Glykovaný hemoglobin
Ing. Martina Podborská, Ph.D.
OKB FN Brno
Zpracováno s pomocí přednášek RNDr. Petra Breineka
Školní rok 2015/2016
2
Glykovaný hemoglobin (HbA1c)
 http://old.lf3.cuni.cz/diabetologie/Inz_Glykace.htm Hemoglobin [http://sweet-about-
me.webnode.cz]
 HbA1c je základní vyšetření pro dlouhodobé sledování
diabetu mellitu
3
HbA1c – klinický význam
 rutinní a efektivní nástroj sledování průběhu DM (diabetu)
 HbA1c ukazatel dlouhodobé průměrné koncentrace glukózy v
krvi (období cca 6-8 týdnů nazpět) umožňuje posoudit
dlouhodobou kompenzaci diabetu
 diagnostické kritérium DM
 kontrola terapie
 včasné odhalení hrozících komplikací
 hodnocení vyšetření:
Hodnota HbA1c Interpretace výsledků
< 4,5 % Dobrá kompenzace diabetu
4,5 – 5,3 % Uspokojivá kompenzace diabetu
˃ 5,3 % Neuspokojivá kompenzace diabetu
4
Glykace
 Glukóza je aktivní molekula – účastní se glykačních a
autooxidačních reakcí vznik reaktivních látek
zvyšujících oxidační stres, které zasahují do mechanismů
zánětlivé reakce
 Glykace bílkovin je založena na chemické vazbě glukózy na
N-koncové aminokyseliny bílkovin:
 aldehydická skupina glukózy reaguje s volnou
aminoskupinou proteinů bez enzymové katalýzy za
vzniku glykovaného proteinu
5
Glykace
 HbA1c („dlouhý cukr“) je látka, která vzniká v organismu
neenzymatickou reakcí tzv. glykací mezi hemoglobinem
(červené krevní barvivo) a glukózou (krevním cukrem)
 GLYKACE: je neenzymové navázání (adice) cukru na proteiny za
vzniku fruktosaminu
 faktory ovlivňující neenzymovou glykaci proteinů:
 koncentrace sacharidů a proteinů a jejich kolísání
(koncentrace proteinů v krvi je relativně konstantní,
rychlost glykace je úměrná koncentraci sacharidů)
 doba expozice
 biologický poločas daného proteinu
 teplota
6
Glykace hemoglobinu
 rychlá tvorba labilní Schiffovy báze (aldimin)
 pomalý Amadoriho přesmyk za vzniku stabilního ketoaminu
(ireversibilní)
 koncentrace závisí na koncentraci glukózy a poločasu života
erytrocytů
7
HbA1c – glykace
 Zdroj: přednáška „HbA1c“ RNDr. Petra Breineka
 HbA1c vzniká glykací na N-konci b-řetězce hemoglobinu
8
Hemoglobin
 Složená bílkovina – hemoprotein:
 bílkovina – globin
 hem
 Illustration copyright 2000 by Nucleus Communications, Inc.
All rights reserved. http://www.nucleusinc.com
 https://fmss12ucheme.wordpress.com/2013/05/06/hemoglobin/
 hlavní fce: je to transportní molekula plynů a tvoří 95 % objemu
erytrocytů
9
Hemoglobiny
 Zdroj: přednáška „HbA1c“ RNDr. Petra Breineka
10
Výhody stanovení HbA1c vs. glykémie
 není třeba konzervovat krev (větší stabilita)
 menší intraindividuální variabilita (CV<2%)
 HbA1c není ovlivněn krátkodobou glykémií
 nemocný nemusí být lačný
 využití pro diagnostiku i kontrolu léčby
11
Vyjadřování výsledků HbA1c
 není třeba konzervovat krev (větší stabilita)
 od 1.1. 2012: mmol/mol (např.45 mmol HbA1c/mol Hb)
 (%) DCCT (převážně v USA) (Diabetes Control and
Complication Trial)
 2010, konsensus ADA, IFCC, IFD, EASD, ISPAP
12
Rozhodovací meze HbA1c
Referenční interval 20 – 42 mmol/mol
Rozhodovací meze
Kompenzovaný diabetes
(dospělí, negravidní)
43 – 60 mmol/mol
 Preanalytické požadavky:
 Analyzovaný materiál: B – odběr do EDTA
 stabilita: 2d (+20 až +25°C); 1 týden (+4 až +8°C); 1rok (<-20°C lépe
při -80°C)
 Poznámky:
 snížená hodnota doby života erytrocytů
 hemoglobinopatie, karbamylace (uremičtí pacienti) – ovlivnění
koncentrace HbA1c v rutinních metodách
13
Požadavky na analytickou kvalitu měření
Mezilehlá preciznost CV < 1,0 %
Pravdivost (Bias) B < 1,5 %
Celková chyba TE < 6,9 %
Metrologická návaznost referenční metoda LC-ESI/MS
Intraindividuální biologická
variabilita
1,9
Preciznost odvozená
z biologických variabilit
1,0
Interindividuální biologická
variabilita
5,7
Pravdivost odvozená z
biologických variabilit
1,5
Celková biologická variabilita
Celková chyba odvozená
z biologických variabilit
3,1
 www.westgard.cz
 Doporučení ČDS a ČSKB; vydáno v únoru 2012, aktuální korekce 18.2.2015
14
Nejistota výsledků měření
 na základě kombinace dílčích nejistot odpovídajících
preciznosti, hodnotě bias a hodnotě Cvi lze odhadnout
výslednou kombinovanou nejistotu výsledků měření
(Uc) 6 až 9% (95% interval spolehlivosti)
15
HbA1c – metody stanovení
1. Referenční metody:
 izolace a hemolýza erytrocytů (+ odstranění labilních pre-HbA1c)
 enzymové štěpení hemoglobinu (endoproteináza Glu-C)
 analytické měření (detekce glykovaných hexapeptidů)
a) LC/ESI/MS:
Glykovaný hemoglobin (HbA1c) je ze směsi peptidů separován, detekován,
identifikován hmotnostní spektrometrií a kvantifikován na podkladě rozdílných
hodnot m/z. Z poměru hodnot m/z analyzovaných vzorků a kalibrátorů se vypočítá
hodnota HbA1c.
