Klinická biochemie anemických stavů, metabolismu Fe; metody stanovení •Miroslava Beňovská Příznaky anémie lze rozdělit: • •Příznaky vznikající v důsledku poklesu transportu kyslíku do tkání ( únava, dušnost, angina pectoris, orgánové poruchy) •Příznaky vyplývající ze snížení plazmatického volumu (bledost, hypotenze) •Příznaky vyplývající ze zvýšeného srdečního objemu (tachykardie, srdeční šelest) • •Dle morfologických kritérií se anémie dělí na základě •objemu erytrocytu, množství hemoglobinu v erytrocytu a •počtu retikulocytů Anémie z nedostatku železa – sideropenické anémie: •z nadměrné ztráty železa – časté •nedostatečný příjem – vzácné •spíše inhibice vstřebávání způsobena např. fosfáty, oxaláty •malabsorpce při celiakii, Crohnově chorobě •v těhotenství – zvýšené nároky na přívod Fe •klinicky – únava, slabost, hučení v uších, dušnost Sideropenie - tři stádia – prelatentní, latentní a manifestní •Již v období prelatentního nedostatku železa se uplatňují kompenzační mechanizmy organismu •Zvýšená resorpce železa z GIT, snížení jeho výdeje a útlum tvorby zásobního proteinu Fe – feritinu •Zvýšena resorpce diagnostické dávky 59Fe z 25% na 75% a snížen výdej Fe močí po jednorázovém podání desferioxaminu • •Terapie - léčba příčiny sideropenie • - substituce Fe sejmout0001 Anémie z nedostatku vitamínu B12 a kyseliny listové – megaloblastické •Označují se takto dle morfologického vzhledu erytrocytů •Nejčastější příčinou nedostatku vitamínu B12 je porucha vstřebávání •Způsobená buď nedostatkem vnitřního faktoru nebo výrazným omezením resorpční plochy ve střevě •Perniciózní anémie – nejčastější, postihuje vyšší věkové kategorie, genetické vlivy, autoimunitní onemocnění (protilátky proti buňkám žaludeční sliznice) •Vnitřní faktor – glykopeptid nutný při vstřebávání B12 v ileu •Prokázány dva typy protilátek – •a) brání vazbě vit. B12 na vnitřní faktor •b) inhibují vazbu komplexu vit. B12 - vnitřní faktor na receptory ve sliznici ilea • Anémie z nedostatku vitamínu B12 a kyseliny listové – megaloblastické sejmout0003 Megaloblastická anémie •Vzniká i po resekci žaludku – většinou kombinace nedostatku vitamínu B12 a kyseliny listové ( ta se vstřebává v duodenu a horním jejunu) • •Vitamín B12 tvoří prostetickou skupinu enzymu homocysteinmethyltransferázy, která demethyluje tetrahydrofolát a přenáší methylovou skupinu z homocysteinu na methionin • •Tetrahydrofolát je následně opět methylován a je donorem methylové skupiny pro tvorbu thyminu • •Důsledkem nedostatku vit. B12 a kyseliny listové je tedy porucha syntézy thyminových bází a tvorby DNA • •Prodlužuje se S-fáze buněčného cyklu, při níž se zdvojnásobuje množství DNA, výsledkem je velký objem buňky s nezralým jádrem – megaloblast sejmout Anémie při chronickém onemocnění: •Chronické infekce (tuberkulóza, AIDS), zánětlivá onemocnění, nádory • •Aktivace imunitního systému vedoucí k omezení nabídky železa invadujícím patogenům či nádorovým buňkám, pro něž Fe představuje zásadní růstový faktor • •Stimulace tvorby feritinu spolu s blokádou uvolňování železa ze zásobárny Anémie ze zvýšeného zániku erytrocytů – hemolytické : •Charakteristická je zkrácená doba přežití erytrocytů v periferní krvi •Často ani maximálně stupňovaná krvetvorba není schopna nahradit zvýšený rozpad krvinek •Hemolytické anémie: -Dědičná sférocytóza (porucha skeletu erytrocytární membrány – deficit