Optické metody Mgr. Jana Gottwaldová Optické analytické metody •Fyzikální metody, které získávají potřebné informace z měření optických vlastností a spekter zkoumaných látek. •využívá interakce analytu se světlem - optických vlastností molekul a atomů měřené soustavy •může jít o změnu barvy či její intenzity, luminiscenci, fluorescenci, změnu optické otáčivosti nebo o změnu rozptylu světla při průchodu vzorkem Spektrofotometrie-rozdělení •Podle frekvence elektromagnetického záření: •UV spektr. – zahrnuje oblast záření λ=190-400 nm •VIS spektr. – oblast viditelného záření λ=400-800 nm •IČ spektr. – oblast IČ spekter se dělí na blízkou IČ λ=800-2000 nm, dalekou IČ λ=105 nm • • • • • Spektrofotometrie-rozdělení •Podle typu interakce •elektromagnetického záření: •Atomovou absorpční spektrofotometrii •Atomovou emisní spektrofotometrii •Turbidimetrii, nefelometrii •Luminiscenční metody: fluorimetrie,fosforescence, chemiluminiscence • • Optické metody • • •jsou založeny na výměně energie mezi látkou a zářením •Světlo je druhem elektromagnetického záření •Vlastnosti elektromagnetického záření - má duální charakter • • • •Složku magnetickou a elektrickou •Vzdálenost mezi dvěma vrcholy vln se nazývá vlnová délka- λ, udává se v nm • • • Export1 Elektromagnetické záření Popisující veličiny elektromagnetického záření Ø •rychlost – c (m/s), ve vakuu 3x108 m/s • •vlnová délka - l (nm) • • •Frekvence světelných vln, kmitočet (=počet vln za sekundu) - n(Hz,s-1) • Ø Export1 Popisující veličiny elektromagnetického záření •energie fotonu světelného záření ε •Energie fotonu je přímo úměrná jeho kmitočtu, h je Planckova konstanta (6,625x10-34 J/s) • • • •Energie fotonu je nepřímo úměrná vlnové délce tzn. že světelné záření o kratší vlnové délce má vyšší energii, než světlo s delší vlnovou délkou • • Elektromagnetické záření •Světlo v UV a VIS oblasti má kmitočet (počet vln za s) 1014 -1015 Hz • •Monochromatické - světlo, které se skládá pouze z jedné vlnové délky •Polychromatické – skládá se z mnoha vlnových délek (sluneční světlo, světlo wolframové žárovky) Barevnost látek •Pokud absorbované záření má λ ležící v oblasti viditelné části spektra, látka se jeví lidskému oku jako barevná •Má vždy barvu doplňkovou k barvě absorbovaného světla • Barevnost látek Barevnost látek Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii • • • •Propustnost (transmitance): • •Množství světla určité vlnové délky, které prošlo •vzorkem •Kde I0 je intenzita světla vstupujícího do vzorku a I •je intenzita světla ze vzorku vystupujícího • • • • Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii •Absorbance: • • •Bezrozměrná veličina, definovaná na základě •transmitance, udává jaké množství světla bylo •pohlceno vzorkem. • Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii •Zákon Lambertův-Beerův: • •I = I0 . 10-ε l c • •Intenzita světelného záření procházející •absorbujícím prostředím klesá exponenciálně v •závislosti na délce absorbující vrstvy a •koncentraci absorbující látky • •(Johan Heinrich Lambert, 1728-1777) Zákon Lambertův-Beerův Ø Ø Øabsorbance při dané vlnové délce přímo úměrná tloušťce absorbující vrstvy l Økoncentraci absorbujících částic ve vrstvě c Økonstanta úměrnosti pro danou látku a danou vlnovou délku absorbovaného záření je molární absorpční koeficient ελ • Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii •molární absorpční koeficient ελ: fyzikální konstanta, která udává jak daná látka při určité koncentraci absorbuje monochromatické záření určité vlnové délky •takto lze zjistit koncentraci látek barevných, nebo látek absorbujících světlo v UV oblasti •pokud látka v těchto