Histologie a Embryologie
Přednášející:
Doc. MUDr. Miroslava Sedláčková, CSc.
Mgr. Petr Vaňhara, Ph.D.
Doc. MVDr. Aleš Hampl, CSc., přednosta ústavu
Brno, 2016
Lecture 1
Úvod
• Předmět a význam histologie, její členění.
• Hraniční oblasti histologie.
• Historie, současnost a budoucnost histologie.
Cytologie
• Buňka: definice, obecná stavba, kompartmentalizace.
• Buněčné jádro: ultrastruktura a funkční význam, chromosomy, jadérko.
• Endoplasmatické retikulum
• Centrosom
Histologie
Mikroskopická a submikroskopická struktura těla
(buňky, mezibuněčná hmota, tekutiny)
Mikroskopická anatomie
Složení a struktura orgánových systémů & individuálních orgánů
Jaké typy tkání a jak jsou organizovány?
Jaké speciální buněčné typy?
Které speciální struktury? (např. tubuly)
Jak to celé funguje?
Cytologie
Struktura buňky
a její vztah k funkci.
Obecná histologie
Jaké jsou základní typy tkání?
Jaké jsou jejich funkce?
Jakými buněčnými typy jsou tvořeny?
Toto vše je odrazem hierarchické struktury mnohobuněčných organismů
Histology není statickou disciplínou, která se zabývá výhradně strukturou !!!
Histologie
Buněčná biologie
Fyziologie
Patologie
Biochemie
Molekulární biologie
Anatomie
Embryologie
Spojme si histologii
s akcí a pohybem
Mysleme
„histologicky“
Studium histologie se poprvé stalo povinným v roce 1893
na John’s Hopkins Medical School !
Většina velkých histologů byli němci protože vyráběli kvalitní mikroskopy.
Eponymously theirs…..
Marcello Malpighi
1628 - 1694
Italský lékař
Zakladatel mikroskopické anatomie a první histolog
• Popsal chuťové pohárky
• Popsal krevní kapiláry
• Možná první, kdo viděl v
mikroskopu červené krvinky
Malpigiho vrstva kůže
Stratum basale a stratum spinosum kůže
Malpigiho tělíska v ledvinách a slezině
Hlavním přispěním k histologii
bylo popsání Lieberkuhnových
krypt se žlázami v tenkém a
tlustém střevě
Johan Nathanael Lieberkuhn
1711 - 1756
Německý anatom a lékař
Jan Evangelista Purkyně
1787 - 1869
Český fyziolog
• Pionýr histologických technik
Poprvé použil přístroj podobný současnému mikrotomu
• Zavedl termín plasma
• Popsal Purkyňova vlákna v srdci
• Popsal Purkyňovy buňky v kůře mozečku
Schwann + Schleiden – 1839 – buněčná teorie
“Once the development was ended, the founts of growth and regeneration
of the axons and dendrites dried up irrevocably. In the adult centers,
the nerve paths are something fixed, ended, and immutable. Everything
may die, nothing may be regenerated. It is for the science of the future
to change, if possible, this harsh decree.”
Santiago Ramón Y Cajal
1852 - 1934
Španělský lékař a anatom
Poprvé popsal neuron jako primární strkturální a funkční jednotku nervové tkáně.
Nobelova cena v roce 1906
Neočekávané objevy
Existence multipotentních sebeobnovujících se progenitorů
v postantálním a dospělém nervovém systému
• Subventrikulární zána
laterálních komor mozku
• Subgranulární zóna
v gyrus dentaus
hipokampu
BEZPOCHYBY V:
• Kůra koncového mozku ?
• Amygdala ?
MOŽNÁ V:
(od časných 90-tých let)
Náš pohled na organizaci centrálního nervového sytému se dramaticky změnil !!!
Mnoho otázek o NSC stále zůstává k zodpovězení
Je nutná kombinace přístupů vývojové biologie, histologie,
buněčné biologie a molekulární biologie.
• přesná pozice ve tkáni ?
• proliferační a migrační aktivita ?
• vývojový potenciál ?
• participace na vzniku chorob CNS ?
• další
Gleason et al., Neuroscience, 2008.
Má tento objev nějaké praktické užití ? (1)
Pomoc mozku regenerovat
po infarktu
Podpořit endogenní neurogenezu
a zlepšit tak histologickou
stavbu a funkci
Jin et al., Brain Research, 2011.
• experiment na krysách
• infart mozku vyvolán uzavřením mozkové arterie
• do místa infarktu transplantovány lidské
neurální progenitory
• histologicky analyzováno
Možnosti:
• chemická léčiva
• růstové faktory
• implantace buněk
Jin et al., Brain Research, 2011.