spektrinu) -Anémie z poruchy enzymatické výbavy erytrocytu – př. deficit pyruvát kinázy -Anémie z poruchy tvorby hemoglobinu - beta-thalasemie -Autoimunitní hemolytické anémie – porucha kooperace mezi pomocnými a supresorovými lymfocyty T a B Vitamín B12 (cyanocobalamin): •Molekula B12 obsahuje jako centrální atom kobalt, který je umístěn uprostřed porfyrinového jádra •Vitamín je nezbytný pro tvorbu nukleových kyselin, tedy pro dělení buněk •Nedostatek se projeví perniciózní anémií •Deficit je nejčastěji způsoben poruchou absorpce při chronické atrofické gastritidě, kdy žaludeční sliznice netvoří mukoprotein nezbytný pro vstřebávání vitaminu B12, tzv. vnitřní faktor •Ověření se provádí Schillingovým testem, kdy se sleduje absorpce vitamínu B12 po podání vnitřního faktoru Stanovení vitaminu B 12 ( sérum, plasma): •Komerční stanovení se zakládá na technikách stanovujících volný nebo vázaný vitamín B12 • •Přítomnost endogenních sérových vazebných proteinů pro cyankobalamin ( transkobalaminy včetně R-proteinu) a imunoglobulinů namířených proti vnitřnímu faktoru vyžaduje pro uvolnění vitaminu B12 povaření materiálu nebo zpracování v alkalickém pH • •Historie – imunochemické metody - v 70-tých létech se k stanovení vitaminu B12 pomocí RIA využívalo sérových vazebných proteinů a částečně vyčištěného vnitřního faktoru – výsledky byly často falešně zvýšené Stanovení vitaminu B 12 ( sérum, plasma): •V současnosti: • Vitamín B12 se stanovuje kompetitivním testem využívajícím vysoce čistého vnitřního faktoru specifického pro vit. B 12 po uvolnění z endogenních vazebných proteinů • •Imunochemické metody – např. •Elektrochemiluminiscence - Roche – Elecsys, E170 – • Vit. B 12 ze vzorku soutěží s vit. B 12 značeným biotinem o vazebná místa na vnitřním faktoru značeným rutheniovým komplexem • •Chemiluminiscence – Siemens (Bayer) – Centaur – • Vitamín B12 ze vzorku soutěží s vitamínem B12 značeným akridinium esterem o limitovanou koncentraci vnitřního faktoru kovalentně vázaného na paramagnetické částice • Po separaci chemiluminiscenční reakce s peroxidem vodíku a NaOH • •Referenční rozmezí: 150 – 650 pmol/l Folát (kyselina listová) •Tetrahydroderivát kyseliny listové je koenzymem metabolismu jednouhlíkatých zbytků • •Uplatňuje se při řadě reakcí včetně tvorby nukleových kyselin • •Nedostatek se projevuje podobně jako deficit vitaminu B12, tj. megaloblasticou anémií • •Nedostatek velmi častý - je jednou z nejčastějších příčin mírné hyperhomocysteinémie (vliv na sklerotické a trombotické onemocnění periferních cév), u těhotných může zvyšovat frekvenci defektu neurální trubice plodu • •Nedostatek může způsobit dieta bez čerstvého ovoce a zeleniny, objevuje se u alkoholiků, drogově závislých, nebo starších osob Stanovení folátu v séru (plasma není vhodná): • Imunochemické metody • Kompetitivní princip po uvolnění folátu z endogenních folát vázajících proteinů • • - např. elektrochemiluminiscence Roche – Elecsys, E170 • • - chemiluminiscence – Siemens (Bayer) – Centaur • Folát ze vzorku soutěží s folátem značeným akridinium esterem o limitovaný počet molekul folát vázajícího proteinu značeného biotinem • Tento protein se váže k avidinu na paramagnetických částicích • Po separaci probíhá chemiluminiscenční reakce s peroxidem vodíku a NaOH • •Referenční rozmezí: 10 – 50 nmol/l • •Interference: Hemolýza výrazně zvyšuje koncentraci