Nutrigenomika a nutrigenetika Nutrigenomika a Nutrigentika Nutrigenomika a Nutrigentika ÚVychází z pěti základních předpokladů (Kaput, Rodriguez, 2006): Ú Ú 1) Nutriční látky jsou schopny přímo nebo nepřímo působit na lidský genom, měnit jeho strukturu, expresi genů a tím průběhy metabolických drah. Ú Ú2) Za určitých okolností může být dieta u určitých jedinců významným rizikovým faktorem vzniku chronického onemocnění. Ú Ú 3) Některé z cílových genů nutričních látek obsažených v potravě mohou hrát roli v nástupu, incidenci, průběhu a závažnosti některých chronických onemocnění. Ú Ú 4) Míra vlivu diety na rovnováhu mezi zdravím a nemocí může záviset na konkrétní genetické výbavě jedince. Ú Ú5) Pokud budou známy konkrétní potřeby jedince, nutriční stav a genotyp, může být nutriční intervence cílena k prevenci, zmírnění nebo léčení chronických onemocněn Molekulární metody ÚNutrigenetika ÚOdběr vzorků ÚIzolace a extrakce DNA ÚAmplifikace DNA – PCR ÚRestrikční analýza ÚSekvenování Ú Ú Ú ÚNutrigenomika ÚOdběr vzorků ÚIzolace a extrakce DNA, RNA, proteinů a metabolitů ÚEpigenom ÚTranskriptom ÚProteom ÚMetabolom clus somnorm Molekulární metody Experimenty rand random color Čím lepší nástroje (metody), tím lepší obraz…. Odběr biologického materiálu – bukální stěr, odběr periferní krve • Izolace a purifikace DNA – fenol-chloroformová extrakce, kolonky (adsorpce na silikagel) Molekulární metody – PCR, gelová elektroforéza, RA, RT-PCR, sekvenování NUTRIGENETIKA Metody molekulární biologie PCR – Polymerázová řetězová reakce ÚPCR – Karry Mullis 1983 ÚEsenciální molekulární metoda ÚDNA replikace in vivo vyžaduje několik enzymů Ú Ú X Ú ÚDNA replikace in vitro vyžaduje pouze jeden enzym – termostabilní DNA polymerázu (bakterie Thermus aquaticus) Ú ÚFUNKCE OSTATNÍCH PROTEINŮ JE in vitro NAHRAZENA ZMĚNOU TEPLOT! Ú Úopakování cyklů pomocí změn teploty: Ú - denaturace (separace dsDNA) Ú - navázání primerů (annealing) Ú - elongace primerů Ú - syntéza nového vlákna DNA Ú Ú Ú Elektorforéza ÚSeparační metoda využívající k dělení látek jejich odlišnou pohyblivost ve stejnosměrném elektrickém poli (separace molekul o rozdílné hmotnosti, popř. odlišném elektrickém náboji). Ú ÚVyužívá schopnosti nabitých částic pohybovat se v elektrickém poli, přičemž rychlost pohybu částic je závislá na velikosti celkového povrchového náboje, velikosti a tvaru molekuly a její koncentraci v roztoku. Ú ÚMolekuly, které v zásaditém prostředí nesou záporný náboj (DNA, RNA) Ú ÚPři dělení v gelu budou všechny molekuly (fragmenty stejné délky) putovat stejnou rychlostí a po obarvení a zobrazení uvidíme jen jeden pruh, jehož molekulová hmotnost odpovídá při srovnání se standardem předpokládané délce molekuly. Ú ÚGely tvoří hustou síť, kterou větší molekuly procházejí pomaleji než menší molekuly –technika molekulového síta. Ú ÚAgarosa je polysacharid tvořený D-galaktosou a anhydro-L-galaktosou, který produkují některé mořské řasy (agar). Ú ÚDo agarosového gelu se většinou přímo přidává ethidiumbromid, který po vazbě na DNA pod UV emituje oranžové světlo. Elektroforéza- ELFO ÚRestriction Fragment Length Polymorphism (polymorfismus délky štěpných fragmentů) Úenzymatické štěpení molekul DNA ve specifickém štěpném (restrikčním) místě bakteriálním enzymem - restrikční endonukleáza (RE) ÚKaždý typ restrikční endonukleázy štěpí cílovou DNA v různých místech (palindrom), v závislosti na sekvenci DNA. ÚSNP, inzerce, delece – změna štěpného místa (získání nebo ztráta) ÚPo rozdělení vzniklých fragmentů pomocí gelové elektroforézy lze na základě velikosti a počtu fragmentů sledovat rozdíly ve studovaných sekvencích, tzv. polymorfizmy. 