ÚVOD DO HISTOLOGICKÉ TECHNIKY A ZPRACOVÁNÍ VZORKŮ
PRO SVĚTELNOU A ELEKTRONOVOU MIKROSKOPII
ÚHE LF MU, 2016
Histologie
• Rozlišovací schopnost oka – ~ 0,1 mm
• Rozlišovací schopnost SM – ~ 0,5 m (běžně)
• Rozlišovací schopnost EM – ~ 1,5 nm
Zpracování tkání a orgánů pro účely histologického vyšetření ve
světelném mikroskopu
(příprava trvalého histologického preparátu)
• ODBĚR vzorků
• FIXACE tkáňových bločků
• PRANÍ
• ZALÉVÁNÍ - (parafinové) bločky
• KRÁJENÍ - řezy
• NAPÍNÁNÍ A LEPENÍ řezů
• BARVENÍ řezů
• MONTOVÁNÍ (uzavírání)
ODBĚR MATERIÁLU
• malý kousek tkáně (orgánu) je odebrán a rychle vložen do fixačního media:
• biopsie z živého organizmu (v průběhu chirurgických zákroků; neinvazivní odběr –
stěr z povrchu sliznice)
= excise (vyříznutí)
= punkce (dutou jehlou – jaterní nebo ledvinný parenchym, kostní dřeň)
= kyretáž (např. endometrium)
• nekropsie z mrtvého organizmu (pitva); laboratorní zvíře
• velikost odebraného vzorku 5 – 10 mm3, fixace následuje bezprostředně!
• označení
FIXACE
• Definice: denaturace a stabilizace proteinů v buňce
(„šetrné usmrcení buňky“ s minimem artefaktů)
• Důvod fixace: chemická nestabilita tkáně – vysoušení, svraštění, autolýza
v důsledku působení bakterií, hypoxie;
• fixace má předcházet těmto změnám a stabilizovat strukturu vzorku. Během
fixace jsou proteiny konvertovány do inaktivní, denaturované formy.
Fixace
– fyzikální vysokou teplotou (var, žíhání nad plamenem), nízkou teplotou
(lyofilizace, mrazová substituce – kryoprezervační látky)
– chemická
Roztoky organických a anorganických látek
• imerze – ponoření do fixativa
• perfuze – promývání intravenózní aplikací fixativa
Požadavky na fixační činidlo
• zachovat strukturu
• rychle penetrovat do tkáňového bločku
• neovlivňovat výsledek barvení
CHEMICKÁ FIXACE
Fixační činidla:
organická
– ALDEHYDY
– formaldehyd (LM)
– glutaraldehyd (EM)
– ALKOHOL – 96 – 100 % Ethanol
– ORGANICKÉ kyseliny – led. octová, pikrová, trichloroctová
anorganická
– ANORGANICKÉ KYSELINY - kys. chromová, oxid osmičelý (OsO4)
– SOLI TĚŽKÝCH KOVů – HgCl2
směsi:
FLEMMING (OsO4), ZENKER, HELLY, SUSA (HgCl2), BOUIN (kys. pikrová), CARNOY (alkohol)
Postup: fixace – při pokojové teplotě, 12 – 24 hodin, vzorek musí být přelit 20 – 50násobným množstvím fixačního
činidla: (1 cm3 : 20 – 50 cm3)
PRANÍ a ZALÉVÁNÍ
• odstranění fixačního činidla ze vzorku; výběr vypíracího media závisí
na fixaci: voda nebo alkohol (70-80%)
• důvod zalévání: „tvrzení“ měkkých tkáňových vzorků krájitelnými
médii
Zalévací média
• ve vodě rozpustná – želatina, celodal, vosky
• ve vodě nerozpustná – parafin, paraplast, celoidin
Zalévání do parafinu
• dehydratace – odvodnění fixovaných vzorků (parafin se s vodou
nemísí; vzestupnou řadou etanolu (50%, 70%, 90%, 96% každá
lázeň alkoholu 2 – 6 hodin)
• projasnění – vytěsnění alkoholu mediem, které se mísí s
parafinem – benzen nebo xylen
• infiltrace – rozpuštěným parafínem (bod tání 56C); provádí se v
TERMOSTATU: parafinová lázeň – 3 x 6 hodin.
