HLA systém, jeho struktura a funkce HLA (Human Leukocyte Antigens ) = Hlavní histokompatibilní systém člověka •Historie • §1930 – 1940- MHC geny nejdříve rozpoznány u myší na základě pokusů s transplantacemi tumorů u myší § §50. léta- charakterizováno několik geneticky podmíněných antigenů zodpovědných za rejekci alogenních tumorů i normální alogenní tkáně § §60. – 70. léta - již známy 3 lokusy HLA-A, -B, -C, MHC geny se účastní v imunitní odpovědi § §1972- k produkci protilátek B lymfocyty nutná T- buněčná aktivita a také účast HLA molekul §1974- fenomén HLA restrikce ( T lymfocyty rozpoznávají cizorodý antigen pouze v komplexu s HLA molekulami I. nebo II. třídy §80. léta- objev antigenů lokusů HLA-DR, -DQ, -DP • došlo k poznání hlavní funkce MHC molekul v imunitní odpovědi §90. léta- objev tzv. neklasických antigenů lokusů HLA-E, -F, -G, -H, -J, -K, -X • Struktura HLA systému §Nejkomplexnější a nejpolymorfnější systém, každý člověk nese unikátní sestavu HLA alel, výjimka – monozygotní dvojčata § §lokalizace na krátkém raménku 6. chromozomu ( 4100 kb, více než 200 genů ), geny uspořádány do 3 oblastí: HLA I., II., III. třída § • HLA I. třída obsahuje geny: • § –A, -B, -C pro těžký řetězec α molekul HLA-A, -B, -C, jejich produkty (glykoproteiny) jsou exprimovány na povrchu téměř všech buněk (transplantační, klasické ) § §neklasické geny HLA-E, -F, -G (glykoproteiny - omezený výskyt) § §geny MICA, MICB (MHC Class I Chain-related) - strukturou podobné HLA molekulám I. třídy, výskyt - endoteliální bb., ne na lymfocytech § §pseudogeny a geny s neznámou funkcí • HLA II. třída obsahuje: §geny -DRA, - DRB, - DQA, DQB, -DPA, -DPB pro –α a –β řetězec HLA molekul – DR, -DQ, -DP, jejich produkty (glykoproteiny) exprimovány na povrchu tzv. antigen prezentujících buněk § §geny -DM, -DO, nejsou exprimovány na buněčné membráně (endozomy, naložení cizorodého peptidu na HLA molekulu II. třídy) § §geny LMP2, LMP7 kódují proteiny, které štěpí cizorodé částice na menší peptidy § §geny TAP1, TAP2, zahrnuty do procesu transportu peptidů do ER HLA III. třída obsahuje: geny kódující strukturálně a funkčně odlišné proteiny § složky komplementu C4, C2, faktor B, 21-hydroxylasa, TNF, heat shock protein Hsp 70 Kopie - pokus Funkce HLA systému n §Hlavní fyziologickou funkcí HLA molekul je předkládat cizorodé antigeny nebo jejich fragmenty buňkám imunitního systému, především T lymfocytům § §Tato prezentace antigenu je prvním předpokladem pro rozvoj imunitní reakce a tím obrany proti napadení mikroorganismy - primární role imunitního systému je rozpoznat a eliminovat nebezpečné cizirodé agens, tzn., že imunitní systém musí rozlišovat mezi „vlastními“ a „cizími“ antigeny. § § § HLA restrikce - buněčné receptory T lymfocytů (TCR) rozpoznávají komplex sestávající se z cizorodého antigenního peptidu vázaného v peptidovém žlábku HLA molekuly. § §2 způsoby prezentace ciz. antigenů T lymfocytům - endogenní (HLA I. tř.) n - exogenní (HLA II. tř.) q •PŮVOD PEPTIDŮ •Odkud pocházejí cizorodé antigeny rozpoznávané T lymfocyty: • •Patogeny A) • §replikace v cytosolu buňky (viry, některé bakterie) §proteiny produkované buňkou - endogenní zdroj §ciz. peptid + HLA I + CD8+ (Tc lymfocyty) - zabití napadených buněk § • B) §replikace v endosomech a lysosomech (bakterie, paraziti) §proteiny buňkou pohlcené - exogenní zdroj §vesikulární