Kalibrace, kontroly kvality v koagulační laboratoři Jiřina Zavřelová Kalibrační materiál Komerční kalibrační plazmy  přesně udaná hladina vyšetřované složky  naváznost na mezinárodní referenční materiály  některé parametry návaznost na „pool“ normální plazmu (APTT, PT,..) Směsná normální plazma (PT, APTT) Kalibrace 1/ Vyšetření  různých ředění kalibrační plazmy s udanou hladinou parametru(100%, 50 %, 25 %….)  několika kalibračních materiálů s různou hladinou parametru  a vynesení naměřených hodnot (čas, A…) pro jednotlivé hladiny do grafu  závislost lin/lin, lin/log, log/log,nelineární(polynom) 2/ Vyšetření referenčního času (času normálu) pro výpočet R, INR 3/ Načtení kalibrace čárovým kodem u předkalibrovaných metod Ředění kalibrační plazmy Automatické  naprogramováno Manuální  geometrickou řadou (100%, 50%, 25%,12,5%...)  přímé ředění (1:1, 1:2, 1:4, 1:8…) Kalibrační křivka Grafická závislost měřeného parametru na hladině vyšetřované složky měřený parametr (osa y)  koagulační čas (s)  absorbance (A, ΔA/min)….. hladina vyšetřované složky (osa x)  aktivita (%, IU/ml…)  koncentrace (g/l, g/ml…) Kalibrační křivka - požadavky minimálně tříbodová závisí na typu vyšetření musí pokrýt rozsah normálních i patologických hodnot linearita kalibrační křivky (ideální r = 1,00) pokud naměřená hodnota mimo kalibrovanou oblast v oblasti s klinickým významem je nezbytné opakovat vyšetření s jiným ředěním (menším nebo větším) vyšetřované plazmy Odečtení výsledku Automatické Manuální přímé odečtení  stejné ředění kalibrační i vyšetřované plazmy odečtení + vynásobení dilučním faktorem  odlišné ředění kalibrační a vyšetřované plazmy Provedení kalibrace  Při změně šarže setu/jednotlivých reagencií, v případě že nejsou součástí jednoho setu  rutinní i speciální testy  S každou sérií vyšetření  speciální testy  vzhledem k omezené stabilitě reagencií a vysoké citlivosti  za obzvláště citlivé metody vyžadující kalibraci s každou sérií jsou považována vyšetření FF VIII, IX, XI a XII, PC a PS  po kalibraci musí následovat provedení kontrol kvality s deklarovaným rozmezím v normálním i patologickém rozsahu Kontroly kvality koagulace Je nezbytnou součástí systému kontrolních procesů (SMK), které zajišťují  spolehlivost výsledků vyšetření  potřebnou jistotu pro  pro laboratoř, pacienty, lékaře  minimalizaci možných analytických chyb VKK zahrnují nejen měření kontrol, ale i analýzu výsledků a jejich hodnocení, řešení neshod Kontroly kvality koagulace Vnitřní (interní)kontrola kvality (VKK, IKK) Externí kontrola kvality (EHK) Vnitřní kontroly kvality koagulace Doporučení ČHS : www.hematology.cz Preventivní činnosti související s VKK Validace přístrojů Validace pipet Údržba přístrojů Záznamy do provozních deníků Kvalita diagnostik Verifikace metod Typy kontrol Preciznost měření v čase (mezilehlá preciznost) Ověření funkčnosti reagenčního systému Reprodukovatelnost měření stejných metod na různých analyzátorech (mezipřístrojová kontrola) Preciznost v sérii (opakovatelnost) Pravdivost (správnost) Preciznost  je těsnost shody mezi navzájem nezávislými výsledky opakovaných měření téhož vzorku  bez vztahu k cílové hodnotě/deklarovanému rozmezí  Měření za podmínek  opakovatelnosti (preciznost v sérii)  opakovaná analýza stejného materiálu, stejnou metodou v krátkém časovém intervalu na stejném analyzátoru… (např. 10x)  reprodukovatelnosti  opakovaná analýza stejného materiálu v různém čase v provozních podmínkách laboratoře současně se vzorky pacientů, stejný