a) CE/ESI/MS:
První separace se provede pomocí HPLC, jednotlivé frakce se sbírají, následuje další
separace této směsi pomocí CE. Glykovaný a neglykovaný hexapeptid jsou
odděleny na základě různých elektromigračních časů a kvantifikovány
spektrofotometrickým detektorem.
16
HbA1c – metody stanovení
2. Doporučené rutinní metody - chromatografické:
a) Afinitní chromatografie (aminofenylboronátová):
 založena na interakci glykovaného hemoglobinu s imobilizovaným
boronátovým aniontem
 po eluci neglykovaných frakcí hemoglobinu, dojde k uvolnění vazby a po eluci
se stanoví hemoglobinové frakce detektorem, který měří absorbance při
415 nm
 koncentrace HbA1c se zjistí z velikosti plochy příslušného píku na
chromatogramu
 Princip boronátové
chromatografie
17
HbA1c – metody stanovení
2. Doporučené rutinní metody - chromatografické:
b) Kapalinová chromatografie s výměnou iontů (IEC)
 separace hemoglobinů a jeho složek na slabě kyselých ionexech
 jednotlivé frakce hemoglobinu jsou rozděleny podle jejich různých fyzikálněchemických
vlastností (velikost náboje) v měnícím se prostředí (změna
koncentrace iontů, změna pH)
 frakce se po rozdělení detekují v mobilní fázi detektorem, který měří
absorbance při 415 nm
 koncentrace HbA1c se zjistí z velikosti plochy příslušného píku na
chromatogramu podle kalibrační křivky pomocí softwaru chromatografu
c) HPLC (Vysokoúčinná
kapalinová chromatografie)
18
HbA1c – metody stanovení
 HPLC
19
HbA1c – metody stanovení
 HPLC
20
HbA1c – metody stanovení
 HPLC
21
HbA1c – metody stanovení
2. Doporučené rutinní metody - imunoanalytické:
 založeny na vazbě protilátek proti b N-terminálně glykované tetrapeptidové nebo
hexapeptidové skupině
 Imunoturbudimetrie, imunonefelometrie:
 nejčastěji se používá stanovení TINIA
 k analyzovanému vzorku (lyzovaná krev) se přidá specifická protilátka proti
HbA1c; nenavázaná (přebytek) protilátka se stanoví po reakci
s polyhaptenovým činidlem za vzniku nerozpustného komplexu
 rychlost reakce se stanoví turbidimetricky většinou při 340 nm a je nepřímo
úměrná koncentraci HbA1c v analyzovaném vzorku
HbA1c + antiHbA1c komplex HbA1c-antiHbA1c
antiHbA1c (přebytek) + polyhapten komplex anti-polyhapten
 CMIA
22
HbA1c – metody stanovení
2. Doporučené rutinní metody - imunoanalytické:
 CMIA: např. Abbott Architect i2000 SR
 hemolýza erytrocytů, uvolnění HbA1c
 inkubace s magnetickými mikročásticemi, navázání antigenu (HbA1c)
 promytí, odstranění nenavázaného antigenu
 přidání Anti-HbA1c mab (konjugát) značený akridiniem
 vazba konjugátu na mikročástice
 promytí, odstranění nenavázaného konjugátu
 chemiluminiscence (po změně pH a přidání peroxidu)
23
HbA1c – metody stanovení
2. Doporučené rutinní metody - elektroforetické:
 elektroforéza v agarózovém gelu (ELFO)
 kapilární elektroforéza (HPCE)
 izoelektrická fokusace (IEF)
24
Co může ovlivnit hodnocení vyšetření HbA1c
 doba života erytrocytů (120 ± 10 d) !
 přítomnost vzácnějších typů hemoglobinu (1165 variant
Hb, např. HbS, HbC, HbE, HbD)
 hemolýza, ikterus
 těžké krvácení
 věk, rasa, terapie,…