Modely….
… Vladimír Rotrekl
Modely….
… tentokrát buněčné modely chorob..
… Vladimír Rotrekl
K čemu slouží buněčné modely chorob…?
poznání (molekulární podstaty chorob)
vývoj nových léčiv
Proč molekulární podstata a proč nová léčiva?
Jako např. vyvraždění části vojska Marka Antonia ve válce s Parthy
… aneb jak objevit atropin v rulíku zlomocném
… a do toho všeho nám dochází tradiční inspirace…
Nové choroby
Nové příčiny známých chorob
Rezistence k existujícím léčivům
Mutace a adaptace stávajících kmenů
Odhad: cca 600 dignóz starého Egypta
V roce 2007 WHO registrovalo 14199 kódů v
ICD10
Známe tisíce chorob..!
…máme ale také k dispozici knihovny
stovek tisíc chemických látek
- Látky přírodního původu
- Produkty kombinatorické chemie
Knihovny malých molekul … dostupné jako kolekce tisíců látek na mikrotitračních destičkách
umožňují rychlý skríning tisíců látek v reálném čase
Testování účinků smogu (1956)
Jak ale testovat účinky tak velkého množství látek?
Jak ale testovat účinky tak velkého množství látek?
… když jen jedna látka – atropin – stála život nejen polovinu vojska Marka Antonia
… než jsme se ji naučili používat
Potřebujeme model…
Potřebujeme model…
Nevýhody zvířecích modelů:
- Mnohdy chybí relevance k lidským chorobám
- Není možné testovat rozsáhlé knihovny sloučenin
Potřebujeme model…
… buněčný model!
… buněčné modely:
• Nedostatečné množství z biopsií
• Omezené množství buněčných typů lze kultivovat in vitro
• Délka kultivace je omezena
… buněčné modely:
• Rakovinné linie
• Kmenové buňky a odvozené buněčné typy..
… buněčné modely: rakovinné linie
Výhody:
Onemocnění na buněčné úrovni
Imortalizované linie
Nevýhody:
Velká diverzita v mechanizmu
onemocnění
Genomová nestabilita a s tím
spojená nestálost modelu
Weinstein, Nature 2012
… buněčné modely: rakovinné linie
Výhody:
Onemocnění na buněčné úrovni
Imortalizované linie
Nevýhody:
Velká diverzita v mechanizmu
onemocnění
Genomová nestabilita a s tím
spojená nestálost modelu
Celkem vzorků doposud …. 1010 (z toho 1010 celých genomů)
Analyzovaných genů …. 23699
Identifikovaných mutací …. 1141626
Z toho jedinečných variant …. 1021175
Projekt „Genomics of Drug Sensitivity in cancer“
Celkem vzorků doposud …. 1010 (z toho 1010 celých genomů)
Analyzovaných genů …. 23699
Identifikovaných mutací …. 1141626
Z toho jedinečných variant …. 1021175
Projekt „Genomics of Drug Sensitivity in cancer“
Pokud známe mutaci, můžeme přiřadit mechanizmus konkrétní účinné látce
Projekt „Genomics of Drug Sensitivity in cancer“
130 látek v klinickém a preklinickém testováníNěkolik set rakovinných linií
Identifikace nových cílových molekul protinádorové terapie..
Garnet a kol., Nature 2012
Identifikován biomarker typický pro Ewingův sarkom responzivní na inhibitory PARP
Garnet a kol., Nature 2012
Projekt „Genomics of Drug Sensitivity in cancer“
Identifikace nových cílových molekul protinádorové terapie..
Modely chorob vyjma rakovin….
Indukované pluripotentní kmenové buňky
+ model přesně odpovídá pacientovi
+ přesně víme co se odehrává na úrovni organizmu
- neustálený standard kontrol
- možný neznámý polygenní a epigenetický vliv
Embryonální kmenové buňky
+ konzistentní genetické pozadí
+ “čistota“ genetické manipulace
- nutnost použití řízené manipulace genomu
- absence polygenních faktorů
Modely chorob vyjma rakovin….