oblastech neabsorbuje, je třeba ji převést na látku, která absorbuje více •vztah mezi signálem ( absorbancí) a koncentrací se určuje kalibrace Kalibrační závislost •Praktické využití Lambertova-Beerova zákona •Provedení: •změříme obvykle 5 standardních roztoků o známé vrůstající koncentraci při určité vlnové délce •všechny roztoky se měří za stejných experimentálních podmínek (spektrometr,kyveta,pipety,doba inkubace..) •blank = slepý pokus, obsahuje vše kromě stanovované látky • • • Kalibrační závislost •Sestrojení kalibrační křivky •naměřené hodnoty absorbance standardů na ose y •hodnoty koncentrace na ose x • •Pokud je závislost lineární, je •možné změřit absorbanci a •vypočítat koncentraci •neznámého vzorku Kalibrační závislost •Vzhledem k tomu, že poměr •cst/Ast je pro měřenou sérii •konstantní používáme ho pro •změřenou sérii jako kalibrační •faktor, kterým vynásobíme •naměřené hodnoty absorbance •vzorků o neznáme koncentraci • •LOD-dolní mez detekce •LOL- horní mez detekce •LOQ-mez stanovitelnosti Limitace Lambertova-Beerova zákona •Odchylka ελ při vysokých koncentracích (>0,01 mol/l) vlivem elektrostatických interakcí •Částečný rozptyl světla na částicích přítomných ve vzorku •Fluorescence nebo fosforescence vzorku •Nedokonale monochromatické záření •Nekoherentní světelné záření • Nejpřesnější výsledky jsou získávány v rozsahu • absorbancí 0,2- 2,0 . Od hodnot absorbance > • výrazně narůstá chyba měření Spektrofotometrie-rozdělení •Podle typu interakce •elektromagnetického záření: •Atomovou absorpční spektrofotometrii •Atomovou emisní spektrofotometrii •Turbidimetrii, nefelometrii •Luminiscenční metody: fluorimetrie, fosforescence, chemiluminiscence • • • • Absorpce vs. emise záření •Emise záření: Dodáním energie (např. kinetické, tepelné) jsou částice látka (složky studovaného vzorku) převedeny do vyššího energetického stavu. Při zpětném přechodu se energie vyzáří ve formě fotonu •Absorpce záření: Částice látky absorbuje foton a přejde přitom do vyššího energetického stavu. (Návrat zpět do energeticky nižšího stavu již není sledován.) Atomová absorpční spektrofotometrie-AAS •zabývá kvantitativním hodnocením změny intenzity záření (obvykle určité vlnové délky) po průchodu analytickým prostředím. Při průchodu ektromagnetického záření z oblasti UV nebo VIS části spektra měřeným roztokem dochází k absorpci záření. •Přístroje, které se používají k měření intenzity záření v ultrafialové (UV) nebo viditelné (VIS) oblasti spektra se nazývají fotometry nebo spektrofotometry. Atomová emisní spektrofotometrie •Při této technice se měří emise záření. K emisi záření charakteristické vlnové délky dochází při návratu elektronů z excitovaného stavu (vyvolaného plamenem) do základního stavu. • •Přístroje, které se používají k měření intenzity emisního záření, se nazývají emisní spektrofotometry Spektrofotometry • •Přístroje, které se používají k měření intenzity • záření v ultrafialové (UV) nebo viditelné (VIS) • oblasti spektra • •Slouží pro měření absorpce světla vzorkem • •Absorbance je měřena při různých vlnových délkách • Uspořádání spektrofotometru •Zdroj světla •Optický systém: štěrbiny, zrcadla, čočky •Monochromátor nebo filtr: k výběru určité • vlnové délky •Absorpční prostředí: kyveta s měřeným • vzorkem •Detekční systém: zařízení k měření • světelného záření, které prošlo vzorkem • Zdroje záření a jejich použití • •Wolframová žárovka – měření absorpce ve viditelném spektru •Deuteriová (vodíková) výbojka - měření absorpce v UV spektru •Xenononová výbojka- měření absorpce v oblasti VIS UV spektru •Rtuťová výbojka – měření v oblasti spektra 200-400 nm • • • Wolframová