systém buňky (transportní váček) §ciz. peptid + HLA II + CD4+ (Th lymfocyty) §aktivace zánětlivé a protilátkové odpovědi •CD4+ Th1 - zánětlivé - aktivace makrofágů k zabití patogenu •CD4+ Th2 - protilátková odpověd', aktivace B buněk k produkci protilátek • Endogenní prezentace antigenů T buňkám • •Původ peptidů prezentovaných pomocí HLA I – cytoplasmatické/endogenní • •• virové proteiny jsou syntetizovány na ribosomech • •• ubiquitin - označení proteinu určeného k likvidaci • •• proteasom - rozštěpeni proteinu • multikatalytický proteinázový komplex buňky • štěpení proteinů za spotřeby ATP na peptidy • •• TAP1/TAP2 (Transport of Antigenic Peptides) • transport peptidů z cytosolu do endoplasmatického retikula – ATP • •• naložení peptidu na HLA molekulu I. třídy a transport na povrch buňky • •• CD 8+ cytotoxické T lymfocyty - Tc • Tc lymfocyty rozpoznávají komplex HLA I .tř./ virový peptid a mohou zabít infikované buňky dříve než dojde k replikaci viru. • •Exogenous Antigen Presentation Pathway •Původ peptidů prezentovaných HLA II – exogenní •. § Peptidy prezentované HLA molekulami II. třídy jsou odvozeny od mikroorganismů ( exogenní zdroj ), do buňky se dostávají endocytózou a jsou obaleny plazmatickou membránou – tzv. endosom, který později fúzuje s lysozomem a dochází ke štěpení exogenních antigenů na peptidy pomocí LMP. • § Nově syntetizovaná HLA molekula II. tř. je v ER sdružena s tzv. invariantním proteinem Ii, který ji chrání před naložením peptidu z endogenního zdroje. • § HLA molekula II. třídy se setkává s exogenním peptidem ve struktuře MIICs ( MHC class II loading compartments ). • § v MIICs dochází k odstranění Ii pomocí DM a naložení exogenního peptidu na molekulu HLA II. třídy a transport na povrch antigen prezentující buňky. • •Komplex HLA II.tř./peptid je rozpoznán TCR CD4 pozitivních T buněk •( pomocné T lymfocyty - Th), které stimulují B lymfocyty k produkci protilátek. • • ochrana fetálního allograftu • •Plod v těle matky je vlastně cizí štěp, polovina genetické výbavy pochází od otce. •Klasické HLA produkty I. třídy –A, -B, nejsou exprimovány na buňkách trofoblastu → T lymfocyty jsou k plodu ignorantní. Naopak na trofoblastu jsou syntetizovány molekuly HLA-G, (-E) → NK inhibice. • •Závěr: Neklasické HLA-G, (-E) molekuly hrají speciální biologickou roli = ochrana vyvijejícího se fetu před mateřskými T a NK buňkami, hrají roli při potlačení imunitní odpovědi matky proti plodu • • HLA molekuly jsou ligandy pro receptory NK buněk •HLA molekuly aktivují nebo blokují aktivitu NK buněk přes aktivační a inhibiční receptory ( KIR-killer immunoglobuline-like receptor) •NK buňky rozeznávají také neklasické HLA-E a –G molekuly • • úloha HLA molekul v transplantologii • •HLA molekuly jsou silné aloantigeny indukující rejekci štěpu • • • snímek66 087 •HLHLA Beyond Tears, Glenn E. Rodey, str.35, 2000 Exprese a distribuce HLA molekul §produkty genů HLA I. tř. - nalezeny na všech jaderných buňkách §HLA geny exprimovány kodominantně – oba geny (alely) každého HLA lokusu se vyjádří syntézou polypeptidového řetězce HLA produktu) §na mladých červených krvinkách – atypický antigenní systém Bga, Bgb, Bgc ( reziduální HLA antigeny ) §plazma – solubilní HLA antigeny § § § §produkty genů HLA II. tř. – omezená distribuce: B lymfocyty, makrofágy, dendritické buňky, Langherhansovy buňky kůže, některé