HLA systém, jeho struktura a funkce HLA (Human Leukocyte Antigens ) = Hlavní histokompatibilní systém člověka •Historie • v1930 – 1940- MHC geny nejdříve rozpoznány u myší na základě pokusů s transplantacemi tumorů u myší v v50. léta- charakterizováno několik geneticky podmíněných antigenů v60. – 70. léta- již známy 3 lokusy HLA-A, -B, -C, MHC geny se účastní v imunitní odpovědi • v1972- k produkci protilátek B lymfocyty nutná T- buněčná aktivita a také účast HLA molekul v1974- fenomén HLA restrikce ( T lymfocyty rozpoznávají cizorodý antigen pouze v komplexu s HLA molekulami I. nebo II. třídy • v80. léta- objev antigenů lokusů HLA-DR, -DQ, -DP vdalší studie vedly k poznání hlavní funkce MHC molekul v imunitní odpovědi • v90. léta- objev tzv. neklasických antigenů lokusů HLA-E, -F, -G, -H, -J, -K, -X • Struktura HLA systému vNejkomplexnější a nejpolymorfnější systém, každý člověk nese unikátní sestavu HLA alel, výjimka – monozygotní dvojčata v vlokalizace na krátkém raménku 6. chromozomu ( 4100 kb, více než 200 genů ) v vgeny uspořádány do 3 oblastí: HLA I., II., III. třída v • HLA I. třída v vI. třída obsahuje geny HLA –A, -B, -C pro těžký řetězec α molekul HLA-A, -B, -C v povrchové glykoproteiny, exprimovány na téměř všech buňkách (transplantační, klasické ) vneklasické geny HLA-E, -F, -G (glykoproteiny - omezený výskyt) v v geny MICA, MICB (MHC Class I Chain-related) na endoteliální bb. v pseudogeny • HLA II. třída v geny pro –α a –β řetězec HLA molekul – DR, -DQ, -DP v v produkty glykoproteiny exprimovány na povrchu tzv. antigen prezentujících buněk (buňky imunitního systému) v v HLA-DM, -DO geny – produkty nejsou exprimovány na buněčné membráně, výskyt v endozomech, funkce - naložení cizorodého peptidu na HLA molekulu II. třídy) v v geny LMP2, LMP7 kódují proteiny, které štěpí cizorodé částice na menší peptidy v v geny TAP1, TAP2, zahrnuty do procesu transportu peptidů do ER n n HLA III. třída vstrukturálně a funkčně odlišné proteiny n v složky komplement C4, C2, faktor B, 21-hydroxylasa, TNF, heat shock protein Hsp 70 n n vHLA molekuly I. a II. třídy jsou glykoproteidy složené ze 2 různých proteinových řetězců (heterodimery) v v vHLA molekuly I. třídy mají těžký α- řetězec nekovalentně vázaný s β2- mikroglobulinem (gen pro lehký řetězec β2- mikroglobulin lokalizován na chr. 15) vα- řetězec vytváří 3 domény α1, α2,α3; α1 a α2 obsahují polymorfní místa detekovatelná sérologickými a buněčnými technikami v vHLA molekuly II. třídy se skládají ze 2 glykoproteinových transmembránových řetězců α, β vKaždý řetězec je složen do 2 domén (α1, α2, β1, β2) Struktura HLA molekul Kopie - pokus Funkce HLA systému n vHlavní funkcí HLA molekul je předkládat (prezentovat) cizorodé antigeny buňkám imunitního systému, především T lymfocytům v vTato prezentace antigenu je prvním předpokladem pro rozvoj imunitní reakce a tím obrany proti napadení mikroorganismy n v imunitní systém musí rozlišovat mezi „vlastními“ a „cizími“ antigeny v v Primární role imunitního systému je rozpoznat a eliminovat nebezpečné cizirodé agens v v fenomén HLA restrikce - buněčné receptory T lymfocytů (TCR) rozpoznávají komplex sestávající se z cizorodého antigenního peptidu vázaného v peptidovém žlábku HLA molekuly. v v2 způsoby prezentace antigenů T lymfocytům – endogenní (HLA