Patofyziologie hemostázy a fibrinolýzy VL 12. 4. 2017 Hemostáza  Hemostáza je děj, který zabraňuje signifikantní ztrátě krve při poranění cévní stěny.  Interakce endotelu cévní stěny, destiček, koagulace a fibrinolýzy, jejímž cílem je rovnováha všech procesů, které pokud možno zabraňují ztrátě krve při poranění cévní stěny a zajišťují průchodnost cévního řečiště. Hemostáza Subendothelial matrix Platelets Hemostatic plug Fibrin Endothelial cell RBC WBC WBC Abnormální hemostáza  Excesivní koagulace vede k tvorbě trombu, který potenciálně může zastavit krevní proud v dané oblasti (obstrukce).  To se může stát především u imobilizovaných a hospitalizovaných nemocných.  V EU je podobným problémem trombembolická nemoc, která postihuje každoročně až milión osob. Excesivní krvácení vzniká naopak při neodstatku koagulačních faktorů. Tvorba trombu Fibrin Erytrocyty Destičky Poškození cévní stěny  Vede k těmto dějům:  Vazokonstrikce k omezení průtoku  Cirkulující destičky adherují na defekt v cévní stěně. Následně se aktivují a agregují, což je spojeno s aktivací koagulačních faktorů, která probíhá na jejich povrchu.  Aktivovaný trombin vede k odštěpení fibrinopeptidu A a B a tvorbě fibrinových monomerů. Ty jsou následně zpevněny příčnými vazbami pod vlivem aktivovaného faktoru XIII (aktivován trombinem). Adhesion GpIIb/IIIa Cesta aktivace destiček (1) GpIIb/IIIaGpIIb/IIIa Aggregation ADP Adrenaline Platelet Vystavený kolagen Endotel vWF KOLAGEN GpIIb/IIIaGpIIb/IIIa Aggregation ADP Adrenalin THROMBIN Cesta aktivace destiček (2) Agregace destiček Fibrinogen Vazné místo pro figrinogen Trombin Destička Herbert. Exp Opin Invest Drugs 1994;3:449-455. Koagulační kaskáda  Soubor reakcí proteáz zahrnující asi 30 různých proteinů.  Tyto reakce vedou ke konverzi fibrinogenu jako solubilního proteinu na nerozpustný fibrin.  Destičky a fibrin vytvářejí stabilní krevní zátku. Palta S et al., Indian J Anaesth, 58:515-523, 2014 Na buňkách založený model („cell-based model“)  Tento model identifikuje membrány buněk vystavujících tkáňový faktor (TF) a povrch destiček jako místa aktivace specifických koagulačních faktorů.  Tento model předkládá proces skládající se ze tří fází: iniciace, amplifikace a vlastní akce trombinu-tvorba zátky.  Iniciace = tvorba komplexu TF-FVIIa, která vede k aktivaci malého množství trombinu.  Propagace = aktivace destiček trombinem a tvorba komplexu FIXa-FVIIIa s následnou aktivací faktoru Xa.  Tvorba zátky= tvorba protrombinázového komplexu a tvorba velkého množství trombinu, což vede k tvorbě zátky. Iniciační fáze koagulace Palta S et al., Indian J Anaesth, 58:515-523, 2014 Iniciační fáze koagulace  Koagulační kaskáda je aktivována, pokud defekt cévní stěny umožní krvi vejít v kontakt s buňkami s tkáňovým faktorem.  Na membránu vázaný tkáňový faktor TF aktivuje FVII na VIIa, což vede k tvorbě komplexu TF-VIIa.  Tento komplex vázaný na membránu destiček aktivuje Faktor IX a Faktor X.  Faktor Xa konvertuje malé množství protrombinu (Faktor II) na trombin (Faktor IIa), který aktivuje Faktor V na FVa a Faktor VIII na FVIIIa. Propagační fáze koagulace Palta S et al., Indian J Anaesth, 58:515-523, 2014 Propagace koagulace  Na poškozeném povrchu cév se aktivuje faktor XII na XIIa. Ten aktivuje FXI na FXIa a ten dále FX na FXa.  Na povrchu aktivovaných destiček aktivuje FXa volný faktor FIX na FIXa, což potom tvoří tenázový komplex s FVIIIa.  Tento IXa-VIIIa komplex dále aktivuje FX na FXa, která spolu s FVa, fosfolipidy povrchu destiček a Ca++ vytváří protrombinový komplex. Propagace srážení: centrální role pro faktor Xa  Faktor Xa společně s aktivovaným Faktorem V (Va) jako kofaktorem podporují srážení tvorbou trombinu (Faktor IIa ) z protrombinu (Faktor II).  