1) RFLP – Restrikční analýza Restrikční enzymy http://barleyworld.org/sites/default/files/figure-11-04.jpg 1.Vizualizace restrikčních fragmentů po štěpení TaqI (Agarózový gel) – TTGA vs TCGA Ú Ú1. Neštěpená TT Ú Ú2. Štěpená CC Ú Ú Ú3. Heterozygot CT – 3 pruhy Ú Ú4. M – Marker po 100 bp Ú JAK? 249bp 114bp 135bp C vizualizace DNA fragmentů po restrikční analýze 2) Real-Time PCR •Založena na principu klasické PCR •Umožňuje sledovaní amplifikace v reálném čase na základě fluorescence (detekce: CCD kamera) •Genotypizace pomocí dvou rozdílně značených sond (např. VIC, FAM), kdy každá odpovídá Ú jiné alele Ú ÚTaqMan próby Ú sekvence o velikosti primeru komplementární k specifickému místu templátu Ú kovalentně vázaný fluorofor na 5´ konci próby - různé flurofory Ú kovalentně vázaný zhášeč (quencher) na 3´ konci próby Ú princip založen na využití 5´-3´ exonukleasové aktivity Taq DNA polymerázy Ú množství detekované fluorescence je přímo úměrné množství fluoroforu uvolněného z DNA přítomné v PCR reakci Ú vysoká specifita detekce Ú • • Ú RT-PCR 3) DNA SNP chip Útisíce SNP najednou (Illumina, Affymetrix) ÚIllumina chip cca 13 tis SNP – 99 USD ÚČip Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0 obsahuje –které pokrývají přes 906 600 SNP, 946 000 sond pro CNV (copy number varations) – 1,8 genetických variací –Cena 300 USD ÚGenomové asociační studie (GWAS) !!! Ú Ú 4) Sekvenování DNA ÚZjištění skutečné sekvence (pořadí nukleotidů) DNA ÚKompletní informace o nukleotidovém složení daného fragmentu ÚSangerova metoda – pomocí značených dideoxy nukleotidů ÚNové metody – Next generation sequencing ( e.g. Illumina) ÚPřesnost Sanger (99%), Illumina (98%) Celogenomové sekvenování ÚProjekt HUGO 2003 – cena 3 mld. USD ÚNové metody sekvenování – cíl dostat se pod 1000 USD ÚVeritas project 2015 –– cena 1000 USD Beta verze!!! screeningové, ne diagnostické využití –Prodej „direct to customer“ –zisk ne z prodeje celogenomového sekvenovaní, ale s dodatečných konzultací výsledků? ÚPotenciální náhrada za všechny dosavadní genetické testy? Ú Ú Ú Celogenomové sekvenování – možná úskalí Ú Ú„Sebenaplňující se proroctví“ – pozitivní vs. negativní stimul ÚSocio-ekonomický aspekt (dostupnost pro všechny, exkluzivní záležitost) ÚEtický problém (záměrné preference určitých genotypů, výběr partnera, GATTACA – dokonalí lidé) ÚZneužití informací (např. pojišťovny) ÚZpracování a správná interpretace dat !!! „I decided to have a DNA test due to being unwell for so many years and it has now helped to push the doctors in the right direction – hopefully“ 23andMe Health Testing review by a DNA Testing Choice user „I bought my husband a test, and was very impressed. I then took one for myself, and shared my results with him. It’s great that I can check trait probabilities, make sure we don’t pass terrible genetic conditions along to our children, and find out exciting things about ourselves that we didn’t even know were genetic. I recommend this test wholeheartedly to all those considering having children. It’s good to be prepared“ Nutrigenetika - definice ÚNutrigenetika zkoumá účinek genetických variací na interakci mezi stravou a onemocněním nebo nutričními požadavky. Genetika má zásadní úlohu pro identifikaci individuálního rizika (predispozice) rozvoje určitého onemocnění.