žárovka – VIS oblast spektra •Skleněná baňka naplněná inertním plynem obsahující páry jódu •Uvnitř je wolframové vlákno, které je zahříváno stejnosměrným proudem Deuteriová výbojka – UV oblast spektra •Nízkotlaké, produkují světlo o vlnové délce 160-360 nm Xenonová výbojka – blízká UV oblast nebo IČ oblast spektra •Vysokotlaká (pevnější plášť), výboj vzniká mezi dvěma wolframovými vlákny, potřebuje intenzivní chlazení • Spektrofotometr - fotometrické filtry •Slouží k vymezení určitého ( co nejužšího) pásu monochromatického světla ze spojitého záření. • •Charakteristikou filtru je tzv. spektrální pološířka •filtru (h, nm) - odpovídá intervalu vlnových délek záření v •polovině maximální propustnosti filtru (je odvozena z křivky •propustnosti). Čím je rozsah pološířky filtru užší, tím je filtr •lepší. •Fotometrické filtry dělíme na dvě základní skupiny: •barevné absorpční a interferenční • Spektrofotometr - fotometrické filtry •Spektrální pološířka •filtru (h, nm) - odpovídá •intervalu vlnových délek záření •v polovině maximální •propustnosti filtru – •transmitance,je odvozena z •křivky propustnosti). •Čím je rozsah pološířky filtru •užší, tím je filtr lepší. • • •Křivka propustnosti Fotometrické filtry • •Barevné absorpční filtry - mají nižší spektrální •čistotu filtrovaného záření, jejich pološířka je 30-80 •nm • •Pevné - skla vyrobená z oxidy kovů, nebo pokrytá vrstvou želatiny s organickým barvivem • •Kapalné – obvykle kyvety s roztoky anorganických solí • Fotometrické filtry-interferenční filtry •Interferenční filtry využívají mnohonásobnou •interferenci záření mezi hraničními plochami •s výbornými odrazovými vlastnostmi, mají užší šířku •pásma a vyšší pík transmitance (lepší propustnost) •než barevné absorpční filtry. Nejvíce rozšířený je •kovový Fabry-Perotův filtr. • interferfiltr •a, c – polopropustné vrstvičky •b – vrstva dielektrika o tloušťce l/2 •d, e – krycí vrstvy • Fotometrické filtry-interferenční filtry •Na základní desce je mezi dvěma stříbrnými •polopropustnými vrstvičkami vrstva průhledného •dielektrika o tloušťce l/2, přičemž l odpovídá •požadované vlnové délce. •Mnohonásobnými odrazy od zrcadlových ploch •filtru a po vícenásobné interferenci dopadajících •paprsků různé vlnové délky, vznikají velmi úzká •maxima s pološířkou 8 – 10 nm. • interferfiltr Spektrofotometr - monochromátory •Optická zařízení pomocí kterých se ze spektra •polychromatického světla mechanicky vymezí •pouze jeho určitá část. •Slouží pro kontinuální výběr různých vlnových •délek • • • spec_fig1%20scanning Monochromátor • • •Monochromátor se skládá: •vstupní štěrbiny •pomocné optiky (zrcadla, čočky) •disperzního prvku - mřížka,hranol •výstupní štěrbiny • spec_fig1%20scanning Monochromátor- vstupní a výstupní štěrbina •Vstupní – vymezuje malou část světelného toku •ze zdroje záření •Výstupní štěrbina – slouží k výběru záření určité •vlnové délky, čím je užší tím užší je šířka pásma •(bandpass) a větší monochromatičnost záření. • •Poloha štěrbin je neměnitelná, požadovaná vlnová •délka se nastavuje přímým otáčením disperzního •prvku. • Monochromátor - pomocná optika •Zrcadla - jsou to plochy odrážející záření, jsou •potažena obvykle vrstvou hliníku •Rovinná – nejvíce používaná •Dutá, kulová , parabolická • • Čočky – optický zaostřovací systém • • Optická vlákna – skleněná, křemenná •usměrňují transport světla ve stísněných prostorách •(vertikální fotometry k měření mikrotitračních •destiček), mají větší světelné ztráty než zrcadla • •Clony – používají se k omezení průřezu svazku paprsků, k odstínění okrajové oblasti čoček a zrcadel • Disperzní prvek - optický hranol •rozkládá