Speciální hematologická vyšetření Bourková L., OKH FN Brno Vyšetřování anémií Vznik anemie •Anemie je soubor příznaků, při kterém je v krvi: –snížený počet erytrocytů (ERY) a množství hemoglobinu (HGB), –je spojená s poruchou tvorby erytrocytů nebo zánikem či ztrátou erytrocytů •Normálně na pokles hladiny kyslíku v organismu reagují ledviny zvýšenou produkcí hormonu erytropoetinu (EPO). •EPO se přenáší krví do kostní dřeně, kde je vydán signál ke zvýšené produkci ERY a stav se kompenzuje. •V určitých případech, zejména u nádorových onemocnění nebo u chronických zánětlivých procesů je ale tento proces nedostačující a vzniká anemie. Sledování vyšetření •Hodnotit: Øhloubku anémie v KO üpočetní změny WBC i PLT Ømorfologické změny erytrocytů v periferní krvi (barevné, tvarové, inkluze) ümorfologické změny WBC i PLT v celém nátěru Ømorfologické a množstevní změny erytrocytární populace v KD ümorfologické změny i leukocytární populace a MGK Økomplexně výsledek celého KO a nález v KD: může se jednat o první příznaky nádorového onemocnění Øsouvislost se speciálními vyšetřeními Vyšetření retikulocytů Øretikulocyty üpřítomné RNA → schopnost tvorby HGB (analýza HGB v Retic) üodráží schopnost KD produkovat RBC üběhem 1 – 2 dnů dospívá Retic ve zralý erytrocyt ü↑ počet Retic → aktivace KD (zvyšování IRF) ü↓ počet Retic → útlum KD (snižování IRF) Ømikroskopicky üsupravitální barvení RNA v buněčných organelách (ribozomy, endoplazmatické retikulum) Øanalyzátorem üanalýza prošlého a odraženého světla: probíhá na precipitovaných síťových strukturách RNA üanalýza fluorescence: vlákna RNA jsou obarvena fluorescenčními barvami Cytochemické vyšetření zásobního železa ØZásobní železo Fe3+: feritin, hemosiderin ØPrincip vyšetření: (Fe3+) + ferrokyanid draselným - K4[Fe(CN)6] + HCl → barevný komplex = berlínská (pruská) modř - Fe4[Fe(CN)6]3 ØHodnocení: üve 100 NRBC üzelenomodrá granula v: oerytrocytech (siderocyty), NRBC (sideroblasty), NRBC okolo 2/3 jádra (prstenčité sideroblasty), makrofázích (siderofágy), extracelulárně ØNormální hodnoty: 20 – 60 % pozitivních NRBC 4 siderofágy ØKlinický význam: üsnížení hodnoty: osideropenické anémie Øzvýšené hodnoty: osideroblastické (přítomné prstenčité sideroblasty) ohemolytické anémie, megaloblastové anémie oMDS, leukémie • Fe-makrofágy Základní vyšetření pro hemolytické anémie ØObecné testy: üvolný hemoglobin v plazmě (základní metodika pro vyšetřování intravaskulární hemolýzy) üosmotická rezistence ütest autohemolýzy ühemosiderin v moči ØTesty na průkaz abnormálních hemoglobinů ühemoglobin F ühemoglobin A2 üelektroforéza hemoglobinu ØTesty na průkaz nedostatku enzymů üHeinzova tělíska üglukózo-6-fosfátdehydrogenáza üpyruvátkináza Obecné testy Østanovení volného HGB v plazmě üPrincip - spektrofotometricky: oxidace HGB (Fe2+) → methemoglobin (Fe3+) + KCN → barevný komplex - hemiglobinkyanid. Øvyšetření osmotické rezistence üPrincip - makroskopicky: stanovení odolnosti RBC v různě koncentrovaných hypotonických roztocích NaCl (fyziologického r.). • • Ø Øtest autohemolýzy üPrincip - spektrofotometricky: sledování hemolýzy RBC v prostředí: o fyziologického roztoku ofyziologického roztoku s glukózou ofyziologického roztoku s ATP. Øvyšetření hemosiderinu v moči üPrincip - mikrosopicky: Fe3+ v hemosiderinu + HCl + K4[Fe(CN)6] →krystalky - berlínská (pruská) modř - Fe4[Fe(CN)6]3 • osmot-rez2 normál patologie hemosiderin v moči Testy na průkaz abnormálních hemoglobinů Øhemoglobin F üPrincip - mikroskopicky: Inkubace nafixovaných preparátů v kyselém prostředí (pH 3,3). HGB A je z erytrocytů vyplaven. HGB F je