“ Muller M & Kersten S. (2003) Nature Reviews Genetics 4:315-322. Ú ÚNutrigenetika představuje vědu zabývající se identifikací a charakterizací genových variant souvisejících s různou odpovědí na různé nutrienty a zaměřuje se na hledání souvislostí mezi těmito variace a stavem onemocnění.” Mutch D, et al. (2005) FASEB Journal 19:1602-1616. Ú Nutrigenetika Genetika a výživa Újasná nutriční doporučení pro monogenní enzymopatie ÚFenylketonurie §AR, 1:6000 §Mutace v genu pro fenylalaninhdroxylazu (přeměna fenylalaninu na tyrosin) §Test se dělá po porodu §Terapie : trvalém podávání diety s nízkým obsahem fenylalaninu (eliminace potravin bohatých na proteiny, jako je hovězí a vepřové maso, drůbež, vajíčka, sýr, mléko..) § Při včasném nasazení diety se jedinec vyvíjí zcela normálně. §Homocystinurie §AR, 1:83000 (1:15000) §Nejčastěji způsobena poruchou aktivity cystathion beta-syntázy (CBS deficit) – přeměna methioninu na cystein §V organismu nemocných dětí se hromadí kromě aminokyseliny methionin i velmi toxický homocystein. §Terapie: velké dávky vitamínu B6 (pyridoxinu), které však musí dosahovat až několika set miligramů za den vedou u 50% s CBS deficitem ke snížení homocysteinu a methioninu , U pacientů, kteří neodpovídají na pyridoxin, musí být zahájena a po celý život dodržována nízkobílkovinná dieta se sníženým obsahem methioninu ÚGalaktosémie §AR, 1: 50000 (35000) §chybění galaktóza-1-fosfát-uridyltransferázy, která metabolizuje galaktóza-1-fosfát na UDP-galaktózu §Terapie: celoživotní bezlaktózová strava, galaktóza prochází placentou – v těhotenství dodržovat bezlaktózovou dietu § – Ú Ú Ú Nutrigentické testy ÚObrovský tržní potenciál: předpověď pro rok 2020 – obrat 20 mld.USD v U.S.A ÚThe Government Accountability Office (GAO) (2006) Ú Nutrigentické testy - komerční Nutrigenetické testy ÚMetanalýza týkající se 38 genů běžně používaných v komerčně dostupných nutrigenetických testech ÚHodnocení prognostického potenciálu Ú524,592 jednotlivců (361,153 případů and 163,439 kontrol) z 1170 studií Ú Nutrigenetické testy ÚZákladní otázkou je, jestli jsou dosavadní vědecké poznatky dostačující pro nutrigenetické testování s následnými nutričními doporučeními? Ú ÚProblém prodeje komerčních testů „direct to customer“ – bez interakce s odpovídajícími specialisty (lékař, nutriční terapeut, genetik) Ú Ú Ú ÚU multifaktoriálních chorob (kardiovaskulární onemocnění, obezita, diabetes 2. typu, hypertenze) jsou nutriční doporučení na základě genetických variací prozatím diskutabilní a nejednoznačné Ú Úv současné době nelze doporučit komerčně dostupné nutrigenetické testy Ú ÚALE velký příslib do budoucna – potřeba více klinických studií, funkční interakce genotyp – nutrient, interakce gen –gen, zvířecí modely (knock-out) Ú Výstupy z komerčních testů – „direct to customer“ Výstupy z komerčních testů – „direct to customer“ http://www.extremetech.com/wp-content/uploads/2015/02/23andMe.png Interpretace dat!!! „I was really happy with these results – as long as I don’t have a more unfavourable response than average, I see no reason to worry about these analyses!