Faktor Xa je primárním místem propagace tohoto procesu; jedna molekula Faktoru Xa katalyzuje tvorbu asi 1000 molekul trombinu. Finální krok: tvorba fibrinu  V konečném kroku série proteázových reakcí, které vedou k tvorbě krevní sraženiny, trombin vyvolá konverzi solubilního fibrinogenu na nesolubilní fibrin.  Thrombin také aktivuje Faktor XIII, který stabilizuje sraženinu zkříženým provázáním fibrinu.  Výsledný fibrin vychytává a zadržuje další celulární komponenty srážení (destičky a erytrocyty). Fibrinolýza: znovuustavení krevního průtoku cévou  Fibrinolýza je proces, během kterého je rozštěpen fibrin. Vede tedy k rozpuštění zátky.  Plasminogen je prekurzor plasminu, který rozštěpí tyto fibrinové zátky.  Během tvorby zátky jsou aktivátory plasminogenu inhibovány. Během tvorby zátky dochází k sekreci tkáňových aktivátorů plasminogenu endoteliálními buňkami, protože začíná proces obnovení strukturální integrity cévní stěny.  Léky, které konvertují plasminogen na plasmin, se užívají k léčbě akutních, život ohrožujících trombotických nemocí, jako je infarkt myokardu. Fibrinolýza Palta S et al., Indian J Anaesth, 58:515-523, 2014 Přirozené inhibitory koagulace  Antitrombin (dříve AT III) – vyvazuje aktivované vitamin K dependentní koagulační faktory (aktivován heparinem)  „Tissue factor pathway inhibitor“ – produkován endoteliálními buňkami. Inhibuje TF-VIIa komplex  „Protein Z dependent protease inhibitor/ protein Z (PZI)“ produkován játry. Inhibuje FXa v přítomnosti PZ a Ca++ Přirozené inhibitory koagulace  Cesta proteinu C – vyvazuje aktivované proteiny Va a VIIIa poté, co je aktivován trombinem, s proteinem S a fosfolipidy jako kofaktory.  Skládá se ze 4 klíčových složek:  protein C (aktivovaný protein C = APC),  trombomodulin (zabraňuje srážení na nepoškozeném endotelu vyvazováním trombinu),  receptor pro endoteliální protein C (pomáhá aktivovat protein C),  protein S – produkován endoteliálními buňkami. V krvi existuje volný (40%) a vázaný (60% ve vazbě na C4b-vazný protein). Volná forma pomáhá deaktivovat aktivované proteiny V a VIII; vázaná forma funguje jako inhibitor komplementu a je upregulována u zánětlivých stavů, což redukuje hladiny proteinu S a to vede k prokoagulačnímu stavu. BMJ. 1998 Aug 22; 317(7157): 520–523. Koagulační faktory  Neaktivované-po syntéze v játrech  Postranslačně upravené vitaminem K –vitamin K dependentní koagulační faktory = serin proteázy  Aktivované –aktivované serin proteázy, další aktivované faktory (Va, VIIIa) Krvácivé nemoci vrozené  Von Willebrandova nemoc  Hemofilie A  Hemofilie B  Hemofilie C  Deficit faktoru V  Deficit faktoru VIII  Deficit faktoru VII  Deficit faktoru XIII  Deficit protrombinu  Afibrinogenémie Krvácivé nemoci získané  Konsumpční koagulopatie  DIC-diseminovaná intravaskulární koagulace  Mikroangiopatické hemolytické anemie  Deficit vitaminu K  Nemoci jater Trombotické nemoci (trombofilie) vrozené  Hereditání trombofilie  Deficit AT III  Deficit proteinu C  Deficit proteinu S  Faktor V Leiden  Mutace v genu pro protrombin (20210) Trombotické nemoci (trombofilie) získané  Sy antifosfolipidových protilátek  Zvýšené hladiny faktorů VIII, IX, XI a fibrinogenu  Defekty fibrinolýzy Trombóza — častá a potenciálně život ohrožující situace  Hraje roli během srdečních příhod, IM, kardioembolické příhody u pacientů s fibrilací síní a u venózního trombembolizmu (VTE).  Posttrombotický syndrom a plicní hypertenze.  Tromboprofylaxe VTE: častá komplikace velkých ortopedických operací  VTE nejčastější komplikace u náhrad kyčle a kolena.  