analyzátor, stejná metoda (preciznost v čase, mezilehlá preciznost)  opakovaná analýza téhož materiálu v provozních podmínkách laboratoře současně se vzorky pacientů stejnou metodou na různých analyzátorech (mezipřístrojová kontrola)  Číselným vyjádřením preciznosti je  směrodatná odchylka (SD) od aritmet. průměru (x), variační koeficient (CV)  procentuální odchylka (D%) Pravdivost Je těsnost shody mezi průměrnou hodnotou výsledků více měření a uvedenou cílovou hodnotou referenčního kontrolního materiálu Mírou pravdivosti je odchylka aritmetického průměru série výsledků měření od cílové hodnoty kontrolního materiálu (bias) Požadavky na kontrolní vzorky Měření v jednom běhu současně se vzorky pacientů Analyzované složky musí být dostatečně stabilní Složení co nejvíce podobné vyšetřovaným vzorkům Zcela nezávislé na kalibračních materiálech Odlišné hladiny nelze získat různým ředěním téhož kontrolního materiálu!!! Kontrolní materiál  Firemní komerční materiál (lyofilizované)  referenční materiál  materiál s deklarovaným rozmezím hodnot  atestovaná kontrola  materiál bez deklarovaného rozmezí hodnot  neatestovaná kontrola  V laboratoři připravený kontrolní materiál  šokově zmrazený nebo čerstvý  Kontrolní materiály v rozmezí  fyziologických i patologických hodnot („normální“ a patologické) Referenční kontrolní materiál  Má pro daný test deklarovanou  cílovou hodnotu  nejistotu měření  metrologickou návaznost  použité postupy vyšetření  uvedeno v dokumentu vydaném způsobilou osobou nebo organizací (např. WHO)  Je používán převážně pro hodnocení pravdivosti  Značí se CRM, SRM.. Atestovaný kontrolní materiál  S uvedeným  deklarovaným rozmezím hodnot pro jednotlivé parametry  nejistotou měření  použitými postupy vyšetření  metrologickou návazností na CRM nebo bez metrologické návaznosti  Je v souladu s IVD MD (označen „CE“ značkou)  Lze jej použít k ověření funkčnosti reagenčního systému Neatestovaný kontrolní materiál Bez deklarovaného rozmezí hodnot pro jednotlivé parametry Mají uvedeno pouze S vymezením  parametry, pro které je kontrolní materiál určen  orientační vymezení hladiny parametrů  „normální a patologické Je v souladu s IVD MD (označen „CE“ značkou) Lze jej použít ke stanovení mezilehlé preciznosti nebo opakovatelnosti V laboratoři připravený kontrolní materiál Směsná plazma  počet dárců/jedinců je vázaný na účel použití v laboratoři Vzorek jednoho dárce Lze jej použít ke stanovení  mezilehlé preciznosti  opakovatelnosti  reprodukovatelnosti měření stejných metod na různých analyzátorech. VKK v koagulační laboratoři U každého typu kontroly v SOP uvedeno  účel měření  interval a četnost  kontrolní materiál  hodnocení měření  dokumentace měření Preciznost v čase (mezilehlá preciznost)  Účel měření  záchyt neúměrného vychýlení denních rutinních vyšetření (PT, APTT, TT, FBG, D-Di, AT, aXa)  speciálních koagulačních vyšetření, která se provádí s větší frekvencí (např. F VIII)  Interval a četnost  každé spuštění přístroje, nová šarže reagencie, servisní zásah (s vlivem na analýzu), nová lahvička reagencie, která se musí rekonstituovat  minimálně 1x denně/po provedení 200 vyšetření  Kontrolní materiál  komerční (neatestovaný)/připravený laboratoří  dvě úrovně, dostatečné množství, zachování stability Hodnocení měření (statistické programy)  průběžně průměr, SD, CV  kontrolní rozmezí (průměr ± 2 SD)  varovné rozmezí maxim.