endoteliální buňky §exprese HLA antigenů I. a II. třídy může být zvýšena během zánětu, ale také může být indukována na určitých buňkách, na kterých se normálně neexprimují (myocyty, hepatocyty ). typ buňky, tkáně exprese HLA I HLA II BUŇKY IMUNITNÍHO SYSTÉMU dendritické buňky +++ + makrofágy +++ ++ T lymfocyty +++ + B lymfocyty +++ +++ JINÉ JADERNÉ BUŇKY neutrofilní granulocyty +++ - eosinofilní granulocyty +++ - epitelové buňky +++ - hepatocyty + - nervové buňky + - buňky ledvin + - NEJADERNÉ BUŇKY trombocyty ++ - erytrocyty - - • •Tab.1.: Odlišnosti v expresi molekul HLA I. a II. třídy na různých buněčných typech •( J. Krejsek a O. Kopecký, Klinická imunologie, str. 125, 2004) Srovnání vlastností a funkce HLA I a HLA II nCharakteristika HLA I HLA II n nStruktura α řetězec + β2m α a β řetězce n nDomény α1, α2 a α 3 + β2m α1, α2 a β1, β2 n nBuněčná exprese téměř všechny jad.buňky APC (B buňky, dendritické n buňky,makrofágy) n nPeptidy vázající místo uzavřené,váže 8-9 amk otevřené, váže 12-17amk n tvořené doménami α1 a α2 tvořené doménami α1 a β1 n nPeptidy endogenní antigeny exogenní antigeny n nPeptidy prezentované CD8+T buňkám CD4+T buňkám Dědičnost HLA systému § § geny vázané X geny volně kombinovatelné §HLA geny jsou vázané → děděny „en bloc“ od rodičů jako haplotyp §někdy rekombinace ( crossing-over během meiotického dělení) v HLA oblasti → výměna genetického materiálu mezi homologickými chromozómy → vznikají rekombinantní sestavy alel § §frekvence rekombinace je závislá na vzdálenosti mezi geny § §vazebná nerovnováha ( linkage disequilibrium ) n - běžná v HLA systému n - určité kombinace alel se vyskytují častěji, než by se očekávalo na základě jejich genové frekvence n nNapř. HLA- A1 a HLA-B8 s genovými frekvencemi 0,16 a 0,1 v populaci. Očekávaná frekvence výskytu haplotypu HLA –A1, B8 v populaci by měla být 0,16x 0,1x100%= 1,6%. V některých kavkazských populacích frekvence tohoto haplotypu zdaleka přesahuje očekávanou frekvenci ( 8% ). nEvoluční základ vazebné nerovnováhy je spekulativní, určité kombinace HLA alel asi poskytují v některých populacích určitou selekční výhodu n • • • • • • • • • • • • • ♀ ♂ • a b c d • • • A2 A24 A1 A3 • B7 B44 B8 B27 • DR4 DR17 DR1 DR8 • • • a c a d b c b d • • • • • A2 A1 A2 A3 A24 A1 A24 A3 • B7 B8 B7 B27 B44 B8 B44 B27 • DR4 DR1 DR4 DR DR17 DR1 DR17 DR8 • • Obr.4: Dědičnost HLA haplotypů •Obr.5: Vznik nerekombinantních a rekombinantních HLA haplotypů • HLA a choroby §1967 – první zprávy o asociaci HLA systému s onemocněním u člověka §1973 – objevena asociace HLA-B27 s ankylozující spondylitidou ( m. Bechtěrev ) §následně byly studovány stovky onemocnění pro možnou asociaci onemocnění s HLA systémem, u více než 50ti onemocnění byla prokázána statisticky významná asociace § § n Rysy HLA asociovaných chorob: § §choroby asociované s HLA antigeny jsou většinou nemaligní chronická onemocnění §převážně autoimunitní onemocnění §většina chorob je multifaktoriálních ( geny+ environmentální složka) §Spouštěčem onemocnění často environmentálním faktory (např. mikroorganismy, stres, …) n •Některé příklady asociace HLA alel s chorobou: • • Birdshot retinopathy -A29 RR=200 • •Ankylosing spondylitis -B27 81,8 • • Narcolepsy -DQB1*06:02 100 • • Psoriasis vulgaris -B13, Cw6 4,5 7,2 • • Celiac disease - DQB1*02, *03:02 13,3 • - DQA1*03:01, *05 • Type I