I. tř.) n - exogenní (HLA II. tř.) q •PŮVOD PEPTIDŮ •Odkud pocházejí cizorodé patogeny rozpoznávané T lymfocyty: • v replikace v cytosolu buňky (viry, některé bakterie) • proteiny produkované buňkou - endogenní zdroj v ciz. peptid + HLA I + CD8+ (Tc lymfocyty) - zabití napadených buněk • • v replikace v endosomech a lysosomech (bakterie, paraziti) • proteiny buňkou pohlcené - exogenní zdroj v vesikulární systém buňky (transportní váček) v ciz. peptid + HLA II + CD4+ (Th lymfocyty) - aktivace zánětlivé a protilátkové odpovědi •CD4+ Th1 - zánětlivé - aktivace makrofágů k zabití patogenu •CD4+ Th2 - protilátková odpověd', aktivace B buněk k produkci protilátek Peptidy prezentované pomocí HLA I. tř. – endogenní zdroj •1. Syntéza virových •proteinů na ribosomech • •2. Ubiquitin – označení • proteinu k likvidaci • •3. Proteasom –rozštěpení • •4. TAP1/TAP2 – transport •peptidů do endoplasmatického retikula • •5. Naložení na molekulu HLA I a transport na povrch buňky Peptidy prezentované pomocí HLA II. tř. – exogenní zdroj •MHC II • •ENDOPLASMATICKÉ •RETIKULUM •α a β řetězec MHC II + •invariantní řetězec (Ii, CD74) •(zabraňuje obsazení •vazebných míst vlastními •peptidy)⇒ CLIP (CLass II •associated Invariant Chain •Peptide) •⇒ HLA-DM ⇒ odstranění Ii a záměna za antigenní fragment •EXOGENNÍ ANTIGEN • •Vesikuly s kyselým •prostředím •ENDOSOMY •LYSOSOMY - proteolytické štěpení •(katepsiny, endopeptidáza) •HLA molekuly jsou ligandy pro receptory NK buněk • vNK buňky (přirození zabíječi) se vyznačují přímou cytotoxickou aktivitou vNK buňky mají na povrchu aktivační a inhibiční receptory (KIR-killer immunoglobuline-like receptor), kterými je regulována aktivita NK buněk v Aktivační receptory rozpoznávají běžné povrchové struktury buněk(např. Fc receptor ) vInhibiční receptory rozpoznávají HLA molekuly a také neklasické HLA-E a –G molekuly vHLA molekuly aktivují nebo blokují aktivitu NK buněk v v vT lymfocyty rozpoznávají přítomnost HLA molekul (vlastní x cizí), vNK buňky rozpoznávají absenci HLA molekul vabsence HLA molekul je u normálních buněk vzácná, ale není neobvyklá u některých nádorových b. a u virem infikovaných b. v v Zatím co T buňky jsou ignorantní k nebezpečným HLA negativním buňkám, NK buňky je rozpoznávají v • ochrana fetálního allograftu • vPlod v těle matky je z poloviny cizí štěp vKlasické HLA produkty I. třídy –A, -B, nejsou exprimovány na buňkách trofoblastu → T lymfocyty jsou k plodu ignorantní vna trofoblastu jsou syntetizovány neklasické molekuly HLA-G, (-E) → zajišťují inhibici NK buněk v vZávěr: Neklasické HLA-G, (-E) molekuly hrají speciální biologickou roli = ochrana vyvijejícího se fetu před mateřskými T a NK buňkami, hrají roli při potlačení imunitní odpovědi matky proti plodu • • • úloha HLA molekul v transplantologii • vHLA molekuly jsou silné aloantigeny indukující rejekci štěpu v vMICA (MHC Class I Chain-related molecules) genové produkty aktivují NK buňky vMICA jsou exprimovány na endoteliálních b.,ne na lymfocytech vAnti-MICA protilátky nejsou detekovatelné běžnými cross-match technikami a mají pravděpodobně také velký vliv na přežívání štěpu při orgánových Tx • • snímek66 087 Exprese a distribuce HLA molekul vHLA I. tř. - nalezeny na všech jaderných buňkách vHLA geny exprimovány kodominantně – obě alely každého HLA lokusu