Nejčastější příčina reoperace DVT: hluboká žilní trombóza  Náhrada velkých kloubů  Rakoviny  Koagulopatie  Dlouhodobá hospitalizace  Velké riziko plicní embolizace   AIDS, rakovina prsu, prostaty, polytraumata způsobená dopravními nehodami  LMWH („Low Molecular Weight“ Heparin)  Krvácení  Trombocytopenia  Hypersenzitivita Heparin/LMWH—rizika Heparin  Krvácení  Trombocytopenie  Osteoporóza (vitamin K2)  Hypersenzitivita LMWH  LMWH je eliminován zejména ledvinami, což je riziko pro pacienty s postižením ledvin.  LMWH se získává z vysoce sulfátovaného polysacharidu z prasečí slizniční tkáně. Depolymerizací tohoto substrátu vzniká směs fragmentů LMWH o délce 6-22 cukernatých zbytků. Warfarin—Mechanismus účinku Vitamin K Warfarin Synthesis of Dysfunctional Coagulation Factors VII IX X II Vitamin K Utilization Reduced Warfarin—nežádoucí efekty Fatální nebo nefatální tkáňové nebo orgánové krvácení Nekróza kůže nebo dalších orgánů Systémová cholesterová mikroembolizace Alopecie Purple toes syndrome, urticaria, dermatitis including bullous eruptions Vitamin K a vaskulární kalcifikace  U pacientů s chronickým onemocněním ledvin a s endstage chronickým renálním selháním je typický výskyt renální osteodystrofie a akcelerované aterosklerózy.  Vitamin K a vitamin K-dependentní proteiny hrají zásadní roli v prevenci ektopické kalcifikace: jsou to zejména osteokalcin (regulující mineralizaci kostí) a matrix-Gla protein (MGP, místní inhibitor kalcifikace cévní stěny). Deficit vitaminu K (warfarin?) mění jejich fyziologickou funkcii a zřejmě zodpovídá za demineralizaci kostí a následnou kalcifikaci cévní stěny (tzv. kalcifikační paradox). Z tohoto důvodu riskantní dlouhodobá aplikace warfarinu u pacientů s chronickým renálním onemocněním, chronickým renálním selháním (dialýza). Int J Artif Organs. 2009 Feb;32(2):67-74. Curr Opin Pharmacol. 2016 Apr;27:38-42. doi: 10.1016/j.coph.2016.01.008. Epub 2016 Feb 15. Nová orální antikoagulancia (NOAC) Koagulační testy  Screeningové testy  Krvácivost  Počet destiček  Protrombinový čas Quickův (PT)  Parciální tromboplastinový čas (PTT)  Trombinový čas (TT)  Specifické testy Sampling  Venous blood  Excessive stress and exercise cause changes in blood clotting. and fibrinolysis.  Whenever possible, venous samples should be collected without a pressure cuff (to avoid haemoconcentration, increase of fibrinolysis, platelet release, and activation of some clotting factors.  To minimize the effect of contact activation plastic or polypropylene, siliconized glass, syringes and containers should be used.  Thoroughly mixing the blood with the anticoagulant by inverting the containers several time.  The sample should be brought to the laboratory as soon as possible.  Labeling the patient sample is very important. Sampling  Anticoagulant trisodium citrate 3.2 % in a ratio of 1 : 9.  Time of sample collection is very important factor in the interpretation of results.  Centrifugation and preparation of platelets poor plasma - 4000 rpm in a cooling centrifuge.  P.T & Factor VII  kept at room temperature.  Other assays  at 4oC.  Testing should preferably be completed within 2 hours of the collection. BLEEDING TIME (=krvácivost)  Time taken for bleeding to cease from a small superficial wound  Affected by - Platelet count and function - Vessel wall - Normal range Ivy’s method: 2-7 min PLATELET COUNT  Normal platelet count = 150-400x109lL  A part of complete blood picture (CBC)  Performed by electronic counters or manually (inherent error) PROTHROMBIN TIME  Indicates the overall efficiency of pathway of blood coagulation (FVII, FII, FV, X)  Normal range: 10-14 sec