vůči prostředí rezistentní, v erytrocytech zůstává. üHodnocení – [%] : novorozenci (50-90%), věk<2 roky (0-4%), věk>2 roky (0-4%) Øhemoglobin A2 üPrincip - chromatograficky: Na pozitivně nabité částice pryskyřice se se naváží negativně nabité části HGB, jednotlivé frakce HGB se vymývají pufrem, 1. frakce je s HGB A2, 2. frakce je s HGB S. üHodnocení: Podíly jednotlivých frakcí HGB se stanovují spektrofotometricky. Ø Ø Ø Ø Ø Øelektroforéza hemoglobinu üPrincip: V elektrickém poli a zásaditém prostředí se hemoglobiny pohybují různě rychle, na základě velikosti negativního náboje globinového řetězce, v závislosti na přítomných aminokyselinách. Negativně nabité molekuly HGB se pohybují k anodě (+). • postupná eluce frakcí HGB-F https://publi.cz/books/141/images/pics/Image_002.jpg Testy na průkaz nedostatku enzymů ØHeinzova tělíska üPrincip - mikroskopicky: Heinzova tělíska znázorňují vysrážený hemoglobin v případě, že glykolytické enzymy erytrocytů nejsou schopny zabránit oxidaci hemoglobinové molekuly. Precipitáty se jeví jako oválná tělíska v erytrocytech. Objevují se těsně u buněčné membrány, ke které přiléhají, barví se supravitálně brillantcresylovou modří přímo nebo po inkubaci s acetylfenylhydrazinem. • • • • • • Ø Øglukózo-6-fosfát dehydrogenáza (G-6-PDH) üPrincip - spektrofotometricky: Kinetické měření aktivity enzymu v UV oblasti. G-6PDH se podílí na redukci NADP+ na NADPH (nikotinamid adenin dinukleotid fosfát), nárust NADPH je přímo úměrná aktivitě G-6-PDH. Øpyruvátkináza üPrincip - spektrofotometricky: Kinetické měření aktivity enzymu v UV oblasti. V přítomnosti pyruvátkinázy dochází při katalytické reakci ke spotřebě NADPH, jejíž pokles je nepřímo úměrné aktivitě pyruvátkinázy. Heinz1 https://encrypted-tbn1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcSwLUe-0sJuTpGXNDY3YCe7goFUaGyFIuUW2ph4UMtGZi5 gtXdK8w Retic Heinz. těl. v ery Cytomorfologická vyšetření krevních buněk v souvislocti s onkologickou hematologií Sledování vyšetření •Hodnotit: Øcelý krevní obraz üpočetní změny WBC, RBC, PLT, přístrojová hlášení Ømorfologické změny v periferní krvi üWBC spolu s diferenciálním rozpočtem, RBC, PLT Ømorfologické a množstevní změny v kostní dřeni üu leukocytární, erytrocytární a trombocytární populace, včetně MGK Øcytochemická vyšetření • vpočet blastů pro diagnostiku akutní leukémie: §dle WHO klasifikace > 20% Příklady morfologických abnormalit u akutních lymfoblastických leukémií •Dělení dle FAB klasifikace ØALL – L1 ümorfologické nálezy: omenší blastické buňky ovysoký N/C (nukleo-cytoplazmatický) poměr ojemnější chromatin onejasná jadérka Ø ØALL – L2 ümorfologické nálezy: o větší, často polymorfní blastické buňky obohatší cytoplazma ojasná jadérka Ø ØALL – L3 ümorfologické nálezy: ovelké buňky obazofilní cytoplazma ovakuolizace (Burkittův lymfom) Ø • ALL1_KD ALL2_KD ALL3_KD Příklady morfologických abnormalit u akutních myeloblastických leukémií •Dělení dle FAB klasifikace ØAML – M0 ümorfologické nálezy: oAML s minimálními znaky myeloidní diferenciace oagranulární blasty o o ØAML – M1 ümorfologické nálezy: oAML bez vyzrávání o blasty > 90% z nonerytroidní řady oAuerovy tyče o o ØAML – M2 ümorfologické nálezy: oAML s vyzráváním oblasty 20 – 90 % z nonerytroidní řady opodíl monoctárních buňěk <20% oAuerovy tyče Ø • AML0_4 AML1_5 AML1_2 AML2_4 Příklady morfologických abnormalit u akutních myeloblastických leukémií •Dělení dle FAB klasifikace ØAML – M3 ümorfologické nálezy: oAML - promyelocytární odo nádorové populace buněk zahrnovány blasty i abnormální promyelocyty otyp M3 – hypergranulární Auerovy tyče, snopce