exprimují HLA molekuly vna mladých červených krvinkách – atypický antigenní systém Bga, Bgb, Bgc (reziduální HLA antigeny) vplazma – solubilní HLA antigeny v vHLA II. tř. – omezená distribuce: B lymfocyty, makrofágy, dendritické buňky, Langherhansovy buňky kůže, (buňky imunitního systému) n vexprese HLA antigenů I. a II. třídy může být zvýšena během zánětu, ale také může být indukována na určitých buňkách, na kterých se normálně neexprimují (myocyty, hepatocyty ). vZvýšená nebo nová exprese HLA antigenů je iniciována cytokiny (interferony) n vNová exprese HLA antigenů za určitých podmínek pravděpodobně hraje majoritní roli v patogenezi rejekce transplantovaného štěpu vSnížená exprese HLA molekul - nádorové buňky, virem infikované buňky n v Absence HLA molekul - mechanismus, kterým nádorové buňky a virem infikované buňky obchází imunitní rozpoznání T buňkami. typ buňky, tkáně exprese HLA I HLA II BUŇKY IMUNITNÍHO SYSTÉMU dendritické buňky +++ + makrofágy +++ ++ T lymfocyty +++ + B lymfocyty +++ +++ JINÉ JADERNÉ BUŇKY neutrofilní granulocyty +++ - eosinofilní granulocyty +++ - epitelové buňky +++ - hepatocyty + - nervové buňky + - buňky ledvin + - NEJADERNÉ BUŇKY trombocyty ++ - erytrocyty - - • •Tab.1.: Odlišnosti v expresi molekul HLA I. a II. třídy na různých buněčných typech •( J. Krejsek a O. Kopecký, Klinická imunologie, str. 125, 2004) Srovnání vlastností a funkce HLA I a HLA II nCharakteristika HLA I HLA II n nStruktura α řetězec + β2m α a β řetězce n nDomény α1, α2 a α 3 + β2m α1, α2 a β1, β2 n nBuněčná exprese téměř všechny jad.buňky APC (B buňky, dendritické n buňky,makrofágy) n nPeptidy vázající místo uzavřené,váže 8-9 amk otevřené, váže 12-17amk n tvořené doménami α1 a α2 tvořené doménami α1 a β1 n nPeptidy endogenní antigeny exogenní antigeny n nPeptidy prezentované CD8+T buňkám CD4+T buňkám Dědičnost HLA systému v geny vázané X geny volně kombinovatelné v vHLA geny jsou vázané → děděny „en bloc“ od rodičů jako haplotyp v vněkdy rekombinace v HLA oblasti (crossing-over během meiotického dělení) → výměna genetického materiálu mezi homologickými chromozómy → vznikají rekombinantní sestavy alel v vfrekvence rekombinace je závislá na vzdálenosti mezi geny v vvazebná nerovnováha ( linkage disequilibrium ) n - běžná v HLA systému n - určité kombinace alel se vyskytují častěji, než by se očekávalo na základě genový frekvencí vevoluční základ vazebné nerovnováhy je spekulativní, určité kombinace HLA alel asi poskytují v některých populacích určitou selekční výhodu n nNapř. HLA- A1 a HLA-B8 s genovými frekvencemi 0,16 a 0,1 v populaci. Očekávaná frekvence výskytu haplotypu HLA –A1, B8 v populaci by měla být 0,16x 0,1x100%= 1,6%. V některých kavkazských populacích frekvence tohoto haplotypu zdaleka přesahuje očekávanou frekvenci ( 8% ) n Nejčastější haplotypy v různých etnických skupinách n n African Asian Caucasian n Haplotype (freq.%) n 1.A30,B42,DR3 (1,67) A33,B58,DR3 (1.58) A1,B8,DR3 ( 5,18) 2. 2.A1,B8,DR3 (1,25) A33,B44,DR6 (1,46) A3,B7,DR2 (2,63) 3. 3.A3,B7,DR2 (0,76) A24,B52,DR2 (1,38) A2,B44,DR4 (2,15) 4. 4.A2,B44,DR4 (0,65) A2,B46,DR9 (1,35) A2,B7,DR2 (1,8) 5. 