folátu, •z hemolytických vzorků se proto stanovení neprovádí. Feritin •Zásobní vysokomolekulární bílkovina obsahující železo •Nachází se v játrech, slezině, kostní dřeni a střevní sliznici •Koncentrace feritinu v séru odráží tkáňové zásoby železa – její hladina klesá dříve než roste koncentrace transferinu •Zvýšení syntézy feritinu indukováno nedostatkem železa v organismu •Buňky některých nádorů, především akutní myeloblastická leukémie nebo mnohočetný myelom, produkují feritin - koncentrace feritinu jako tumormarker •Může být zvýšen rovněž u chronických zánětů a onemocnění jater Stanovení feritinu (sérum, plasma): • Imunochemické metody • Sendvičový princip • - např. elektrochemiluminiscence - Roche – Elecsys, • E170 • - chemiluminiscence - Siemens – Immulite •Stanovení založeno na reakci jednoho epitopu ferritinu s myší protilátkou navázanou na polystyrénové kuličce a druhého epitopu s polyklonální protilátkou konjugovanou s alkalickou fosfatázou •Po promytí se přidá fosforečný ester adamantyl dioxetanu - ten s ALP hydrolyzuje na nestabilní meziprodukt •Meziprodukt se rozpadá za produkce luminiscence • Stanovení feritinu (sérum, plasma): -fluorescenční imunoanalýza • Kryptor – Brahms • Dvě různé protilátky tvoří komplex s feritinem • Jedna značena donorem energie - kryptát europia, druhá akceptorem XL 665 • Po ozáření komplexu dusíkovým laserem donor emituje dlouhotrvající signál v ms, zatímco akceptor generuje signál v ns • Obě komponenty svázány v jeden komplex - je možné signál měřit v ms • Dochází rovněž k spektrálnímu posunu • Velikost signálu je úměrná koncentraci stanovovaného analytu - • Referenční rozmezí: M 30 – 400 ug/l • Ž 5 – 150 ug/l • Transferin –Trf •Transportní protein pro železo v séru •Při amémii zvýšené hodnoty (při nedostatku železa v organismu je vystupňována syntéza transferinu v hepatocytech). •Při nedostatku železa je velmi citlivým indikátorem saturace transferinu •Využívá se i při monitorování léčby anémie •Pokles transferinu – při při akutním či chronickém zánětu, při malnutrici • •Stanovení transferinu (sérum, plasma) – • imunoturbidimetricky • imunonefelometricky • – př. Roche Diagnostic – Protilátky proti transferinu reagují se stanovovaným transferinem za vzniku komplexu antigen-protilátka • Reakce se provádí v přítomnosti NaCl a PEG • Aglutinát se stanoví turbidimetricky • •Referenční interval: 2 – 3,6 g/l Solubilní transferinové receptory – sTFR •Transferinový receptor je integrální membránový protein •Každá ze dvou podjednotek může vázat molekulu transferinu nesoucí železo •Učinkem proteolýzy vzniká rozpustná forma transferinového receptoru •sTFR je v plasmě přítomen v komplexu s transferinem •Koncentrace sTFR je úměrná koncentraci receptoru na membránách •Při deficitu Fe se koncentrace sTFR v séru zvyšuje •Na rozdíl od koncentrace ferritinu není koncentrace sTFR ovlivněna reakcí akutní fáze, nebo maligními nádory •Uplatňuje se v diferenciální diagnostice – rozlišení mezi chronickým onemocněním a anémií z nedostatku Fe Stanovení sTFR (sérum, plasma) – imunoturbidimetricky: • Princip – př. Roche Diagnostic • Částicemi usnadněné imunoturbidimetrické stanovení: •Lidský rozpustný transferinový receptor aglutinuje s latexovými částicemi, potaženými s protilátkou proti rozpustnému transferinovému receptoru •Precipitát se stanoví turbidimetricky • • Referenční interval: 2 – 5 mg/l