3 měsíce 24 měsíců
Transplantované lidské
buňky v místě infarktu
HuN – jádra lidských buněk
DCX – doublecortin (marker časné
neuronální linie)
HuNHuN
Neurogeneza v SVZ krysího mozku je stimulována
DCX DCX
Bez transplantace Transplantované buňky
Neocytogeneza probíhá před 60-tým dnem po transplantaci
Pulzní znační BrdU ve dni 60 po transplantaci
Má tento objev nějaké praktické užití ? (2)
Transplantace buněk & tkání
Badell et al., J. Clin. Invest., 2010
Neexistuje trvalá léčba – Transplantace ? - Imunosuprese
Diabetes
Deregulace
metabolismu glukózy
Poškození b buněk
ostrůvků slinivky břišní
Přežívající ostrůvky Rejekované / poškozené ostrůvky
IHC
Insulin - hnědá
Glukagon - modrá
Haematoxilin
&
Eosin
Lymphocyte function–associated
antigen 1 (LFA-1)
Krátkodobé ošetření
protilátkou proti LFA-1
Princip náhrady tkání a orgánů není nový,
současné medicíně se však nabízí nové postupy
postavené na pochopení struktury a funkce tkání
Egyptská mumie
Tkáňové inženýrství 1
První zpráva o vytvoření 3D vaskularizované srdeční tkáně,
která může být použita ke studiu vývoje a funkce srdce
a také (snad v budoucnu) k transplantační léčbě
Caspi et al., Tissue Engineering of Vascularized Cardiac Muscle From Human Embryonic Stem Cells,
Circulation Research, 2007 (group of Shulamit Levenberg, Israel)
(zůstaňme u infarktu)
Histologická a
funkční analýza
Endoteliaální buňky
Lidské kmenové buňky
diferencované in vitro do
kardiomyocytární linie
3-rozměrný polymerní
nosič (lešení)
Fibroblasty
Zkombinovány
dohromady
Kardiomyocyty
Kardiomyocyty
+
Endotelie
Kardiomyocyty
+
Endotelie
+
Fibroblasty
Troponin I Sarkomerický aktinin CD 31
Markery srdeční svaloviny Markery endotelu cév
Caspi et al., Circulation Research, 2007
Tkáňové inženýrství 2
Caspi et al., Circulation Research, 2007
Myofibrily
Z proužky
T tubuly
Sarkoplasmatické retikulum
Gap junctions Conexin – Gap junctions
Troponin - cardiomyocyty
Ultrastrukturální charakteristiky uměle vytvořené tkáně srdce
Vedení impulzů 1-Heptanol
Uměle vytvořená tkáň srdce má schopnost vést impulzy Ca2+
Laserová skenovací konfokální mikroskopie
(Rozpojuje Gap junctions)
Tkáňové inženýrství 3
Histologické metody studia buněk a tkání 1
Učinit pozorovatelným
Stabilizovat struktury
Fixace
Učinit objekty menšími – prostupnými
pro světlo
Zalití + Příprava řezů
Zviditelnit struktury
„Barvení“
Zvětšit
Použití mikroskopů
Světelné (optické) mikroskopy
(interakce fotonů s hmotou)
Rozlišení 0.1 mm
• Pouze s viditelným světlem
• S fluorescenčním světlem
• Konfokální laserový skenovací mikr.
Elektronové mikroskopy
(interakce elektronů s hmotou)
Rolišení až 0.1 nm (v praxi 1 nm)
• Transmisní
• Skenovací
Fixace (denaturace)
• Organická rozpouštědla (etanol, metanol, aceton,…)
• Aldehydy (form-, paraform-, glutar-aldehyd, …)
• Organické kyseliny (octová, pikrová, …)
• Soli těžkých kovů (rtuť, chrom, osmium, …)
Zalití + Krájení (řezy)
• Parafinový vosk
• Celloidin (=nitrát celózy)
• Durcupan (syntetický polymer)
• LR White (syntetický polymer)
• jiné
„Barvení“
Chemická přehledná barviva (H+E, Azan, van Gieson, …)
Histochemické reakce (průkaz proteinů/enzymů, lipidů, cukrů, …)
Imunochemické reakce (značené protilátky)
Ťěžké kovy (pro TEM – soli uranu, olova, wolframu, …)
Histologické metody studia buněk a tkání 2
Pochopení komplexních systémů musí stát
na pochopení struktury a funkce jejich součástí
Tissues
Buňky
Buňky Buňky
Tekutiny
Extacelulární
matrix
Vše je produktem buněk !