5.A33,B53,DR8 (0,63) A33,B47,DR7 (1,34) A29,B44,DR7 (1,47) • • • • • • • • • • • • • ♀ ♂ • a b c d • • • A2 A24 A1 A3 • B7 B44 B8 B27 • DR4 DR17 DR1 DR8 • • • a c a d b c b d • • • • • A2 A1 A2 A3 A24 A1 A24 A3 • B7 B8 B7 B27 B44 B8 B44 B27 • DR4 DR1 DR4 DR DR17 DR1 DR17 DR8 • • Dědičnost HLA haplotypů • Vznik nerekombinantních a rekombinantních HLA haplotypů • HLA a choroby v1967 – první zprávy o asociaci HLA systému s onemocněním u člověka v v1973 – objevena asociace HLA-B27 s ankylozující spondylitidou (m. Bechtěrev) v vnásledně byly studovány stovky onemocnění pro možnou asociaci onemocnění s HLA systémem v vu více než 50ti onemocnění byla prokázána statisticky významná HLA asociace n n Rysy HLA asociovaných chorob: v vkromě několika málo vyjímek, choroby asociované s HLA antigeny jsou nemaligní chronická onemocnění vpřevážně autoimunitní onemocnění vvětšina chorob je multifaktoriálních ( geny+ environmentální složka) vspouštěčem často environmentálním faktory (mikroorganismy, stres) n •Některé příklady asociace HLA alel s chorobou: • • Birdshot retinopathy -A29 RR=200 • •Ankylosing spondylitis -B27 81,8 • • Narcolepsy -DQB1*06:02 100 • • Psoriasis vulgaris -B13, Cw6 4,5 7,2 • • Celiac disease - DQB1*02, *03:02 13,3 • DQA1*03:01, *05 • Type I diabetes mellitus -DR3, 4, -DQ2,8 10 • • Multiple sclerosis -DR2, -DQ6 4 • • Rheumatoid arthritis -DR4 4 • •ANKYLOSING SPONDYLITIS (AS, M. BECHTĚREV) • vAsociace s HLA-B27 v vzánětlivá forma artritidy, postižení ve větší míře mladí muži v vpostižení začíná obvykle v dolní části páteře, kde zánět napadá kloubní spojení mezi pánví a páteří , nemoc se může postupně šířit nahoru a dolů ke kyčelním a kolenním kloubům. v vrůzný průběh onemocnění, může končit velmi vážnými deformitami v vprůběh onemocnění dlouhodobý v vostatní choroby asociované s HLA-B27 – Reiterova choroba (revmatické onem.,často vyvolávají chlamydie, trojice obtíží: neinf.zánět kloubů, moč.trubice a spojivek) v v Anterior uveitis (přední uveitida-zánět duhovky, řasnatého tělíska) - • • •TYPE I DIABETES MELLITUS ( IDDM ) • vsilná asociace s DQA1*05:01/DQB1*02:01 a DQA1*03:01/DQB1*03:02 v kavkazské populaci • DQA1*05:01/DQB1*02:01 u amerických černochů • DQA1*05:01/DQB1*03:02, DQA1*03:01/DQB1*04:01, DQA1*03:01/DQB1*03:03 u Japonců v vprotektivní účinek vůči IDDM je asociován s DQB1*06:02 (DQA1*01:02/DQB1*06:02 ) • vIDDM se vyvíjí postupně, dlouhá subklinická etapa spojená s postupujícím poškozením beta buněk Langerhansových ostrůvků pankreatu, které tvoří inzulin, klinický projev – zničeno asi 90% buněk v vza rozvoj onemocnění zodpovědno více faktorů – geny a negenetická složka ( infekce enteroviry = polioviry, coxsackieviry A, B, echoviry ) • vvětšina nákaz virem je asymptomatická • •CELIAC DISEASE (CD) • •-predispoziční haplotypy -DRB1*03- DQA1*05:01- DQB1*02:01 •-DRB1*07- DQA1*02:01- DQB1*02:02 •-DRB1*04 -DQA1*03:01-DQB1*03:02 v geneticky podmíněné autoimunitní onemocnění v v intolerance na gluten (lepek), trávicí soustava pacienta není schopna trávit potraviny obsahující lepek v vchronický zánět sliznice tenkého střeva, prevalence v ČR 1 : 200-250 obyv. • v pro vývoj onemocnění nutné 3 podmínky: • 1. genetické předpoklady • 2. konzumace stravy obsahující lepek • 3. spouštěč onemocnění ( stres, trauma, virová infekce ) • v dlouhodobé průjmy, únava, bolesti kostí, břicha, svalů, u dětí také problémy se zuby, růstem a vývojem v jediná známá léčba – celoživotní dodržování bezlepkové diety - - - - - - • • MULTIPLE SCLEROSIS (MS) • v slabší asociace s HLA alelami DRB1*15:01, DQB1*06:02 a DQA1*01:02 • v vliv faktory genetické i negenetické (vliv prostředí, neznámé imunologické procesy) vchronické zánětlivé demyelinizující onemocnění centrálného nervového systému s nejasnou etiologií a patogenezou - • • NARKOLEPSIE • vneurologické onemocnění • vhypersomnie – zvýšená denní spavost někdy doprovázená kataplexií (ochabnutí kosterního svalstva) • vpravděpodobně autoimunitní onemocnění s dědičným sklonem nastartované vnějším faktorem (streptokoková infekce) namířené proti hypocretinovým neuronům, které mají budivou funkci • HLA nomenklatura •1. Serologická definice HLA antigenů – maximálně číslicové 2 znaky 1. v antigeny základní – např. A9, A10, B51, B40, Cw3, DR2, DQ3…. v antigeny splitové (subtypy) - sdílejí společné sérologicky definované epitopy • např. A10→ A25, 26, 34 • B40→ B60, 61 • Cw3→ Cw9, 10 • DR2→ DR15, 16 • DQ3→ DQ7, 8, 9 vantigeny obecné – DR51, DR52, DR53 v vBw4, Bw6 specifity – nejedná se o genové produkty, ale o „public“ epitopy. Jsou to alternativní aminokyselinové sekvence přítomné na všech HLA-B molekulách a na HLA-A23, 24, 25, 32. v •V r. 1987 – 10th International Histocompatibility Workshop, přijata nomenklatura založená na následujících principech: v HLA= Hlavní histokompatibilní komplex člověka v A, B, C, DR, DQ, DP..…lokusy v číslo (A1, Cw3) = označení specifity molekuly (antigenu) • •2. Molekulárně-genetická definice HLA alel • v používá číslicové znaky dvou a vícemístné •př. HLA-A*02, *31, B*08, *44, C*02, *12, DRB1*04, *13, DQB1*07, *08 • - úroveň „low resolution“ •HLA-A*01:01, *02:02, B*07:01, *35:01, C*02:02, *03:03, DRB1*04:01, *13:05, DQB1*03:04, *03:05 • - úroveň „high resolution“ - vNěkdy více jak 4 znaky: •C*02:02:01, *02:02:02………alely se liší v tiché nukleotidové substituci na úrovni DNA, ne v aminokyselinové sekvenci na úrovni polypeptidu (tichá mutace) • A*24:02:01:01 7. a 8. pozice – polymorfismus v nekódující oblasti • A*24:02:01:02L „ low expressed“ allele • B*51:11N „ null“ allele •Duben 2010 – nová nomenklatura, k oddělování jednotlivých dvojčíslí v označení alel se budou používat dvojtečky. •Např.: B*0808N→B*08:08N • A*9201→A*02:101 • HLA I. třídy HLA II. třídy lokus počet alel lokus počet alel HLA-A 893 HLA-DRB 814 HLA-B 1431 HLA-DRA 3 HLA-C 569 HLA-DPB1 136 HLA-E 9 HLA-DPA1 28 HLA -F 21 HLA-DQB1 106 HLA-G 45 HLA-DQA1 35 • Polymorfismus genů HLA I. a II. třídy (www.ebi.ac.uk/imgt/hla/stats.html) Metody typizace HLA antigenů 1. serologické metody Complement –Dependent Cytotoxicity Assay ( CDC) = Lymfocytotoxický test ( LCT ) vlymfocyty typovaného jedince jsou nejdříve inkubovány se specifickými antiséry, která jsou rozkapána na mikrotitračních plotnách v vpřidáno králičí sérum jako zdroj komplementu v vvazba protilátky se specifickým HLA antigenem na membráně lymfocytu aktivuje komplement, který poškozuje buněčnou membránu v vvitální barvení (trypanová modř, eosin), mrtvé buňky se obarví v vmikroskopické hodnocení, hodnotí se procento obarvených (mrtvých) buněk, síla reakce -, 2, 4, 6, 8 vnehodnotitelný výsledek - 0 P1010737 P1010738 Obraz040 C:\Users\7767\Pictures\IMG_20150904_101456.jpg •2. molekulárně-genetické metody v80. léta, technika PCR ( polymerace chain reaction ) v90. léta, typizace HLA