polychromatické světlo na principu lomu světla •světelné paprsky o kratší vlnové délce (modré světlo) se lámou více než paprsky s delší vlnovou délkou •Skleněný hranol - pro rozklad světla ve VIS oblasti spektra (400-800 nm) •Křemenný hranol – pro UV oblast (do 200 nm) • • Disperzní prvek – difrakční reflexní mřížka •pracuje na principu odrazu světla •Je tvořena soustavou jemných rovnoběžných • vrypů na skleněné destičce (nejkvalitnější až 1700 /1 mm) •Na vybroušených ploškách mřížky dochází k složitým optickým procesům-odraz, interference světla, které vedou k tomu, že z mřížky vychází jednotlivé vlnové délky pod rozdílným úhlem, který závisí na vlnové délce záření •Rozklad záření je lineární u všech vlnových délek •Má lepší rozlišovací schopnost než hranol • • • • • • Výběr požadované vlnové délky •Přesným pohybem •disperzního prvku •monochromátoru je vzniklé •světelné spektrum •nasměrováno na výstupní •štěrbinu tak, aby jím •prošlo záření požadované •vlnové délky • • • • • • • • • • • • ☼ • • • • •optické zrcadlo •zdroj •světla •difrakční reflexní mřížka •mikrometrický šroub • kyveta • •detektor • Spektrofotometr - Absorpční prostředí •Kyveta s měřeným vzorkem •Rozdělení: •dle velikosti: Makro- (1-2 ml), semimikro- •(<0,5 ml), mikro-(<100 μl) •dle typu: nalévací, průtokové •dle materiálu: skleněné, plastové (akrylátové, polystyrenové), křemenné (UV oblast) • automatických bioch. analyzátorech: •kyvety na jedno použití •trvalé – po změření se promyjí mycí stanicí Absorpční prostředí spektrofotometru • Instr_tech_spektrofotom 008a Instr_tech_spektrofotom 006 •zatavené kyvety z plastické fólie •postup miniaturizace kyvet •400 µl 150 µl •80 µl Spektrofotometr - detekční systém •Je složen z detektoru záření a elektronického •zařízení pro zpracování jeho odezvy • •Detektory •Zařízení, které zprostředkovávají přeměnu energie záření •na jinou formu – obvykle fotochemickou, elektrickou • •Hradlový selenový fotočlánek •Fotodioda •Fotonásobič •Detektor diodového pole Detektor – hradlový selenový fotočlánek •Skládá se z polopropustné vrstvy stříbra nanesené na vrstvě selenu (polovodič) na kovovém podkladě •Světelné záření o vlnové délce λ dopadající na polovodič působí uvolnění elektronů, které přecházejí do vrstvičky stříbra •Tím vzniká elektrický proud, který je proporcionální intenzitě světelného záření Detektor – fotodioda (fotonka) •Pracuje na principu fotoelektrického efektu • •Skládá se z fotosenzitivní katody (obsahuje Ag a •různé alkalické kovy a jejich oxidy) a anody umístěné •ve vakuu • •Fotokatoda uvolňuje při ozáření světlem •elektrony, které jsou přitahovány anodou čímž •vzniká el. proud, který je proporcionální intenzitě •světelného záření • Detektor - fotonásobič •Elektrony z fotokatody jsou postupně přitahovány k sérii dynod, na které je vloženo postupně se zvyšující napětí •Když elektron narazí na dynodu uvolní z ní mnohem více elektronů, které jsou přitahovány k další dynodě •Obsahuje až 10 dynod, z nichž každá následující má až o 50 V vyšší napětí •Toto vnitřní zesílení signálu umožňuje převést i velmi slabé světelné záření na měřitelné hodnoty elektrického proudu • • • Detektor - fotonásobič • Detektor s diodovým polem •Je tvořen velkých množstvím miniaturních •fotodiod na malé ploše destičky, na kterou dopadá •světelné záření po průchodu absorpčním •prostředím a následně je rozložené •monochromátorem na jednotlivé vlnové délky Detektor s diodovým polem spec_fig1%20scanning spec_fig2%20diode%20array • Rozdíl oproti klasickému spektrofotometru – •monochromátor je umístěn až za kyvetou se vzorkem • Použití : v HPLC (UV/VIS detektor), automatické biochemické