“ „At the end of this section, I was told that I needed a ‘balanced diet with a controlled intake of carbohydrates’. Tables were provided to show the food groups I should include in my diet, my optimal daily calorie intake.“ Přelomová doporučení!!! ÚDon’t Smoke ÚMaintain an Ideal Weight ÚEat a Balanced Diet ÚGet Regular Exercise ÚReduce Stress. Příklady SNP v kom. NT ÚGLUTATHION-S-TRANSFERÁZA, BROKOLICE A RIZIKO KARCINOMU PLIC Ú ÚGlutathion- S-transferáza M1 (GSTM1) je enzym, který detoxifikuje zplodiny (např. z cigaretového kouře) ÚDelece GSTM1 genu (nulová alela), není produkován tento enzym: –riziko karcinomu plic ÚZelená brukvovitá zelenina typu brokolice je bohatá na izothiokyanáty. ÚCase-control studie: 2141 pacientů (karcinom plic), 2168 controls ÚVysoká konzumace - alespoň jednou týdně:) ÚNull GSTM1: OR = 0.67 (0.49-0.91) (p = 0.0092) ÚBez protektivního efektu u pacientů bez delece GSTM1 Brennan P et al. Lancet. 2005 (266), 1558-1560. (especially if you have null GSTM1! ) Příklady SNP v kom. NT Ú MTHFR (methyltetrahydrofolátreduktasa) Ú Enzym zapojený do metabolismu vitamínu B6, B12 a kys.listové Ú DNA syntéza a metylace ÚKlíčová úloha při přeměně aminokyselin homocysteinu na methionin. ÚMTHFR 2 SNP - C677T a A1298C ÚRizikové alely - 677T a 1298C --> snížená aktivita enzymu --> hromadění homocysteinu v krevní plazmě --> poruchy srážlivosti krve ÚDoporučení: Zvýšit příjem B6 a B12 Ú Ú ÚX Ú Ú„Don’t order MTHFR genetic testing for the risk assessment of hereditary thrombophilia. ÚThe common MTHFR gene variants, 677C>T and 1298A>G, are prevalent in the general population. Recent meta-analyses have disproven an association between the presence of these variants and venous thromboembolism“ Ú American college of medical genetics and genomics (2015) Ú Příklady SNP v kom. NT Úcytochrom P450 – izoforma CYP1A2 ÚEnzym I. fáze biotransformace chemických látek ÚVýznamný pro svůj podíl na metabolismu řady karcinogenních a prokarcinogenních látek, které může CYP1A2 bioaktivovat na genotoxické produkty ÚCYP1A2*1F -163C>A ÚCYP1A2*1F AA – „rychlý“ metabolismus, CC – „pomalý“ metabolismus kofeinu ÚAktivace prokarcinogenů - Polycyklické aromatické uhlovodíky (PAH) obsažené např. v grilovaném mase v kouři ÚDoporučení pro rychlého metabolizátora AA: omezit příjem grilovaného masa a nekouřit J Ú Ú X Příklady SNP v kom. NT ÚAMYLÁZA1 A RIZIKO OBEZITY Ú ÚRozdíl v CNV (šimpanz: 2 kopie, člověk 6 – 16 kopií) ÚČím víc kopií –> tím víc enzymu ve slinách –> lepší trávení škrobu –> zvýšená glykémie - > zvýšený příjem kalorií ÚMnožství a aktivita AMY1 ve slinách – ovlivnění také stresem, hydratace ÚDOPORUČENÍ: regulovat příjem sacharidů v potravě Ú ÚX Ú ÚFalchi et al, 2015 – negativní asociace mezi počtem kopií a BMI (OR pro narůst o jednu kopii 1,19) Ú Genetika obezity Prostředí Geny Monognení (vysoká pentrance) Monogenní (nízká penetrance) Polygenní •Vzácné případy •Syndromy •Populační studie •Epidemiologie • Klinické studie • “omic studie” Například: analýza tukové tkáně Syndromické formy obezity Syndrome Name (reference) Clinical heterogeneity Trans-mission Loci / Genes Prader-Willi Muscular Hypotony Mental retardation Hyperphagia Hypogonadism Short stature Autosomic dominant imprinting 15q11 SRNPN Micro deletion Maternal Disomy Bardet-Biedel Mykytyn Nature Genet 2002 Hypogonadism Pigmentary retinopathy Polydactyly Mental retardation Autosomic recessive BBS (1-12) chaperonin Protein MKKS (Chr 20) Ciliary cells proteins Alström Hearn Nature Genet 2002 Collin Nature Genet 2002 Myocardiopathy Sensory deficit (retinopathy, deafness) Dyslipidemia, diabetes Autosomique recessive 2p14 ALMS1 Börjson-Forssman-Lehman Lower Nature genet 2002 Morbid obesity, epilepsy Hypogonadism, facial dysmorphy Xq26.3 / Plant homeodomain like finger gene •Pleiotropní syndromy: cca 30 syndromů, u nichž obezita představuje konstatní syndromologickou komponentu a jež jsou způsobeny alteracemi známých oblastí Leptin Insulin Ghrelin POMC PC1 PC2 α-MSH β-MSH Arcuate Nucleus Paraventricular Nucleus MC4-R AGRP NPY AGRP LepR LepR IR GHR Tuková tkáň Pancreas Žaludek IR α-MSH β-MSH (?) + + - - + - HYPOTHALAMUS SIM1 BDNF TKRB ? Ventromedial Nucleus Energetická bilance MUTACE Monogenní obezita – vliv na dráhu leptin/melanokortin Mutch & Clement, 2006 Nature, 387, pp 903-908 June 26, 1997 Leptin_protein Leptinová deficience Deletion of a guanine in codon 133 leaves 133 aminoacid codons and a stop codon. The protein is not secreted. Genetika polygenní obezity ÚFamiliární agregace ÚStudie na dvojčatech (větší konkordance výskytu obezity u MZ dvojčat než u DZ) ÚVelké rodinné studie (množství „statistických modelů“ konzistentních s genetickými vlivy Ú Ú Ú Ú Ú Ú Ú Ú Ú Úmultifaktoriální, polygenní Úroli hrají kombinace určitých genů a určitých faktorů zevního prostředí Ú HERITABILITA OBEZITY Rodinné studie 30-50% Adopční studie 10-30% Studie na dvojčatech 50-90% Mutch D & Clement K, Plos Genetics 2006 Nutrition Exercise Viruses Social Status Food Abundance Peer pressure Pollution Technological Progress Psychology Nutrition Exercise Viruses hormones Social Status Food Abundance Peer pressure Pollution Technological Progress Psychology Psychology The GIANT study Locke et al, 2015 •Genetic Investigation of ANthropometric Traits •Locke et, 2015 •Metaanalýza 340,000 jedinců •Identifikace 97 GWS lokusů asociovaných s BMI, z toho 56 lokusů nových !!! • •97 lokusů vysvětluje ~ 2,7% BMI variace •GWAS odhady - běžné polymorfismy mohou odpovídat za více než 20% BMI variace • • •Gen FTO: •0,5 % variace (2 – 3 kg) • • Obezita – kandidátní geny Nutrigenomika Nutrigenomika - definice ÚNutrigenomika – výzkum se zaměřuje na to, jakým způsobem živiny nebo složky stravy obecně mění genovou expresi, koncentrace proteinů a metabolitů a na to, jakým způsobem tyto složky ovlivňují metabolismus, zdravotní stav a riziko onemocnění. Ú Úpůsobení nutrientů na úrovni buňky lze definovat jako takzvané „dietní podpisy“ či „dietní otisky“ (dietary signatures) Ú ÚAlternativně se nutrigenomický výzkum může zaměřit na stanovení interakce jednoho či více genů s živinami a na význam konkrétního genu v patofyziologii sledovaného onemocnění. Ú Ú Ú Ú Nutrigenomika ÚNevýhody: •Potrava – heterogenní směs bioaktivních látek (kontrast s farmakogenomikou – známá koncentrace látky, mechanismus účinku a cílové struktury) •Nutrigenomické studie (vliv určitého typu diety