diabetes mellitus - DQB1*02, *03:02 10 • - DQA1*03:01, *05 • • Rheumatoid arthritis - DR4 4 • •ANKYLOSING SPONDYLITIS ( AS, M. BECHTĚREV ) -asociována s HLA-B27 • §zánětlivá forma artritidy, postižení ve větší míře mladí muži § §zánět napadá kloubní spojení mezi pánví a páteří , nemoc se • může postupně šířit nahoru a dolů ke kyčelním a kolenním kloubům. § §různý průběh onemocnění, může končit velmi vážnými deformitami § §průběh onemocnění dlouhodobý §ostatní choroby asociované s HLA-B27 – Reiterova choroba (revmatické onem.,často vyvolávají chlamydie, trojice obtíží: neinf.zánět kloubů, moč.trubice a spojivek) • - Anterior uveitis (přední uveitida-zánět duhovky, řasnatého tělíska) - • •CELIAC DISEASE ( CD ) • •-predispoziční haplotypy -DRB1*03- DQA1*05:01- DQB1*02:01 •-DRB1*07- DQA1*02:01- DQB1*02:02 •-DRB1*04 -DQA1*03:01-DQB1*03:02 •- geneticky podmíněné autoimunitní onemocnění • - intolerance na gluten (lepek), trávicí soustava pacienta není schopna trávit potraviny obsahující lepek • -chronický zánět sliznice tenkého střeva - prevalence v ČR – 1 : 200-250 •- pro vývoj onemocnění nutné 3 podmínky: • 1. genetické předpoklady • 2. konzumace stravy obsahující lepek • 3. spouštěč onemocnění ( stres, trauma, virová infekce ) - dlouhodobé průjmy, únava, bolesti kostí, břicha, svalů, u dětí také problémy se zuby, růstem a vývojem - jediná známá léčba – celoživotní dodržování bezlepkové diety - - - - - HLA nomenklatura 1.Sérologická definice HLA antigenů 2. •- antigeny základní – např. A9, A10, B51, B40, Cw3, DR2, DQ3…. •- antigeny splitové ( subtypy ) - sdílejí společné sérologicky definované epitopy • např. A10→ A25, 26, 34 • B40→ B60, 61 • Cw3→ Cw9, 10 • DR2→ DR15, 16 • DQ3→ DQ7, 8, 9 •- antigeny obecné – DR51, DR52, DR53 • • - Bw4, Bw6 specifity – nejedná se o genové produkty, ale o „public“ epitopy. Jsou to alternativní aminokyselinové sekvence přítomné na všech HLA-B molekulách a na HLA-A23, 24, 25, 32. • •V r. 1987 – 10th International Histocompatibility Workshop, přijata nomenklatura založená na následujících principech: •- HLA= Hlavní histokompatibilní komplex člověka •- A, B, C, DR, DQ, DP..…lokusy •- číslo ( A1, Cw3 ) = označení specifity molekuly ( antigenu ) • •2. Molekulárně-genetická definice HLA alel • •Na rozdíl od serologické nomenklatury, která má maximálně dva číslicové znaky, molekulárně-genetická nomenklatura používá znaky dvou a vícemístné. •př. HLA-A*02, *31, B*08, *44, C*02, *12, DRB1*04, *13, DQB1*07, *08 • - úroveň „low resolution“ •HLA-A*01:01, *02:02, B*07:01, *35:01, C*02:02, *03:03, DRB1*04:01, *13:05, DQB1*03:04, *03:05 - - úroveň „high resolution“ - •Někdy více jak 4 znaky: •C*02:02:01, *02:02:02………alely se liší v tiché nukleotidové substituci na úrovni DNA, ale ne v aminokyselinové sekvenci na úrovni polypeptidu (tichá mutace) -A*24:02:01:01 7. a 8. pozice – polymorfismus v nekódující oblasti -A*24:02:01:02L „ low expressed“ allele - B*51:11N „ null“ allele •Duben 2010 – nová nomenklatura, k oddělování jednotlivých dvojčíslí v označení alel se budou používat dvojtečky. •Např.: B*0808N→B*08:08N • A*9201→A*02:101 • •2. molekulárně-genetické metody • •PCR – enzymatická metoda in vitro, která slouží k namnožení ( amplifikaci ) specifického úseku DNA vymezeného párem specifických primerů. •3 kroky – izolace DNA ( plná krev,bukání stěry, krevní skvrny, vlasové