analyzátory • Usnadňuje tzv. bichromatické měření absorbance • Kontrola kvality spektrofotometru •Linearita spektrofotometru – schopnost vykazovat •lineární odezvu • •měření postupně ředěného roztoku o známé • koncentraci •Výsledkem je přímkový graf závislosti A (osa y) na c (osa x) •Měření se provádí při λ - 257, 341, a 630 nm • • Kontrola kvality spektrofotometru •Rozptýlené světlo •Světlo, které může dopadnout na detektor aniž •by prošlo měřeným vzorkem (př. nedokonalé •odstínění optického systému spektrofotometru) •Ověřuje se vložením neprůsvitného bloku do nosiče kyvety a sledováním odezvy detektoru • •Drift signálu •Schopnost detektoru udržovat konstantní hodnotu •Sledování nulové linie • Optické metody-turbidimetrie, nefelometrie Mgr. Jana Gottwaldová Turbidimetrie a nefelometrie •Patří mezi běžné analytické optické metody •v klinické biochemii se používají k stanovení velké skupiny bílkovin – tzv. „specifických proteinů“ •využívají rozptylu světla na heterogenních částicích v koloidních roztocích a mikrosuspenzích Turbidimetrie a nefelometrie •Princip •Rozptyl světla na heterogenních částicích je •založen na Tyndallově jevu: •„Rozptýlené záření na částicích má stejnou •vlnovou délku jako záření dopadající na koloidní •částice“. •Rozptýlené světlo vychází z roztoku všemi směry. •(Tyndall, britský fyzik, 19 st.) Turbidimetrie a nefelometrie •Tyndallův jev - dokonalý difúzní rozptyl •platí pro částice které mají velikost menší než 1/10 (př. IgG-20nm) vlnové délky dopadajícího záření •U částice o velikosti větší 1/10 – 1 (400-1400nm) násobek vlnové délky dopadajícího světelného záření je maximum rozptýleného světla směřováno dopředu a málo dozadu vzhledem k dopadajícímu záření – eliptický rozptyl Turbidimetrie • •Princip je založen na měření procházejícího světla zeslabeného rozptylem na částicích při průchodu světelného záření prostředím s velkými molekulami (bílkoviny) • sleduje pokles intenzity záření procházející rozptylující vrstvou •Na částicích dochází k rozptylu záření a částečně i jeho absorpci •Závislost turbidance (odpovídá A) na koncentraci analytu je nelineární • • Turbidimetrie •K turbidimetrickému měření zákalu se využívají absorpční fotometry a spektrofotometry -jednoúčelové turbidimetry se dnes v klinické biochemii nevyužívají •měření se provádí v přímém směru, v ose světelného paprsku • • •☼ • •M •Vzorek • • •D Turbidimetrie •měření stupně zákalu - turbidity • •využívají se precipitační reakce mezi antigenem a protilátkou • •Nutno získat dostatečně stálou suspenzi měřené reakční směsi - k tomuto účelu se používají ochranné koloidy (nejčastěji polyetylenglykol). Turbidimetrie •Na biochemických analyzátorech dosahují turbidimetrické metody reprodukovatelnost asi 5% •Je třeba snížit vliv interferujících látek na minimum – jakýkoliv vliv, který způsobí vznik částic odlišné velikosti (koncentrace činidel, teplota) •Hemolýza a ikterus ruší méně než při nefelometrii • • Nefelometrie • •zabývá se měřením intenzity difúzně rozptýleného světla na částicích • •Pro tyto účely slouží buď nefelometrický nástavec k fotometru, u nichž se difúzně rozptýlené světlo sleduje pod úhlem 90°, nebo jsou vyvinuty speciální přístroje - nefelometry • • nefelo1 •Nefelometrie x turbidimetrie Nefelometrie •Rozdělení •dle použitého zdroje záření: • •Laserový nefelometr •Konvenční nefelometry • • • • • Laserový nefelometr •Helium neonový nebo argonový laser •Tento zdroj monochromatického světla je mimořádně intenzivní a má vysoký stupeň směrovosti paprsku • •Rozptýlené světlo se sleduje detektorem nastaveným pod úhlem 5 až 90° (fotonkou nebo fotonásobičem) Laserový