Indukované pluripotentní kmenové buňky
+ model přesně odpovídá pacientovi
+ přesně víme co se odehrává na úrovni organizmu
- neustálený standard kontrol
- možný neznámý polygenní a epigenetický vliv
diferencovaná buňka
epigenetický reset
Yamanakovým „koktejlem“
Pluripotentní buňka
Oct4
Sox2
Klf4
C-Myc
Modely chorob vyjma rakovin….
Indukované pluripotentní kmenové buňky
+ model přesně odpovídá pacientovi
+ přesně víme co se odehrává na úrovni organizmu
- neustálený standard kontrol
- možný neznámý polygenní a epigenetický vliv
diferencovaná buňka
epigenetický reset
Yamanakovým „koktejlem“
Pluripotentní buňka
Oct4
Sox2
Klf4
C-Myc
Bhartiya D. (ed.) Pluripotent Stem Cells, 2013
Modely chorob: Indukované pluripotentní kmenové buňky
diferencovaná buňka
epigenetický reset
Yamanakovým „koktejlem“
Pluripotentní buňka
Diferenciace in vitro
fibroblasts cardiomyocytes neurons
hiPSC
neurony
hiPSC
neurony
Brennandetal.Nature2011
SCZD neurony replikuji chování post mortem neuronů
Nové poznatky:
SCZD neurony mají sníženou konektivitu
Identifikovány nové dráhy s rozdílnou expresí: NOTCH, SLIT/ROBO EFNA
atd..
Duchenova
muskulární dystrofie
- Postižené kosterní
svalstvo
- dilatovaná kardiomyopatie
- Předpoklad:
- Chybí dystrofin
- Únik kalcia ze
sarkoplazmatického
retikula
- Pomohly by inhibitory
vápníkových kanálů?
Chceme je testovat na
srdečních buňkách!!!
hiPSC
Srdeční buňky
Duchenova
muskulární dystrofie
hiPSC
neurony
Biopsie buněk
cílového orgánu
Toto si nemúžeme dovolit
vzhledem ke stavu
pacienta a typu tkáně
Biopsie kožních buněk
Indukované
pluripotentní
buňky
Embryonální tělíska
Izolované srdeční buňky
Identické s pacientem
Fluorescenční
mikroskopie
Patch clamp
DMD: disease of stem cells
Cardiac progenitor depletion due to excessive DNA damage…
Katecholinergní
Polymorfní Komorová
Tachykardie (CPVT)
- způsobuje náhlou srdeční
smrt
- Předpoklad:
- nestabilní vazba RyR a
calstabinu
- Únik kalcia ze
sarkoplazmatického
retikula
- Pomohly stabilizátory RyR?
Chceme je testovat na
srdečních buňkách!!!
hiPSC
Srdeční buňky
B-adrenergic receptor
cAMP
RyR
PKA
RyR
P
P P
Ca2+
calstabin
SR
Ca2+
Patient Control
iPSC
(indukované pluripotentní buňky)
MODEL: Syndrom náhlé srdeční smrti
Náhlá srdeční zástava při zátěži
Ryanodinový receptor propouští Ca2+ i když zrovna nemá
biopsie
Diferenciace iPSC na kardiomyocity
Kardiomyocity na 360 jamkových deskách
Screening knihovny „ion channel blockers“
Vitální barvení kalcia (např FLOU-4)
Acimovic et al. Biologický ústav LF MU
Vizualizace uvolňování kalcia..
Kardiomyocity na 360 jamkových deskách
Screening knihovny „ion channel blockers“
Vitální barvení kalcia (např FLOU-4)
Acimovic et al. Biologický ústav LF MU
Pro hledání účinných látek je krom modelu třeba i robustní screeningová metoda
MODEL: Syndrom náhlé srdeční smrti
Náhlá srdeční zástava při zátěži
Ryanodinový receptor propouští Ca2+ i když zrovna nemá
Použití organoidů k modelování chorob
Helicobacter pylori
Asociace s C-MET receptorem
Epitelialní proliferace
Modely chorob vyjma rakovin….