folikuly, parafínové tkáňové bloky) • • - amplifikace DNA ( PCR )- počet kopií DNA - 2n • n = počet cyklů (30 – 35) • • - detekce PCR produktu • ADN_animation C:\Users\7767\Pictures\IMG_20150904_101125.jpg •1. PCR – SSP (sekvenčně specifické primery) §tolik primerových párů, aby mohly být amplifikovány a detekovány všechny známé alely daného lokusu §každý pár primerů určuje jednu alelu nebo skupinu alel, rozlišení během PCR §v závislosti na výběru primerových párů PCR – SSP může být užita pro „low resolution“ nebo „ high resolution“ typizaci §HLA typizace „ low resolution“pro lokusy -A, -B, -DR, -DQ vyžaduje 95 – 100 primerových párů §„high resolution“ - následně po sérologické nebo po „low resolution“ typizaci § v každé zkumavce tzv. interní kontrola amplifikace § kontrola kontaminace – zkumavka obsahuje všechny reagencie pro PCR kromě templátové DNA §detekce specifických PCR produktů elektroforeticky,specifita amplifikované DNA sekvence (amplikonu) je určena molekulovou hmotností, která se projeví rozdílnou pohyblivostí v agarózovém gelu při elektroforéze §vizualizace – obarvení gelu fluorescenční barvou, která se inkorporuje do DNA, expozice gelu UV světlem na transiluminátoru §fotodokumentace •Princip SSP-PCR ADN_animation •úplná shoda – amplifikace proběhne •neshoda – amplifikace neproběhne snímek66 027 2. PCR – SSO (sekvenčně specifické oligonukleotidy) §využití lokus – specifických primerů (značené biotinem) § § amplifikuje se celá oblast kódovaná jedním lokusem (exon 2,3) § §specifické alely nebo skupiny alel jsou následně určeny reverzní hybridizací s oligonukleotidovými próbami (sondami) § § denaturace amplifikované DNA § DNA próby (sondy ) imobilizovány (nitrocelulózovém stripu, mikropartikule) § reverzní hybridizace denaturované DNA s DNA próbou § §vymytí nespecificky navázané DNA § §konjugát ( streptavidin + alkalická fosfatáza), vytvoření barevného precipitátu na stripech - systém INNO Lipa § §Konjugát – streptavidin + PE - Luminex, snímání fluorescence laserem §Vyhodnocení pomocí softwaru skenovat0002 snímek66 088 PCR–SSO typizace na analyzátoru Luminex Fluoroanalyzátor LUMINEX C:\Users\7767\Pictures\IMG_20150904_100208.jpg Imunologie leukocytů a trombocytů Transplantologie §Všechny buňky lidského těla nesou na svých membránách antigenní znaky, které jsou uspořádány do systémů § Systémy membránových znaků byly nejdříve zjištěny a prozkoumány na erytrocytech, později také na leukocytech a trombocytech §Antigeny mají schopnost indukovat v organismu detekovatelnou odpověď a specificky reagovat s produkty této odpovědi, t.j. s protilátkami nebo efektorovými T buňkami. § Protilátky, produkty plazmatických buněk, se uvolňují zejména do krevní plazmy, v menším množství se vyskytují také v tělních tekutinách, hlenu a na povrchu sliznic §Hladina protilátek v séru kolísá v závislosti na věku, pohlaví a na stupni rozvinutí imunitních reakcí § Protilátky, patřící do rodiny imunoglobulinů, lze rozdělit dle způsobu vzniku: 1.aloimunní protilátky - transfuze krevních složek - transplantace - záměrná imunizaci - těhotenství, aborty 2. autoprotilátky – proti vlastním antigenům jedince 3.alergické protilátky 4.přirozené protilátky § § §Dle různých typů H řetězce lze rozlišit 5 tříd imunoglobulinů – IgG, IgM, IgA, IgD a IgE. § § V imunologii leukocytů a trombocytů hrají důležitou roli imunoglobuliny