nefelometr •LASER = Light Amplification by Stimulated •Emission of Radiation = zesilování světla pomocí •stimulované (vynucené) emise záření •Hlavní součásti laseru : •zdroj excitační energie •aktivní prostředí •rezonátor • • Laser_DSC09088 Laser •Hlavní součásti laseru : •zdroj excitační energie – budící zdroj působící elektrický výboj •aktivní prostředí -tj. látka obsahující oddělené kvantové energetické hladiny elektronů – může se jednat o plyn (nebo směs plynů), krystaly, polovodiče •rezonátor – tvořen dvěmi zrcadly: 1.Koncové s odrazivostí 100% 2.Výstupní s odrazivostí 99%, tzn. částečně propustné, umožňující vyzařování světelného paprsku • Konvenční nefelometry •Konvenční nefelometry •používají jako světelný zdroj žárovku nebo xenonovou výbojku •Monochromátor - interferenční filtr. •Detektor je nastaven pod úhlem 70 až 90o. Xenonová oblouková lampa • • Poskytuje intenzivní světelné záření pomocí elektrického oblouku • Skládá se z oválné baňky vyrobené z křemenného skla ve které jsou proti sobě umístěné katoda a anoda v atmosféře xenonu • Teplota elektrického obloku se pohybuje okolo 6000 ºC • Produkuje vysoce energetické, spojité záření v UV oblasti • • Xenonová oblouková lampa • Instr_tech_nefelometr_turbidimetr 004 Nefelometrie •Rozdělení podle typu měření •Systém měření v end point režimu– po smíchání antigenu a protilátky proběhne měření po dosažení rovnovážného stavu - možnost falešně negativní (nízká) koncentrace antigenu. Proto je nutné nastavení systému tak, aby měření probíhala v oblasti lineární části křivky • Měření v tomto režimu je o řád citlivější než turbidimetrie (0,1 mgl) • Nefelometrie •Systém měření v end point režimu Nefelometrie •Rozdělení podle typu měření •Systém měření v kinetickém režimu •RATE-reakce je rychlejší, měří se přírůstek vzniku precipitátu v pravidelných časových intervalech, po dosažení rovnovážného stavu (desítky vteřin) se měření ukončuje Nefelometrie •Systém měření v kinetickém režimu • Průběh imunoprecipitační reakce •Heidelbergova-Kendalova křivka: • Oblast ekvivalence • Oblast nadbytku protilátky •Zákalové metody: nefelometrie, turbidimetrie • Oblast nadbytku antigenu • •Ab - protilátka •Ag - antigen Limitující faktory imunochemických stanovení •Limitující faktor: precipitát se tvoří pouze při optimálním množství antigenu a protilátky, při nadbytku některé ze složek se precipitát začne rozpouštět. • tzn. JEDNA HODNOTA KONCENTRACE •PRECIPITÁTU TAK ODPOVÍDÁ DVĚMA •KONCENTRACÍM ANTIGENU – možnost vydání •falešně negativního výsledku • Imunoprecipitační křivka podle Heidelberga a Kendalla • Detekce nadbytku antigenu •Několik způsobů: •Kontrola přídavkem naředěného antigenu po •proběhnuté imunoprecipotační reakci – následuje •automatické opakování analýzy s vyšším ředěním. • •Přídavek malého množství vzorku k činidlu •před vlastní reakcí – je-li po krátké inkubaci •překročen koncentrační práh zjištěný při kalibraci, •vzorek se měří automaticky znovu při vyšším •ředění • • • Detekce nadbytku antigenu Instr_tech_nefelometr_turbidimetr 007 1.V případě zachování nadbytku Ab dojde další tvorbě imunokomplexů a nárůstu intenzity rozptýleného světla 2.Pokud byla protilátka již spotřebována, nevede přidání dalšího antigenu k tvorbě imunokomplexů a na detektoru nezjistíme žádnou odezvu – reakce se automaticky opakuje při vyšším ředění 3. Imunochemický systém - IMMAGE 800 •Analyzátor výrobce Beckman Coulter • využívá turbidimetrického a nefelometrického principu •Pracuje v kinetickém režimu - měří zvýšení intenzity světla rozptýleného částicemi v kyvetě v čase • IMMAGE 800 - reagenční část •Reagenční karusel pro 24 reag. kazet •Teplota 