrstevných chromatografů Reflexní fotometr l Přístroj slouží ke kvantitativnímu vyhodnocení reakcí probíhajících na pevné fázi. Pevná fáze slouží jako nosič obsahující činidla aktivovaná vodou obsaženou v naneseném vyšetřovaném biologické materiálu (krev, moč). lMěří se intenzita záření odraženého od homogenně zbarvené podložky.(matrice) Reflexní fotometr - pevná fáze (matrice) lČinidla jsou v reagenční zóně proužku impregnována vlákna proužku (fy Roche, Reflekton) l lČinidla jsou nanesena v reagenční zóně proužku jako vícevrstevný film (fy Kodak) l Reflexní fotometr lOdraz světla od reagenční zóny: lzrcadlový – na reflexní ploše zrcadla ldifuzní - je výsledkem interakce dopadajícího světla s molekulami reakční zóny (zahrnuje i absorpci a rozptyl) l l Hlavní komponenty reflexního fotometru lZdroj záření: lhalogenová lampa l xenonová výbojka lsvětloemitující dioda l l Hlavní komponenty reflexního fotometru lUlbrichtova koule (jako zdroj difuzního lsvětla): ldutá koule jejíž vnitřní povrch je potažen vysoce reflexním materiálem (síran barnatý). lSvětlo ze zdroje se po vstupu do koule mnohonásobně odráží od stěn a jako dokonale difuzní dopadá na reagenční plošku Hlavní komponenty reflexního fotometru lDetektor záření: luvnitř koule jsou umístěny dva detektory. lJeden měří světlo difuzně odražené od reagenční plošky a druhý je referenční l refl_fotometr Děkuji za pozornost