třídy IgG, IgM a IgA. 1. antigeny společné s erytrocytárními - ABO, Rh, P, MNSs, … § 2. antigeny specifické pro leukocyty - specifické antigeny lymfocytů HLA antigeny - specifické antigeny granulocytů HNA antigeny - specifické antigeny monocytů HMA antigeny HLA antigeny a anti- HLA protilátky §anti-HLA protilátky vyvolané účinkem HLA antigenů jsou nejčastěji lymfocytotoxiny, méně často leukoaglutininy §anti-HLA protilátky vznikají tehdy, obsahuje-li imunizační faktor HLA antigeny odlišné od osoby vystavené jeho účinku. §a-HLA protilátky jsou aloimunní imunoglobuliny třídy IgG a IgM. §přirozeně se vyskytující anti-HLA protilátky (bez imunizačního podnětu) jsou velmi vzácné. Imunologie leukocytů Klinické syndromy způsobené anti-HLA protilátkami Febrilní nehemolytická potransfuzní reakce – FNHTR (teplota, třesavka, zimnice, bolest hlavy) § §příčinou mediátory a cytokiny z leukocytů uvolněné v průběhu zpracování a skladování TP §někdy je příčinou přítomnost antileukocytárních (částo a-HLA) protilátek v plazmě pacienta při podání TP kontaminovaných leukocyty §Snížení výskyty FNHTR – plošná leukodeplece TP Potransfuzní reakce TRALI - imunní TRALI §a-HLA nebo antigranulocytární protilátky v plazmě DK reagující proti antigenům leukocytů příjemce transfuze nebo antileukocytární protilátky v plazmě příjemce transfuze reagující proti antigenům leukocytů přítomných v TP §aktivované leukocyty - obstrukce plicní mikrocirkulace, vzniká plicní edém § klinické projevy do 6 hodin po podání transfuze (většinou neprodleně po zahájení transfuze) §podpora vitálních funkcí §i jiné příčiny – stáří skladovaného TP § Ø Refrakterita §refrakterita na podání trombocytových transfuzních přípravků způsobená přítomností anti-HLA protilátek v séru pacienta reagujícími s HLA antigeny I. třídy nacházejících se na membránách trombocytů dárce §výběr HLA kompatibilního dárce transfuzního přípravku z registru HLA otypovaných dárců nebo zkouška kompatibility v lymfocytotoxickém testu mezi sérem příjemce a lymfocyty dárce (cross-match) Akutní rejekce §odvrhnutí transplantovaného štěpu §pravděpodobnost vzniku akutní rejekce je tím větší, čím větší odlišnosti v HLA systémech dárce a příjemce existují §úloha non-HLA faktorů Detekce anti-HLA protilátek Lymfocytotoxický test (LCT) §reakce mezi protilátkou v séru pacienta a antigenem buněčné membrány typových lymfocytů §záchyt protilátek pouze proti HLA I. třídě § Detekce anti-HLA protilátek pomocí analyzátoru (Luminex) § Luminex® je metoda využívající navázané HLA glykokoproteiny na barevně značené mikročástice a vazba protilátek ze séra je prokázána průtokovou cytometrií s dvojitým laserem §Luminex® má větší specifitu a senzitivita než LCT, umožňuje záchyt protilátek proti HLA I., II. třídě a anti-MICA snímek66 092 C:\Users\7767\Pictures\IMG_20150904_100248.jpg Detekce anti-HLA protilátek metodou Luminex §Barevně značené mikročástice s navázanými HLA antigeny §Inkubace mikročástic se sérem pacienta §Přidání fluorescenčně značené sekundární protilátky §Detekce pomocí laserových paprsků HNA antigeny (Human Neutrophil Antigens) §Známo 7 antigenů, které jsou uspořádány do 5 HNA systémů: §HNA–1 má 3 alely: HNA-1a, HNA-1b, HNA-1c (polymorfní formy neutrofilního Fcγ receptoru IIIb (CD16b)), HNA-1 specifický pouze pro neutrofily §Vzácně HNA-1 null fenotyp – jedinci neexprimují Fcγ receptor IIIb, možnost tvorby protilátek §Funkce - Fcγ receptor IIIb slouží jako receptor pro IgG1 a IgG3 § - přispívá k fagocytóze opsonizovaných mikroorganismů §HNA-2a antigen – typická heterogenní exprese jedince (jedinec má subpopulaci neutrofilů s HNA-2a a subpopulaci bez HNA-2a) §Vyšší exprese HNA-2a u žen než u mužů, u žen klesá s věkem §HNA-2 null fenotyp – tvorba specifických protilátek §Funkce – zahrnut do procesu adheze neutrofilů k endoteliálním buňkám a jejich migraci §HNA-3a antigen exprimován na neutrofilech a lymfocytech, exprese na trombocytech je sporná §Protilátky a-HNA-3a schopné aglutinovat neutrofily §Funkce neznámá § §HNA-4a antigen a HNA-4a negativní jedinci objeveni v roce 1986 §HNA-4a genotypy nalezeny u více jak 90% bělochů §Exprese na neutrofilech, monocytech a NK §Funkce – adheze leukocytů k endoteliálním buňkám a při fagocytóze § §HNA-5a – exprese na všech leukocytech §Funkce – adheze leukocytů •Klinické syndromy způsobené anti-HNA protilátkami §Aloimunitní neutropenie novorozence způsobená mateřskými aloprotilátkami proti HNA antigenům na neutrofilech plodu při absenci na neutrofilech mateřských nebo jako transplacentární přenos protilátek od matky s autoimunitní neutropenií Většinou jsou mateřské aloprotilátky zaměřeny proti antigenům HNA-1a, HNA-1b a HNA-2a, méně často proti HNA-1c a HNA-4a. § §Potransfuzní reakce TRALI a FNHTR §Autoimunitní neutropenie u dětí vyvolaná antigranulocytárními autoprotilátkami nejčastěji proti HNA-1a, HNA-1b, HNA-2a, HNA-4a § § Detekce antigranulocytárních protilátek Granuloaglutinační test (GA) §zachycuje granuloaglutininy §reakce probíhá specificky mezi antigeny membrány typových granulocytů a protilátkami vyšetřovaného séra §hodnotí se mikroskopicky shluky granulocytů, při negativní reakci zůstávají granulocyty volné. § Granuloimunofluorescenční test (GIFT) §detekuje antigranulocytární protilátky navázané ze séra pacienta na povrch typových granulocytů. §k vizualizaci navázané protilátky dochází pomocí zvířecí protilátky proti lidskému imunoglobulinu značené fluorescein-isothiocyanátem (FITC) §na typové granulocyty je navázána protilátka ze séra pacienta a na ni pak zvířecí protilátka značená FITC §granulocyty s navázanou protilátkou svítí ve fluorescenčním mikroskopu zeleně. Imunologie trombocytů Antigeny specifické pro trombocyty - HPA antigeny §na trombocytech bylo dosud objeveno 8 bialelických systémů - HPA-1, HPA-2, HPA-3, HPA-4, HPA-5, HPA-6, HPA-9 a HPA-15 §jako první trombocytární antigen byl určen antigen HPA-1a, který se v populaci vyskytuje ve fenotypové frekvenci 97,9% §v kavkazké populaci je protilátka proti antigenu HPA-1a nejčastější příčinou fetomaternální aloimunitní trombocytopenie §antitrombocytární protilátky vznikající jako odpověď imunitního systému na HPA antigen, se dělí: •aloprotilátky (po transfuzi, po transplantaci, v průběhu těhotenství) •autoprotilátky způsobující destrukci vlastních trombocytů (autoimunitní trombocytopenie, ITP) •léky indukovaná trombocytopenie (antiepileptika, analgetika, některá antibiotika) §antitrombocytární protilátky jsou vetšinou třídy IgG, často také IgM a zřídka IgA. § Detekce antitrombocytárních protilátek DIFT (destičkový imunofluorescenční test) §zachycuje specifické antitrombocytární protilátky ale i HLA protilátky §k vizualizaci navázané protilátky na povrch typových