Tekutiny
• Intersticiální tekutina
• Plazma (krev)
• Lymfa (v lymfatických cévách)
• Cerebrospinální mok
• Intracelulární tekutina (cytosol)
Živé organismy jsou tvořeny buňkami
Dlouhá cesta k tomuto odhalení:
Robert Hooke
1665
Poprvé viděl buňky korku - cell
Antonie van Leeuwenhoek
1678
Poprvé uviděl mikroskopické
organismy
(bakterie, prvoky)
Rudolph Virchow
1855
Buňka může vzniknout pouze z již existující buňky
„Omnis cellula e cellula“
Matthias Schleiden Theodor Schwann
Všechny organismy jsou tvořeny
jednou nebo více buňkami
1839
Současná buněčná teorie –
6 principů na kterých stojí
• Buňka je nejmenší strukturní a funkční jednotka schopná životních procesů
• Funkce každé buňky je dána její specifickou strukturou
• Buňky jsou stavební jednotky všech mnohobuněčných organismů, všechny funkce
v organismu jsou plněny buňkami
• Struktura a funkce všech organizmů je závislá na strukturálních a funkčních
vlastnostech buněk, kterými jsou tvořeny
• Všechny nové buňky vznikají z buněk již existujících
• Díky kontinuitě života na zemi jsou buňky všech organismů principiálně stejné
(univerzální genetický kód a jeho exprese)
Svalové vlákno
Neuron
Nervosvalové
spojení
Anafáze
Telofáze
Přes jednotné organizační schéma,
je typickou vlastností eukaryontních buněk
jejich strukturální a funkční diverzita
Také buňky člověka jsou strukturálně
a funkčně extrémně rozmanité
Vajíčko
Spermie
Neuron v
mozku Tuková
buňka
Buňka
sliznice
střeva
Buňky
krve
Buňka
svalu
Buňka
kosti
Tato různorodost je předpokladem
pro schopnost buněk plnit
v organismu člověka
specializované funkce
Žádná buňka není zcela stejná jako
buňky ostatní, všechny buňky ale mají
společné strukturální a funkční znaky.
Ne všechny buňky obsahují všechny komponenty o kterých budeme mluvit !
Buňky mají 3 hlavní součásti:
1. Plazmatickou membránu
2. Cytoplazmu
3. Jádro (eukaryontní b.)
1
2
3
Organizace buňky je postavena na
KOMPARTMENTALIZACI
Specializované funkce se mohou plnit v různých sektorech buňky
Membrány tvoří hranice mezi jednotlivými kompartmenty
Unikátní proteinové
a lipidové komponenty
a unikátní funkce
Unikátní kontrola
pohybu molekul
Unikátní složení
obklopeného prostoru
Kompartmenty & Membrány
Mnoho malých kompartmentů je lepší
Více plochy pro:
• regulaci
• výměnu živin
• odstranění odpadních
látek
Vetší plocha membrány
na obklopený objem
Plocha povrchu je proporcionální se čtvercem poloměru (r2).
Objem je proporcionální se třetí mocninou poloměru (r3).
Zmnožení X Redukce
vybraných kompartmentů
Diferenciace buněk
Specializace buněk
pro různé funkce
Drsné ER v sekrečních buňkách
Mitochondrie v buňkách srdeční svaloviny
Struktura biologické membrány 1
~2.5 nm
~2.5 nm 7-10 nm
~2.5 nm
Elektron denzní
Elektron opakní
Elektron denzní
Membránová jednotka
společná všem membránám
Buněčné membrány viděné
elektronovým mikroskopem
(pseudokolorováno)
Fluidní mosaika – Dvojvrstva lipidů s mobilními globulárními proteiny
Polární fosfolipidové zbytky
Cholesterol
Nepolární fosfolipidové zbytky
Hydrofilní segment
Hydrofobní segment
Struktura biologické membrány 2
Membránové lipidy
Představují 90-99% molekul v membráně (v počtech).
• Fosfolipidy - 75%
• Cholesterol - 20%
• Glykolipidy - 5% - pouze cytoplazmatická membrána - GLYCOCALYX
Membránové proteiny
Představují 1-10% všech molekul, ale 50% hmotnosti díky jejich velikosti.