Auerových tyčí otyp M3 – variantní dvoulaločnatá, mnoholaločnatá jádra až agranulace cytoplazmy, oválné inkluze, Auerovy tyče ØAML – M4 ümorfologické nálezy: oAML - myelomonoctární ovětšina blastů z nonerytroidní řady opodíl monoctárních buněk > 20% ov KO bývá monocytóza o ØAML – M5 ümorfologické nálezy: oAML - monocytární otyp M5A monoblasty, méně granulace, vakuolizace otyp M5B více promonocytů, monocytů opodíl monocytární populace > 80% Ø • AML3_2 AML3V_1 AML4_3 AML5_2 AML5b_1 M5A M5B Příklady morfologických abnormalit u akutních myeloblastických leukémií •Dělení dle FAB klasifikace ØAML – M6 ümorfologické nálezy: oerytroleukémie oerytroblasty (proerytroblasty + NRBC) > 50% ze všech jaderných buněk oostatní blasty i z nonerytroidních buněk odysplázie v erytrocytární řadě (členitá jádra, karyorexe, vícejaderné NRBC, vakuolizace, megaloblasty o o o o o Ø ØAML – M7 ümorfologické nálezy: omegakaryocytární leukémie o blasty většinou megakaryoblasty odysplatické změny MGK o • • AML6_4 AML6_6 AML7_1 Příklady morfologických abnormalit u lymfoproliferativních onemocnění Øzákladní nálezy ü změny v počtu WBC (snížení, normální počet, zvýšení – dle typu onemocněí až nad 100x109/l i přes 500x109/l) ülymfoctóza üreaktivní LY, atypické LY (atypie jádra a cytoplazmy), mladší lymfocyty, holá jádra (jaderné/Gumprechtovy stíny) Ømorfologické abnormality • C:\Users\3840\Documents\Cíl-Databáze-10-12\F5\8403645649_107.jpg lymfocyt reak reaktivní LY CLL jaderné stíny PLL proly auto0 HCL splenický lymfom vilózní LY zářezy v jádře vysoký N/C poměr auto0 folikular lymfom BNH1 členitá jádra C:\Users\3840\Documents\Cíl-Databáze-10-12\F5\8403645649_025.jpg LGL lymfocyt myelom D - Příklady morfologických abnormalit u myeloproliferativních onemocnění Øzákladní nálezy ü zvýšený počet WBC ( často až 100x i více), zvýšený počet PLT (možný extrémní počet až k 1000x109/l) ümožné morfologické nálezy v návaznosti na typ onemocnění: oneutrofilie a mladší vývojová stádia (myelocyty, metamyelocyty), bazofilie, může být eozinofilie, možná přítomnost různého podílu blastů, v KD hyperplazii granulocytárních řad oNRBC v periferní krvi, sledovat morfologické odchylky RBC (slzičkovité RBC) opatologická morfologie PLT, i gigantické PLT, v KD zmnožené dysplatické MGK, holá jádra MGK v periferii Ømorfologické abnormality • CML-myeloidní-1 ↑WBC ba-sg6 http://www.pathologystudent.com/wp-content/uploads/2013/02/Krafts11_1.jpg https://encrypted-tbn2.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcSIuuM66ofOmgFOhvWe5VpfAHmmE5jcC3wGjc5JplvxyJd ZVTpq4g C:\Users\3840\Documents\Cíl-Databáze-A-10-12\MP10PolycytMGK\7MGK.jpg Obrázek12 BASO CEL holé jádro MGK ET ET MF Laboratorní nálezy u myelodysplastického syndromu Øzákladní nálezy v periferní krvi üerytrocyty: anémie, ↑RDW, polychromázie, poikilocytóza, inkluze v RBC, dysplázie NRBC, ↓RETIC üleukocyty: obvykle ↓NE, hypo/hyper(>5segmentů) - segmentace NE, pseudo-Pelgerova-Huëtova anomálie, hypo/hyper/nerovnoměrná-granulace NE, vakuolizace NE, evt. přetrvávající bazofílie cytoplazmy NE, abnormální mono/promonocyty ütrombocyty: většinou ↓PLT, ↑PDW, makro PLT, hypogranulární PLT, fragmenty cytoplazmy MGK, mikro MGK, jádra MGK Øzákladní nálezy v kostní dřeni üdyserytropoéza: podobné dysplatické změny jako v PK, dále: ojádro: mezijaderné můstky, karyorexe, vícejadernost, megaloidní rysy, zneokrouhlení jádra ocytoplazma: vakuolizace, nerovnoměrná barvitelnost üdysgranulopoéza: podobné dysplatické změny jako v PK, dále: oasynchronie vyzrávání jádra a cytoplazmy, Auerovy tyče, pseudo-Chediakova-Higashiho granula