trombocytů dochází pomocí anti-lidského imunoglobulinu značeného fluoresceinem § ELISA (Enzyme Linked Imunosorbent Assay) §enzymoimunostanovení, zachycující protilátky proti trombocytům §vazbu antigenu s protilátkou detekujeme pomocí antiglobulinu, který je značený enzymem peroxidázou §po proběhnutí reakce enzym-substrát a zastavení reakce hodnotíme intenzitu zbarvení na fotometru vzhledem ke kontrolám §záchyt nespecifických protilátek § Průtoková cytometrie (Flow cytometry) §využívá anti-CD41/PE protilátky k označení populace trombocytů §navázaná protilátka na trombocytech je detekována sekundární anti-lidskou protilátkou značenou jinou fluorescenční barvou (např.Fluorescein Isothiocyanatem - FITC) § Transplantace §Transplantace orgánová – srdce, játra, ledviny, plíce, kombinované Tx §2 typy dárců – kadaverózní dárce a dárce žijící § § §Transplantace kostní dřeně, periferních kmenových buněk, pupečníkové krve §Podle typu dárce Tx autologní, alogenní, syngenní §Alogenní transplantace – příbuzenecká, nepříbuzenecká §Registry dárců Ø Český národní registr dárců dřeně (ČNRDD) - Plzeň Český registr dárců krvetvorných buněk (CSCR) - Praha Podmínky pro vstup do registru: § věk 18-35 let § dobrý zdravotní stav, žádné závažné onemocnění v minulosti §ochota překonat určité nepohodlí a ztrátu času, spojené s jednou či několika návštěvami zdravotnického zařízení, případně s odběrem krvetvorných buněk v zájmu záchrany života druhého člověka. Registry dárců kostní dřeně v ČR Požadavky na dárce orgánů §Kadaverózní dárce orgánů je osoba s prokázanou mozkovou smrtí při zachovalém krevním oběhu, s funkčními orgány a bez přítomnosti kontraindikace dárcovství. §Zákon č.285/2002 Sb. určuje přesná pravidla na určení mozkové smrti a souvisejících předpisů včetně požadavků na kvalifikaci odborníka potvrzující mozkovou smrt. §V ČR platí předpokládaný souhlas s dárcovstvím, osoby nesouhlasící s dárcovstvím mají právo se přihlásit do speciálního registru osob nesouhlasících s dárcovstvím (registr NROD) . §Pracoviště zvažující dárcovství musí ověřit, zda pacient v tomto registru není. Souhlas rodiny není zákonně nutný, ale obvykle se bez souhlasu rodiny dárcovství neuskuteční. §Nejčastější dárci jsou s úrazy hlavy, nitrolební krvácení a další, první informaci o možném dárci podává ošetřující lékař do spádového transplantačního centra ještě před ověřením smrti mozku. §Smrt mozku je ze zákona potvrzována komplexem vyšetření (angiografie-znázornění oběhu krve kontrastní látkou, kdy se prokáže zástava kr. oběhu mozku). §přibližně 10% dárců představují u nás žijící dárci ledviny (rodiče, sourozenci, jiní příbuzní). §pokud je dárce osoba bez příbuzenského vztahu k pacientovi, je nezbytné posouzení etickou komisí. §absolutní kontraindikací pro Tx ledviny od žijícího dárce je onemocnění ledvin, maligní nádory s možností metastáz, přítomnost australského antigenu (riziko přenosu hepatitidy B), pozitivita na HIV a věk do 18 let. Další podmínkou všech Tx od žijících dárců je vyloučení jednání pod nátlakem či za úplatu §živý dárce – kratší doba studené ischémie, odběr a Tx jsou naplánované a probíhají prakticky ve stejnou dobu . Tato skutečnost výrazně přispívá k vynikajícím výsledkům Tx od žijících dárců i bez shody v HLA. Nutnou podmínkou je negativní cross-match (křížová zkouška) mezi dárcem a příjemcem a shoda v KS. § Ø