na expresi genů) často pomíjejí vliv genetické variability uvnitř zkoumané kohorty •Nepřesné extrapolace výsledků z in vitro studií Odběr biologického materiálu – odběr periferní krve (mononukleáry), biopsie (např. tenké sřevo, žaludek, srdce), tkáňové kultury • Epigenom, Transkriptom, Proteom, Metabolom Molekulární metody – 2D elektroforéza, qRT-PCR, ELISA, sekvenování, DNA , RNA chip, Western blot, hmotnostní spektrometrie (MS), nukleární magnetická rezonance NUTRIGENOMIKA Metody molekulární biologie 1) Epigenom – metylace DNA ÚStanovení metylace CpG ostrůvků: Ú Ú1) PCR specifická pro detekci methylace –ošetření DNA bisulfitem sodným – přeměna nemetylovaných cytosinů na uracil –Specifické primery pro metylovanou a nemetylovanou část – vznikají fragmenty různé délky – Ú2) HELP assay (angl. „HpaII tiny fragment Enrichment by Ligation-mediated PCR –2 RE HpaII a MspI –Oba štěpí 5‘-CCGG-3‘, ale HpaII ne v případě metylace –množství MspI a HpaII fragmentů vyhodnoceno pomocí čipu – Ú3) Sekvenování –ošetření DNA bisulfitem sodným –sekvenace modifikované DNA – – – Ú Ú Ú Ú Ú Ú 1) Epigenom - methylace Epigenetika ÚEpigenetika = věda o stabilních (reverzibilních) genetických modifikacích, které vedou ke změně exprese a funkce genů beze změny sekvence DNA ÚMethylace DNA, modifikace histonů, miRNA ÚParentální imprinting, inaktivace transpozonů Ú2 vlny demetylací u savců: v zárodečných buňkách a před implantací embrya ÚTranskripce cca 50% mikroRNA regulována metylací CpG ostrůvků Ú1 miRNA = regulace (většinou downregulace) 100 – 200 mRNA ÚZapínání, korigování výkonu či úplné vypínání genů - jsou vrcholem genetického řízení. ÚEpigenetické změny jsou ovlivnitelné, dědičné a v mnoha případech vratné. Ú Ú Ú MikroRNA – mechanismus účinku http://www.nature.com/ncb/journal/v11/n3/images/ncb0309-228-f1.jpg Důležité enzymy zapojené do epigenetických modifikací Epigeneticky aktivní sloučeniny - fytosloučeniny DNMT, DNA methyltransferase; HDAC, histone deacetylase; HAT, histone acetyltransferase gen agouti – myší model ÚEpigenetické modelování v průběhu těhotenství ÚGeneticky identické potomstvo – různý fenotyp ÚDemetylovaný gen -> žlutá barva: potomci náchylnější k obezitě, diabetu a nádorovému bujení ÚPodání stravy ovlivňující metylaci DNA - vitamín B12, kyselina listová, cholin a betain Ú Ú Ú ÚMetylace agouti genu – tmaví hubení potomci se sníženým rizikem výskytu diabetu a rakoviny Ú Ú Ú Sloučenina Potraviny, které je obsahují Epigenetické účinky Methionin Sezam, špenát, ryby, paraořechy, pepř SAM syntéza Kyselina listová Slunečnicová semena, listová zelenina, játra, droždí Syntéza methioninu Vitamin B12 Maso, játra, ryby Syntéza methioninu Vitamin B6 Maso, celozrnné výrobky, zelenina, ořechy Syntéza methioninu SAM-e (s-adenosyl-methionin) Doplněk stravy, v potravinách nestabilní primární dárce methylové skupiny v různých reakcí v těle včetně přenosu na DNA Cholin Žloutky, játra, sója, vařené hovězí maso, kuřecí, telecí a krůtí Dárce methylových skupin SAM Betaine Pšenice, špenát, mořské plody a cukrová řepa Snižujete množství toxických látek prostřednictvím SAM SAM – S-Adenosyl -methionin •koenzym mnoha methylačních enzymů (např. při methylaci bází v DNA nebo methylaci při tvorbě tzv. čepičky mRNA). Epigenetika - karcinogeneze ÚHypermetylace