• vlastní zalití – do komůrek (plastové, papírové nebo kovové). Do
komůrek se nalije rozpuštěný parafín a do něj se vloží tkáňové
vzorky. Komůrky jsou rychle ochlazeny ponořením do studené
vody. Parafinové bločky se po vynětí z komůrek zbaví přebytku
parafínu a jsou připraveny ke krájení.
odvodňovací tkáňový automat
Leica TP 1020
Zalévací komůrky - papírové
- kovové s orientačními plastovými prstenci
výsledek zalití
KRÁJENÍ
• Mikrotom – regulace tloušťky řezů: 5 – 10 μm je optimum
Sáňový mikrotom – blok je
upevněný v držáku, nůž nebo
břitva se pohybuje
horizontálně
Rotační mikrotom – nůž je fixní,
držák s bločkem se pohybuje
vertikálně
Rotační mikrotomSáňový mikrotom
kryostat
= rotační mikrotom v mrazicím boxu (–15-60º C)
zmrzlou tkáň lze krájet bez zalévání
NAPÍNÁNÍ ŘEZŮ
• Napínání:
na hladině teplé vody (45ºC) se
řezy narovnají a vypnou
• Lepení:
z vody jsou řezy přeneseny
na podložní skla s adhezivním
filmem (želatina nebo směs
glycerin-bílek) a uloženy do
termostatu (37º C).
Před barvením se z řezu na skle musí odstranit zalévací medium, které by bránilo průniku barviv
Např. parafin – deparafinace rozpustidlem parafinu, obvykle xylénem.
1 2 3
4 5
7 8
1 – odběr
2, 3 – fixace
4 – zalévání
5, 6 – krájení
7, 8 – napínání řezů
4
6
BARVENÍ
• zviditelnění struktur v řezu – buňka a její součásti vykazují afinitu
k barvivům dvou skupin:
• zásaditá /bazická/ barviva („jaderná“) – reagují s kyselými
strukturami buňky a tkání (NK v jádře aj.)
bazofilie – bazofilní struktury
• kyselá barviva („cytoplazmatická“) – reakce se zásaditými
strukturami
acidofilie – acidofilní struktury v buňce
- chromofilní /chromatofilní/ x chromofobní
- polychromatofilní – afinita k oběma druhům barviv
Hematoxylin a eosin (HE)
cytoplazma
jádra
kolagenní vazivo
• ORTOCHROMAZIE- bunečné struktury sa barví stejnou barvou, jakou má barvivo
(HE)
• METACHROMAZIE- bunečné struktury sa barví jinou barvou, jakou má barvivo
Př. toluidinovou modří se v žírných buňkách barví jádra modře (ortochromaticky) a
granula červenofialově (metachromaticky)
xylen I xylen II 100% 96% H2O hematoxylin kyselý
etanol etanol etanol
xylen IV xylen III 100% 96% H2O eosin H2O
etanol etanol
HEMATOXYLIN – EOSIN (HE)
deparafinace rehydratace praní barvení diferenciace
projasnění dehdyratace praní barvení praní
Hematoxylin – zasaditý
Eosin – kyselý
• Postup:
• Odstranění parafinu xylenem
• Rehydratace „sestupnou“ řadou alkoholů (100% 96% 80%)
• Barvení hematoxylinem  jádra - modro-fialová
• Diferenciace kys. alkoholem a vodou (odstranění přebytku
barviva)
• Barvení eosinem  růžová - cytoplazma, vazivo, svaly
• Praní ve vodě (odstranění přebytku barviva)
• Dehydratace „vzestupnou“ řadou alkoholů (80% 96%)
• Projasnění v xylenu
RUTINNÍ BARVENÍ: HEMATOXYLIN – EOSIN (HE)
≈
řada boxů (kyvet) s barvicími médii
• Leica ST 4040 Lineární barvící automat - velkokapacitní barvení vzorků
jedním programem (např. H&E až 1000 skel).
MONTOVÁNÍ
• uzavření preparátu – kapkou montovacího media a
krycím sklíčkem  trvalý preparát
• rozpustná v xylenu – kanadský balzám
• rozpustná ve vodě – glycerin-želatina, arabská guma
trvalé histologické preparáty ke studiu v SM
TYPY BARVENÍ
• rutinní, přehledná – HE, AZAN (demonstrují všechny zákl. složky)
• speciální – vizualizace vybraných struktur
• Massonovy trichromy: žlutý - HEŠ, modrý - AZAN, zelený trichrom
(kolag.vlákna)
• orcein, aldehydový fuchsin (elast.vlákna) aj.