Indukované pluripotentní kmenové buňky
+ model přesně odpovídá pacientovi
+ přesně víme co se odehrává na úrovni organizmu
- neustálený standard kontrol
- možný neznámý polygenní a epigenetický vliv
Možnosti: porovnánání více iPSC z pacientů nesoucích
stejnou mutaci se stejně širokou skupinou kontrolní
,nebo…….
Modely chorob vyjma rakovin….
Indukované pluripotentní kmenové buňky
+ model přesně odpovídá pacientovi
+ přesně víme co se odehrává na úrovni organizmu
- neustálený standard kontrol
- možný neznámý polygenní a epigenetický vliv
Cílená inverze mutace u iPSC z pacienta…
Modely chorob vyjma rakovin….
Cílená inverze mutace u iPSC z pacienta…
http://www.ctm-basel.ch/
Nejčastěji využívané
Programovatelné místně
řízené nukleázy
- Zinc-Finger nukleázy)
- Taleny
- CRISPR/Cas
Modely chorob vyjma rakovin….
Nejčastěji využívané
Programovatelné místně
řízené nukleázy
- Zinc-Finger nukleázy)
- Taleny
- CRISPR/Cas
Ryan, SDY, CELL, 2013
Model Parkinsonovy choroby: technologií CRISPR/CAS opravená mutace
synnucleinu v neuronech derivovanych z iPSC
Modely chorob vyjma rakovin….
Nejčastěji využívané
Programovatelné místně
řízené nukleázy
- Zinc-Finger nukleázy)
- Taleny
- CRISPR/Cas
Ryan, SDY, CELL, 2013
Model Parkinovy choroby: technologií CRISPR/CAS opravená mutace
synnucleinu v neuronech derivovanych z iPSC
Hemofilie A – nejčastější příčina je inverze části genu koagulačního faktoru 8
Park, CY, PNAS, 2014
Bonus: Stejným párem TALENů lze opravit mutaci v iPSC z pacienta – otevírá
cestu genové/buněčné terapie
Park, CY, PNAS, 2014
Modely chorob vyjma rakovin….
Indukované pluripotentní kmenové buňky
+ model přesně odpovídá pacientovi
+ přesně víme co se odehrává na úrovni organizmu
- neustálený standard kontrol
- možný neznámý polygenní a epigenetický vliv
Embryonální kmenové buňky
+ konzistentní genetické pozadí
+ “čistota“ genetické manipulace
- nutnost použití řízené manipulace genomu
- absence polygenních faktorů
Z důvodu ochrany osobních údajů zablokovala aplikace PowerPoint automatické stažení tohoto obrázku.
„The encoded protein may function in RNA
metabolism.[3] The precise function of the
SBDS protein is not known but it appears to
play an important role in ribosome function or
assembly.“
Shwachman-Bodian-Diamondův syndrom
Wiki:
Charakteristika choroby:
Exokrinní pankreatická dysfunkce
(výsledkem je podvýživa a zastavení růstu)
Hematologické abnormality (často vyústí do
myeloidní leukemie)
„The encoded protein may function in RNA
metabolism.[3] The precise function of the
SBDS protein is not known but it appears to
play an important role in ribosome function or
assembly.“
Shwachman-Bodian-Diamondův syndrom
Wiki:
Charakteristika choroby:
Exokrinní pankreatická dysfunkce
(výsledkem je podvýživa a zastavení růstu)
Hematologické abnormality (často vyústí do
myeloidní leukemie)
gene SBDS
hESC with mutated SBDS protein
buňky
pankreatu
krevní
buňky
SBDS protein mutation
Protease induction
Increased cell death
in both
Blood and Pancreas
Děkuji za pozornost..
Vladimír Rotrekl
vrotrekl@med.muni.cz
Modely chorob vyjma rakovin….
Indukované pluripotentní kmenové buňky
+ model přesně odpovídá pacientovi
+ přesně víme co se odehrává na úrovni organizmu
- neustálený standard kontrol
- možný neznámý polygenní a epigenetický vliv
diferencovaná buňka
epigenetický reset
Yamanakovým „koktejlem“
Pluripotentní buňka
Oct4
Sox2
Klf4
C-Myc
Buganim, 2013