15°C •4 lahvičky s pufry bez chlazení •Reag. kazety značené čárovým kódem •Otevřený systém •Softwarová kapacita -50 metod •Kalibrační data- kal. křivka výrobce má 8-12 bodů, provádí se pouze jednobodové ověření • • Vzorková část •Vzorky ve zkumavkách s čár. kódem •Vzorkový karusel pro 8 stojánků po 9 vzorcích • ředící roztoky pro vzorky • ředící segmenty pro ředění vzorků •Kapacita: 180 testů za hodinu, v sérii lze provést 12 metod Reakční část •Reakční karusel – 39 reak. plastových kyvet, • 1 referenční – známá hodnoty rozptylu, nastavení optického systému •Teplota 37°C •Optika – zdroje záření, detektory Turbidimetrie •měření stupně zákalu (turbidity) – v důsledku imunoprecipitační reakce •Měří se snížení intenzity světla při průchodu roztokem částic v kyvetě v důsledku rozptylu světla •Immage pracuje v kinetickém režimu – hodnotí rychlost nárůstu zákalu v čase •NIPIA= imunoanalýza na částicích v blízké • infračervené oblasti • • Turbidimetrie •Zdroj pro NIPIA: světlo emitující dioda – poskytuje monochromatické záření λ = 940 nm •Detekce záření: v přímém směru, v ose světelného paprsku zdroje v blízké IR oblasti (940 nm) •Vyžití: stanovení FLC • Nefelometrie •Zdroj: helium-neonový laser – dává monochromatické záření o λ = 670 nm •Detekce: detektor je umístěn v úhlu 90° ke směru laserového paprsku •Využití: stanovení specifických proteinů v séru, v likvoru a moči • Nefelometrie •Zdroj: helium-neonový laser – dává monochromatické záření o λ = 670 nm •Detekce: detektor je umístěn v úhlu 90° ke směru laserového paprsku •Využití: stanovení specifických proteinů v séru, v likvoru a moči • Řešení problému s imunoprecipitační křivkou •Nutno provést taková opatření, aby nedošlo k omylu při odečítání vyšších koncentrací antigenu •IMMAGE : detekce nadbytku antigenu • pomocí přídavku dalšího antigenu po ukončení reakce Jestliže nenavázaná protilátka … Přídavek dalšího antigenu bude mít za následek… Systém IMMAGE… Je přítomna Zvýšení poměrové odezvy Použije k výpočtu výsledku původní poměrovou odezvu Není přítomna Žádné zvýšení poměrové odezvy Vzorek automaticky zopakuje s vyšším ředěním s testem na přebytek antigenu dokud nezíská správný výsledek Automatizovaný nefelometr BN Pro Spec •Výrobce: Siemens (dříve Dade Behring) •Max. provozní rychlost 180 analýz za hod. •Pracuje v režimu po vzorcích •K dispozici je více než 60 metod •Zdroj světla: LED dioda (840 nm) •Detektor – křemíková fotodioda je umístěn pod úhlem 13-24 º • • • • Automatizovaný nefelometr BN Pro Spec •Reagenční disk je temperován na 8ºC,v •analyzátoru lze umístit 35 činidel •Reakční disk: 60 polystyrénových kyvet pro opakované použití •Měření probíhá při 37 ºC •Délka inkubace je 6-12 min. •Vzorková část: lze umístit až 100 vzorků, umožňuje používat primární, sekundární zkumavky a kepy • • • Nefelometr Array 360 •Výrobce: Beckman Coulter •Měření v kinetickém režimu •Rychlost 40-80 analýz za hod. •Zdroj světla: halogenová žárovka (400-620 nm) •Detektor:křemíková fotonka •K dispozici asi 60metod •Nevýhoda:pracovní teplota pouze 26,7 ºC, velký mrtvý objem, stabilita kalibrace pouze 14 dní • • Nefelometr - Delta •Výrobce Radim •Zdroj světla laser (670 nm) •K dispozici 100 metod •Rychlost 150 analýz za hod. (startovací čas 30 min., ukončovací čas 15 min. !) •Reagenční část: 54 pozic pro reagencie, chlazená •Reakční část:120 omyvatelných kyvet, temperovaných na 37 ºC •Vzorková část: pro 80 vzorků Turbox plus •Jednoduchý manuální nefelometr •Výrobce: ORION Diagnostica •Lze měřit až 100 vzorků za hodinu •Zdroj světla je LED dioda (635 nm) •Detektor: 2 fotodiody •Tovární kalibrace je na magnetické kartě Děkuji za pozornost