a inaktivace genů zapojených do: –Regulace buněčného cyklu: p16, p53 –DNA opravných mechanismů: BRCA1 (breast cancer 1) MGMT (methylguanin methyltransferase) –angiogeneze: (např. THBS1) – ÚHypometylace a aktivace imprintovaných Ú protonkogenů ÚMicro RNA: let – 7, miR 17, 21, 221 abnormální exprese à karcinogeneze • ÚModifikace histonů: –ztráta metylace a acetylace –H4K20me3 – trimetylace –Pacienti s nízkým hladinami of H3K4ac a vysokými of H3K27me3 – progrese nádoru (Chen et al., 2013) – Ú Ú Ú • http://www.nature.com/nrc/journal/v3/n8/images/nrc1144-f5.jpg MiRNA – antikarcinogenní účinky fytochemikálií Sulforafan, kurkumin, genistein, revestratol... Krakowsky and Tollefsbol, 2015 MiRNA – antikarcinogenní účinky fytochemikálií Krakowsky and Tollefsbol, 2015 2) Transkriptom Ú1. Kvantitativní PCR v realném čase – qRT-PCR –mRNA je nutné přepsat do stabilnější cDNA –Detekce produktu pomocí nespecifických interkalačních barviv (SYBR GREEN) nebo specifických sond (Taqman) –V průběhu PCR tak dochází k uvolňování dalších a dalších molekul fluorescenčního barviva -----> roste fluorescence reakční směsi. –Nárůst fluorescence odpovídá množství produktu, který v reakci vzniká. –Porovnáváme mezi sebou Ct (cycle treshold) – počet cyklů nutných k dosažení určité míry fluorescence –Detekce mRNA, mikroRNA – Transkriptom = kompletní sada mRNA přítomných v daném okamžiku v buňce, nebo tkáni, odráží míru transkripce genů, alt. sestřih a stabilitu transkriptů qRT - PCR 2) Traskriptom Ú2. Expresní DNA microarray, čip –Stanovení stovky – tísice mRNA –Vytvoření DNA čipu –Příprava vzorku –Hybridizace vzorku s čipem –Omytí čipu –Skenování čipu (po excitaci laserem) –Zpracování výsledků – digitální zpracování obrazu – – – Fluorescenční signál Pozice Identita Síla signálu Množství Array, Čip (imobilizovaná sonda) Fluorescenčně značené analyzované NK (mobilní fáze) Hybridizace Transkriptom •Transkripční faktory (TF) jsou proteiny, které se spolupodílejí na iniciaci transkripce •Váží se na jednotlivé elementy promotoru, čímž usnadňují vazbu příslušné RNA-polymerázy. • Prokaryotická RNA-polymeráza ke své činnosti TF nevyžaduje, transkripce u eukaryot je na přítomnosti TF závislá. (Muller and Kersten, 2003). Transkriptom - příklady Úkurkumin Snižuje expresi řady genů, jež potencují zánět se vztahem k rozvoji k např. Alzheimerovy choroby, karcinomu a ischemické choroby srdeční. ÚIndie má nejnižší incidenci Alzheimerovy choroby na světě Bidostupnost, účinnost? Houghton et al, 2015 3) Proteom 1.Western blot (imunoblot) –Detekce specifického proteinu –Rozdělení proteinu na gelu (např. SDS-PAGE) podle velikosti –Přenesení proteinu z gelu na membránu (např. nitrocelulósovou) pomocí el.proudu –Detekce pomocí protilátek –Vizualizace : kolorirmetrický nebo chemiluminiscenční způsob –Semikvantitavní stanovení – – PROTEOM = Kompletní sada bílkovin přítomných v daném okamžiku v buňce, nebo tkáni, zahrnující veškeré jejich modifikace, vzájemné interakce, lokalizaci a metabolický obrat. 3) Proteom Ú2. ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay) –Kvantitativní stanovení proteinů –Interakce protilátka - antigen –Několik modifiakcí – přímá (antigen), nepřímá (protilátka), sendvičová Ú Antigen • detekovaný v testovaném vzorku •známý, komerčně připravovaný Ú Protilátka •detekovaná v testovaném séru •známá, komerčně připravovaná Ú Konjugát •jedná se opět o protilátku proti na kterou je navázaný enzym (konjugovaná enzymem) Ú Substrát •je chemická látka, která reaguje s enzymem a tím změní svou barvu – Ú 3) Proteom 3.2D gelová elektroforéza a hmotnostní spektrometrie –A) Rozdělení podle izoelektrického bodu (pI) v pH gradientu •při pH nižším než pI se protein pohybuje k negativnímu nabitému konci •přii pH vyšším než pI se protein pohybuje k pozitivnímu nabitému konci •Protein se zastaví při pH stejném jako jeho pI –B) Rozdělení podle velikosti v polyakrylamidovém gelu (PAGE) •Aplikace elektrického pole v 90° –C). Zviditelnění •Silver, Coomasie barvení –D) Kvalitativní a kvantitaní výhodnocení •Hmotnostní spektrometrie (MS) •Nukleární magnetická rezonance (NMR) – – Rozdělí stovky – tisíce proteinů 4.Rentgenová krystalografie –Určení 3D struktury proteinů – 3) Proteom Proteomika https://pharmaceuticalintelligence.files.wordpress.com/2014/11/types-of-proteomics-and-their-applic ations-to-biology-mr0120003001.jpg Proteomika - příklad ÚVliv proteinových izolátů ze sóji, kuřecího, vepřového rybího masa na metabolické dráhy v játrech potkana ÚSrovnávací proteomika ÚIdentifikováno 1437 proteinů ÚV porovnání s kaseinem (kontrola) všechny izoláty snižovali množství proteinů podílejících se na metabolismu mastných kyselin a Pparα signální kaskádě ÚIzoláty ze sóji a z ryb zvyšovali zpracování a translaci mRNA ÚStudie prokázala charakteristické účinky proteinových izolátů na metabolismu jater u potkanů Ú Ú Song et al, 2016 Proteomika - příklad ÚAsociace mezi plazmatickými hladinami α-tokoferolu a plazmatickým proteomem u člověka ÚN = 1022 ÚAnalyzováno 54 proteinů ÚPozitivní korelace mezi hladinami α-tokoferolu a koncentracemi apolipoproteinu C-III, fibrinogenu( alpha, beta, gamma řetězce), fibronektinu a fibrinopeptideu A ÚCirkulující hladiny α-tokoferolu pozitivně korelují ze specifickými plazmatickými proteiny --> Nově popsané fyziologické účinky vitamínu E Da Costa et al, 2013 4) Metabolom ÚMetabolom –= kompletní soubor nízkomolekulárních látek, přítomných v buňce či tkáni v daném čase –= soubor meziproduktů a koncových produktů genové exprese a enzymatické aktivity –= Soubor organických (aminokyseliny, mastné kyseliny, sacharidy, organické kyseliny, lipidy, sekundární metabolity) a anorganických látek a elementů Ú1) Extrakce a purifikace metabolitů –Extrakce na pevné fázi (SPE) –Superkritická fluidní extrakce (SFE) –Mikrovlnná extrakce (MAE) Ú2) Derivatizace –Převedení analytu chemickou reakcí na její derivát s požadovanými vlastnostmi –Změna polarity, vnesení chromoforu, fluoroforu Ú3) Analytické metody –Kapalinová, plynná chromatografie, kapilární elektroforéza s hmotnostní nebo UV/VIS spektrometriíí –NMR Ú – – 4) Metabolom Metabolomika Úa) Cílená analýza (target analysis)- substrát nebo produkt jediného enzymu Úb) Určení metabolického profilu (metabolic profiling) – kvantitativní analýza predefinovaných metabolitů Úc) Vlastní metabolomika – analýza „kompletního“ souboru metabolitů buňky, tkáně Ú ÚThe Human Metabolome Database Ú>16,000 endogenních metabolitů, Ú>1500 metabolitů léků Ú>22,000 složek potravy a metabolitů potravy Ú Manach, 2013 Manach, 2013 ÚDěkuji Vám za pozornost