üdysmegakaryopoéza: omikro/obrovské MGK, hypo/hyper - lobularizace MGK, vícejaderné MGK, vakuolozace, hypogranulace MGK vSledovat: §charakter dysplazie pro rozlišení typu MDS §počet blastů v PK a KD §cytopenie v KO (bez dysplastických změn by neměla být návaznost na diagnostiku MDS) v Ø • Příklady morfologických abnormalit u myelodysplastického syndromu • • MDS_hypersg1 MDS_hypogr1 MDS_hyposg MDS_hypogr heterozygot homozygot MDS_mgk3 MDS_mgk8 MDS_NRBC2 MDS_mitóza MDS_mgk6 retikulární b MDS_15-hypersegmNE homozygot hypersegmentace hyposegmentace hypogranulace dysplázie NRBC mitóza NRBC pseudo- Chediakova-Higashiho granula Auerovy. tyče makrofág dysplatický MGK dysplatický MGK dysplatický MGK hyposegmentace hypogranulace hyposegmentace hypogranulace blast hyposegmentace dysplázie NE substrát ↓ inkubační roztok + enzym (glykogen, lipidy) ↓ buňka è obarvené precipitáty ↓ v místech přítomnosti enzymu (substance) v buňce Cytochemická vyšetření hodnocení -mikroskopicky: negativní (0) až počet (+) intenzita zbarvení je úměrná množství enzymu (glykogenu, lipidů) http://mmp.vfu.cz/opvk2014/foto_video/foto-mikroskopicka_technika/13.jpg fixace nátěru Cytocemická barvení: Øneutrofilní alkalická fosfatáza Ømyeloeroxidáza Øchloracetátesteráza Øsudanovou černí ØPAS (Periodic Acid – Schiff) Ønespecifická esteráza (s blokádou fluoridem sodným) Økyslá fosfatáza (s rezistencí na kyselinu L-vinnou) Cytochemická vyšetření Øneutrifilní alkalická fosfatáza ühodnocení: v periferní krvi, neutrofilní tyče a segmenty üklinický význam: ↓ALP u chronické myeloidní leukémie, ↑ALP u chronické neutrofilní leukémie Ø Ø Ø Ømyeloperoxidáza ühodnocení: v primární granulaci NE, EO, MO (množství enzymu se zvyšuje s vyzráváním buněk), lymfocyty jsou vždy negativní, sledování přítomnosti Auerových tyčí üklinický význam: rozlišení myeloblastické nebo monoblastické leukémie od lymfoblastické Ø Ø Ø ØPAS ühodnocení: typ pozitivity (difúzní, jemně nebo hrubě pozitivní granula) ofyziologická: myel.buňky (difúzní), monocytárníbuňky (jemná granula), lymfocyty (mohou být výraznější granula), NRBC (negativní) opatologická: LY u CLL (většinou výrazná granulární pozitivita), lymfoblasty u ALL (většinou pozitivní), NRBC hrubozrná pozitivita üklinický význam: leukémie, MDS, anémie ALP-2+ ALP-3+ 2+ 3+ PAS-difus,granul,MGK,seg PAS 1-bloková poz PAS-AMLM6 N:\OKH\Dokumenty\Bakaláři\Bakaláři - cytochemické barvení\cytochemické barvení\MPOX\AML M2\MPOX _ 1 (Auerovy tyče).tif POX-2LYneg Cytochemická vyšetření Ønespecifická esteráza s blokádou fluoridem sodným üprincip: enzym reaguje se substrátem nebo je reakce blokována NaF (současné barvení dvou nátěrů) ühodnocení: opo inkubace bez blokády: myeloidní buňky a lymfocyty pozitivní (0/+), monocyty (+/+++) opo inkubaci s NaF: pozitivita u myeloidních buněk a lymfocytů stejná nebo jen lehce zeslabená, u monocytů zeslabení (0/+) üklinický význam: k průkazu AML M4 a AML M5 Ø Ø Ø Ø Økyselá fosfatáza s rezistencí na kyselinu L-vinnou üprincip: enzym reaguje se substrátem nebo je reakce blokována kyselinou L-vinnou, pokud je v buňce přítomen isoenzym -5, potom je reakce na kyselinu L-vinnou rezistentní (současné barvení dvou nátěrů) ühodnocení: opo inkubace bez blokády: granulocyty, monocyty, lymfpcyty pozitivní na (0/+) opo inkubaci s kyselinou L-vinnou: pozitivita zůstává pouze v lymfocytech s izoenzymem-5 üklinický význam: pozitivita v lymfocytech po inkubaci s kyselinou L-vinnou slouží k diagnostice klasické formy HCL • KF-HCL2 KF-HCL HCL NE-mono+++,gran+ Esterase2-nespec s NaF po blokádě NaF po blokádě k. L-vinnou před blokádou před blokádou