Přenos signálůTransport Identita buněk
Adheze buněk
Enzymatická aktivita
PeriferníIntegrální
+
Struktura biologické membrány 3
Organely
Ohraničené membránou
• Jádro
• Endoplasmatické retikulum
• Golgiho aparát
• Lyzosomy
• Endosomy
• Peroxisomy
• Mitochondrie
Specializované vnitřní struktury se specializovanými funkcemi
Bez membrány
• Ribosomy
• Centrosomy
• Centrioly
• Bazální tělíska
Vztah mezi strukturou buňky a její specifickou funkcí
Např.: potřeba hodně energie  hojnost mitochondrií
Jádro 1
membránou ohraničená organela
Jádro jaterní buňky
Nejčastěji:
• Sférické (5-10 mm) (lobulární, prohnuté, diskovité,…)
• Uloženo centrálně
• Jedno v buňce (osteoklast více, erytrocyt žádné)
Jádro
Perinukleární cisterna
Lamina
Membránová jednotka
20-50 nm
80-100 nm
Vnější j. membrána
Vnitřní jaderná membránaMembránová jednotka
Jádro 2
Jaderná membrána - pokračování
Laminy:
• Intermediární filamenta - proteiny (A, B, C)
• Tvoří síť na vnitřní straně VJM, pronikají i do nukleoplazmy
• Udržují pevnost a architekturu jádra
• Ukotvují chromatin
• Regulují replikaci DNA a tranksripci rRNA
• Účastní se regulace apoptózy
Laminopatie
• Lidské choroby (nejméně 13 známých)
• Mutace v genech pro laminy
(popsáno asi 200 mutací)
• Deregulace exprese genů
• Předčasné stárnutí
Hutchinson-Gilford progerie
Vzácná - 1-4 na 8 milionů porodů
Missense mutace v laminu typu A
Perinukleární cisterna
Lamina
Membránová jednotka
20-50 nm
80-100 nm
Vnější jaderná membrána
Vnitřní jaderná membránaMembránová jednotka
Jádro 4
Chromatin
Heterochromatin
Feulgen positivní – tmavé ve světelném mikr.
Tmavé/denzní granula v TEM
Transkripčně inaktivní
Euchromatin
Neviditelný ve světelném mikroskopu
Relaxované chromosomy
Transkripčně aktivní
Interfázové jádro
2 nm
Dvojšroubovice DNA
30 nm
Vlákno chromatinu – seskládané nukleosomy
Jádro 3
Komplex jaderného póru
Průměr ~ 100 – 125 nm
Tři kruhy (každý 8 podjednotek)
Vnitřní vláknitý košík
Distální kruh
Jaderný kruh
Cytoplazm. kruh
Transport jadernými póry
(Nukleocytoplazmatický přesun)
• Proteiny, RNA, podjednotky ribosomů
• Oboustranný
• Vyžaduje jaderné lokalizační/exportní signály
• Podporován importiny/exportiny
• Regulován Ran GTPázami
Jádro 5
Jadérko
jadérkojaderná
membrána
nucleoplazma cytoplazma
Není ohraničeno membránou
Hlavní funkce
Syntéza RNA
Skládání ribosomů
Pars fibrosa
Primární transkripty rRNA
Pars granulosa
Skládání ribosomů
Fibrilární centra
Netranskribovaná DNA
NOR – nukleolární organizátor (na DNA)
V lidských buňkách na 5-ti chomosomech
(chr. 13, 14, 15, 21, 22)
Endoplasmatické retikulum 1
„uvnitř buňky“ „síť“
Většina membrán uvnitř buňky.
Vzájemně propojené
kanálky a váčky Cisterny
Hladké ER
Drsné ER Ribosomy
Jaderná membrána
Velká podjednotka
ribosomu
Malá podjednotka
ribosomu
Endoplasmatické retikulum 1
Bez ribosomů  Nemá proteosyntetickou funkci !
Syntetizuje fosfolipidy a cholesterol
• Játra – metabolismus lipidů a cholesterolu, degradace
glykogenu, detoxifikace (spolu s ledvinami)
• Varlata – syntéza steroidlních hormonů (testosteron)
• Buňky střeva – absorbce, syntéza, a transport lipidů
• Kosterní s srdeční svalovina – ukládání a uvolňování
vápníku (sarkoplasmatické retikulum)
Drsné ERHladké ER
200 nm
• Syntéza všech sekretovaných proteinů
• Syntéza integráolních poteinů membrán
• Modifikace proteinů
Cytosol
Ribosomy
Cisterny
endoplasmatického
retikula
Ribosomy
Endoplasmatické retikulum
Volné ribosomy
Vázané ribosomy
Ribosomy
Schéma ribosomu
Velká
podjednotka
Malá
podjednotka
ribosomy
mRNA
100 nm
POLYRIBOSOM
(klastr ribosomů překládající
určitý úsek mRNA)
mRNA 5` AUG 3`
START kodon
3`UAC 5`
Met-tRNA
Začátek translace
mRNA 5` UAG 3`
Konec translace
mRNA 5` UAA 3`
mRNA 5` UGA 3`
STOP kodony
váží „uvolňující faktor“E P A
5`
3`
směr čtení mRNA
=
směr pohybu ribosomů po mRNA
kodony
Aminoacyl tRNA
Volné tRNA
Rostoucí polypeptidový
řetězec
Ribosomy - Translace
Golgiho aparát
Centrosom
Průměr – 0.2 mm
Délka - 0.5 mm
1
2
3
4
56
7
8
9
Děkuji za pozornost !
ahampl@med.muni.cz
Budova A1 – 1. patro
Přednášky histologie
Klíčové prvky mikroskopické
stavby tkání a orgánů a jejich
vztah k funkci
Nejnovější objevy
v oblasti struktury a obnovy
tkání a jejich vztah ke vzniku
a léčbě chorob