• impregnační – AgNO3 (nervová nebo retikulární vlákna)
Barvicí metody:
přehledné – HE, AZAN
demonstrují všechny složky tkání
speciální
zdůrazňují určité buněčné nebo tkáňové složky
impregnační
soli Ag, Au nebo Os
HE – nejpoužívanější barvení
Výsledky barvení:
• HE = Hematoxylin – Eosin
jádra – modro-fialová
cytoplazma a kolagenní vlákna – růžová
svalová tkáň – červená
HEŠ = Hematoxylin – Eosin – Šafrán
kolagenní vlákna – žlutá
AZAN = AZokarmín – Anilinová modř – oranž G
jádra – červená
erytrocyty – oranžové
svalová tkáň – červená
kolagenní vlákna – modrá
basofilní x acidofilní cytoplazma
fundus ventriculi
Hematoxylin a eosin (HE)
Hematoxylin, eosin a šafrán (HEŠ)
chrupavka
kolagenní vlákna žlutá
Azokarmín, anilinová modř, oranž G (AZAN)
kolagenní vlákna modrá
ren
kolagenní vlákna zelená
Zelený trichrom
Cytologická barvení – podle Heidenhaina
kosterní svalová tkáň železitý hematoxylin
Impregnace „stříbrem“
slezina – retikulární vlákna cerebellum – nervová vlákna
Zpracování tvrdých tkání (zub, kost)
• dekalcifikace (odvápňování) – převedení nerozpustných vápenatých solí do
roztoku pomocí kys. mravenčí nebo chelatonu (EDTA), časově náročné – dny až
týdny
• výbrusy – tenké ploténky (50 – 70 μm) zhotovené postupným zbrušováním
materiálu
HISTOCHEMIE & IMUNOHISTOCHEMIE
• Význam:
zjišťování povahy a lokalizace chemických látek v buňce „in situ“ (průkaz biomolekul proteinů,
AA, NA, sacharidů, lipidů, enzymů, pigmentů, anorg. látek – Fe, Ca, Zn aj.)
• Provedení: detekce Ag-Ab* komplexů nebo Ag-Ab + Ab* (sekundární značená Ab)
• * - marker
1. fluorochromy – rhodamin, Texas red, FITC
2. enzymy – křenová peroxidáza, AF, acetylcholinesteráza,
3. radioizotopy (I125)
Antigen
Primární Ab
specifická vůči
epitopu Ag
Sekundární Ab
specifická vůči
primární Ab
Enzym konjugovaný
se sekundární Ab
zajistí vizualizaci
Aktin (cytoskelet)
DAPI (jádro)
Mikrotubuly (cytoskelet)
KI-67
ZPRACOVÁNÍ TKÁNÍ PRO ELEKTRONOVOU
MIKROSKOPII (EM)
Požadavky na pracovní podmínky:
• pH všech roztoků (medií) 7,2 – 7,4 (pufry –
kakodylátový nebo fosfátový)
• bezprašnost
• roztoky (media) – šetrné působení na tkáně
(minimum artefaktů)
POSTUP
• ODBĚR – okamžitá fixace, velikost tkáňového bločku do 1 mm3
• FIXACE – glutaraldehyd (vazba aminoskupin) + OsO4 (vazba lipidů) –
dvojitá fixace
• PRANÍ – destilovaná voda
• DEHYDRATACE - alkohol
• ZALÉVÁNÍ – vzorky se vkládají do želatinových kapslí nebo forem
z plastu vyplněných zalévacím mediem (polymerizace – změna
skupenství). Používají se epoxidové pryskyřice (Epon, Durcupan,
Araldite) – ve vodě nerozpustná media
Zalévací komůrky:
želatinové (1), plastové (2)
nosiče (držáky) kapslí (3)
ploténky s komůrkami
(4, 5)
bločky připravené
pro krájení
1 2
3
4,5
KRÁJENÍ
• po odstranění přebytku media (trimming) a
vytvoření pyramidy se z malé plošky (0.1
mm2) krájí jednotlivé ultratenké řezy (70 –
100 nm) - ultramikrotomy
• používají se skleněné nebo diamantové
nože s vaničkou – řezy splývají na hladinu
vody ve vaničce a odtud jsou přeneseny na
síťky (Cu)
Ultramikrotomové
nože:
skleněný
diamantový
Krájení, nosné síťky
Síťka se 3 páskami řezů
typy sítěk
KONTRASTOVÁNÍ
• princip diferenciace struktur – různý rozptyl svazku elektronů
v závislosti denzitě struktur ; „elektronová barviva“ – směsi těžkých
kovů: uranylacetát nebo citrát olovnatý
Na kapce barviva je položena nosná
síťka tak, aby ultratenké řezy byly
vystaveny působení barviva.
Rozdíly mezi SM a EM
SM EM
Odběr  1 cm3
minuty
 1 mm3
sekundy
Fixace formaldehyd
12 – 24 hod.
glutaraldehyd
1 – 3 hod.
Zalévání parafin epoxid. pryskyřice
(Durcupan)
Krájení
Tloušťka řezů
mikrotom
5 – 10 m
ultramikrotom
50 – 100 nm
Barvení (LM)
Kontrastování (EM)
barviva
(hematoxylin – eosin)
těžké kovy
(uranylacetat, citrát Pb)
Montování + ̶
Výsledek histologický preparát foto z fluoresc. stínítka -
elektronogram