(průměr ± 3 SD)  Westgardova pravidla (není běžné) Dokumentace měření  primární dokumentace s vyhodnocením průměr, SD, CV  Levey-Jennings grafy  formuláře s autorizovanými záznamy, vyhodnocením  SD (výběrová SD) vypočítaná metodou „n-1“  SD =  ((xi - x)2 / n-1), CV = SD×100 / x  x = aritmetický průměr, n = počet měření Preciznost v čase (mezilehlá preciznost) Kontroly preciznosti v čase - Fbg Ověření funkčnosti reagenčního systému Účel měření  ověření zda výsledky pro daný měřící systém jsou validní Interval a četnost  při změně šarže reagencie, při nové kalibraci metody  minimálně 1x měsíčně u rutinních metod a s každou sérií vyšetření u speciální metod Kontrolní materiál  komerční (atestovaný)/připravený laboratoří se stanoveným cílovým rozmezím  dvě úrovně, pokud jsou dostupné Ověření funkčnosti reagenčního systému Hodnocení měření  výsledky v deklarovaném rozmezí Dokumentace měření  primární dokumentace  formuláře s autorizovanými záznamy a deklarovaným rozmezím Mezipřístrojové kontroly  Účel měření  preciznost měření za podmínek reprodukovatelnosti zpravidla u rutinních testů dní  Interval a četnost  po kalibraci metody  v rámci ověření funkčnosti reagenčního systému  při současném provozu a v době střídání provozu na různých analyzátorech  v rámci mezilehlé preciznosti  minimálně 1x denně vyšetřením 2 čerstvých vzorků (dle možnosti laboratoře)  Kontrolní materiál  jakýkoliv kontrolní materiál včetně čerstvých vzorků  dvě úrovně, pokud jsou dostupné Mezipřístrojové kontroly Hodnocení měření  jeden analyzátor zvolit jako referenční  D% (procentuální odchylka výsledků měření analyzátorů vzhledem k referenčnímu analyzátoru Dokumentace měření  primární dokumentace  formuláře s autorizovanými záznamy a vyhodnocením D%  D% =((x –AV)/AV)x100  x = výsledek měření analyzátoru  AV = vztažná hodnota referenčního analyzátoru Preciznost měření v sérii (opakovatelnost)  Účel měření  sledování správné funkce analyzátoru kontrolou všech typů a principů měření  dle doporučení výrobce přístroje (APTT, FBG,AT)  Interval a četnost  6-10 měření  1x za 6 měsíců u poloautomatických koagulometrů  1x ročně u automatických koagulometrů  Kontrolní materiál  jakýkoliv kontrolní materiál včetně čerstvých vzorků  1-2 úrovně Preciznost měření v sérii (opakovatelnost) Hodnocení měření  CV a/nebo σ (směrodatná odchylka vypočítaná metodou „n“)  σ =  ((xi - x)2 ) / n), CV = σ ×100 / x  x = aritmetický průměr, n = počet měření Dokumentace měření  primární dokumentace  formuláře s autorizovanými záznamy a vyhodnocením CV a/nebo σ Pravdivost měření (správnost) Účel měření  sledování těsnosti shody aritmetického průměru naměřených hodnot testu oproti cílové hodnotě referenčního materiálu  pravdivost kvantifikuje systematickou chybu měření  je součástí verifikace a validace metody Interval a četnost  alespoň 6 měření za podmínek opakovatelnosti  minimálně 1x ročně Kontrolní materiál  referenční materiál  1-2 úrovně Pravdivost měření (správnost) Hodnocení měření  bias% (vychýlení aritmetického průměru výsledků měření oproti cílové hodnotě referenčního materiálu) Dokumentace měření  primární dokumentace  formuláře s autorizovanými záznamy a vyhodnocením bias%  bias% = ((x – Cref)/Cref)x100  x = aritmetický průměr výsledků měření  Cref = cílová hodnota referenčního materiálu Kriteria pro vyhodnocení kontrol Doporučení výrobců přístrojů a diagnostických setů Laboratoř si stanoví vlastní kriteria dle výsledků vlastního provádění IKK  povolené rozmezí, maximální CV, SD, σ, DMax Doporučení SEKK pro DMax Vyhodnocení kontrol dle kritérií  bezprostředně  sledování trendů