antigenů II. třídy vnásledně typizace HLA antigenů I. třídy •PCR – enzymatická metoda in vitro, která slouží k namnožení ( amplifikaci ) specifického úseku DNA vymezeného párem specifických primerů. •3 kroky – izolace DNA ( plná krev,bukání stěry, krevní skvrny, vlasové folikuly, parafínové tkáňové bloky) • • - amplifikace DNA ( PCR ) • - detekce PCR produktu • ADN_animation •Počet kopií DNA - 2n •n – počet cyklů (30 – 35) • ADN_animation •HLA typizace pomocí PCR metod •PCR – SSP (sequence – specific priming) PCR – SSO ( sequence – specific oligonukleotide probes ) • PCR – SBT (sequence based typing ) •Mikročipy, Luminex (průtokový alalyzátor), FluoGene ADN_animation C:\Users\7767\Pictures\IMG_20150904_101125.jpg •1. PCR – SSP vjednotlivé páry primerů určují jednu alelu nebo skupinu alel (alelově a skupinově specifické primery), rozlišení během PCR v vtolik primerových párů, aby mohly být amplifikovány a detekovány všechny známé alely daného lokusu • vPCR – SSP může být užita pro „low resolution“ nebo „ high resolution“ vHLA typizace „ low resolution“pro lokusy -A, -B, -DR, -DQ vyžaduje 95 – 100 primerových párů v„high resolution“ - následně po serologické nebo po „low resolution“ typizaci v v každé zkumavce tzv. interní kontrola amplifikace • v kontrola kontaminace – zkumavka obsahuje všechny reagencie pro PCR kromě templátové DNA vDetekce elektroforeticky, amplikony s menší molekulovou hmotností migrují v gelu rychleji než amplikony s vyšší molekulovou hmotností • v vizualizace – obarvení gelu fluorescenční barvou, která se inkorporuje do DNA, expozice gelu UV světlem na transiluminátoru vfotodokumentace •Princip SSP-PCR ADN_animation •úplná shoda – amplifikace proběhne •neshoda – amplifikace neproběhne C:\Users\7767\Pictures\IMG_20150904_100902.jpg snímek66 027 2. PCR – SSO (INNO – LiPA systém) vvyužití lokus – specifických primerů (značené biotinem) v v amplifikuje se celá oblast kódovaná jedním lokusem (exon 2,3) v vspecifické alely nebo skupiny alel jsou následně určeny reverzní hybridizací s oligonukleotidovými próbami (sondami) v v denaturace amplifikované DNA v DNA próby (sondy ) imobilizovány na nitrocelulózovém stripu v reverzní hybridizace denaturované DNA s DNA próbou na stripu v vvymytí nespecificky navázané DNA v vkonjugát (streptavidin + alkalická fosfatáza) v vsubstrát, je štěpen fosfatázou a dojde k vytvoření barevného precipitátu v v odečtení pozic barevných precipitátů, vyhodnocení počítačovým programem skenovat0002 3. PCR – SBT vamplifikace DNA fragmentu pomocí ddNTPs ( dideoxy nucleotide triphosphates, chybí 3´-OH skupina ), které fungují jako terminátory PCR reakce (použití pouze jednoho primeru) v jestliže ddNTPs značeny 4 různými fluorescenčními barvivy, PCR probíhá v 1 zkumavce a elfo v 1 linii vsekvenátor – probíhá kapilární elektroforéza, produkty rozdělovány podle velikosti (rozdíly v délce o 1 nukleotid), laserový paprsek snímá koncový fluorescenčně značený ddNTP vinterpretace výsledků pomocí softwaru q 4.Mikročipy vminiaturizace systému vna sklíčku naneseny stovky až tisíce oligonukleotidů vplně automatizovaný systém vkompletní HLA typizace na úrovni „high resolution“ během jedné analýzy snímek66 088 PCR–SSO typizace na analyzátoru Luminex Fluoroanalyzátor LUMINEX C:\Users\7767\Pictures\IMG_20150904_100208.jpg