PROTHROMBIN TIME  Causes of prolonged PT - Liver disease - Vit K deficiency (FII, V, VII, IX are Vit k dependent) - Deficiency of factors involved in extrinsic pathway - DIC - Oral anticoagulants PARTIAL THROMBOPLASTIN  Indicates the overall efficiency of pathway of blood coagulation (FVIII, FIX, FXI, FXII, FII, FV, X)  Normal range: 30-40 sec PARTIAL THROMBOPLASTIN  Causes of prolonged PTT - Deficiency of factors involved in intrinsic pathway (coagulation factors other than FVII) - Liver disease - DIC - Massive transfusion (labile FV, FVIII) - Heparin PT & PTT  Prolonged PT + normal PTT= extrinsic pathway defect  Prolonged PTT + normal PT= intrinsic pathway defect  Prolonged PT and PTT= common pathway defect or combined factor deficiencies Nemoci spojené s krvácením  Abnormální krvácení je způsobeno - Vaskulárními nemocemi - Trombocytopénií (  počtu destiček) - Defektem funkce destiček (kvalitativní defekt) - Koagulačními nemocemi Vaskulitidy  Typy krvácení: purpura  Příčiny…… - Screening tests for hemostasis: - BT: prolonged - Platelet count: normal - - PT, PTT, TT: normal Trombocytopénie  Počet destiček pod 150x109/L  Příčiny:  Vrozené  Získané  snížení produkce  zvýšená destrukce (ITP)  splenická sekvestrace (hypersplenism) Idiopathická Trombocytopenická Purpura (ITP)  ITP je imunní trombocytopenie způsobená tvorbou protilátek proti destičkám a bazální membráně megakaryocytů.  klinický obraz: spontánně krvácející purpurické erupce.  BT: prolonged  Platelet count: thrombocytopenia  PT,PTT: normal  BM: increased megakaryocytes with poor platelet separation Kvalitativní destičkové defekty  Defekt funkce a normální počet  Příčiny: - Hereditární (Glanzmannova nemoc, snydrom Bernard-Soulierův) - Získané (léky jako aspirin, uremia) Kvalitativní defekty destiček  Klinický obraz: spontánní krvácející purpurické erupce  BT: prodloužený  Platelet count: normální nebo lehce snížený  PT,PTT, TT: normální  Destičková funkce: abnormální, v závislosti na defektu Nemoci s poruchou koagulace  Vrozené  Hemofilie A  Hemofilie B  Von Willebrandova nemoc - Získané  Nemoci jater  DIC  inhibitory Hemofilie A  Nemoc vázaná na X-chromosom  Kvantitativní nebo kvalitativní nemoc faktoru VIII  Screeningové testy:  BT: normální  Platelet count: normální  PT: normální  PTT: prolonged  Specifickýtest: FVIII assay: snížená aktivita (a) Factor VIII synthesis. (b) Hemofilia A has a defect synthesis of VIIIc. (c) von Willebrand ´s disease has a reducted synthesis of vWF Hemofilie B  Ve srovnání s hemofilií A - Méně častá - Stejné příznaky - Stejné výsledky screeningových testů - Specifický test: FIX assay: snížená aktivita Von Willebrandova nemoc  Autosomálně dominantní  Kvantitativní nebo kvalitativní problém vWF  Von Willebrandův faktor funguje jako nosič pro Faktor VIII  Sám funguje jako podstatný kofaktor destičkové adhese a agregace. Von Willebrand Disease  Screening tests:  BT : prolonged.  Platelet count: normal  PT: normal  PTT: prolonged  Specific tests:  Platelet aggregation: defective with ristocetin  FVIII assay: decreased activity  vWF antigen : reduced DIC (disseminated intravascular coagulation)  Uvolnění tkáňového faktoru, TF.  TF je exprimován na mnoha typech buněk (endoteliální, makrofágy, monocyty).  Kontakt s krví po poškození cévní stěny (efekty cytokinů a endotoxinů).  TF se váže na koagulační faktory, což vede k jejich aktivaci. Disseminovaná intravaskulární koagulace=DIC  V důsledku extenzivní koagulace a fibrinolýzy dochází k vyčerpání koagulačních faktorů s masivním krvácením do intersticia.  Příčiny: infekce, malignity, porod, porodnické komplikace, nemoci jater DIC - etiopatogeneze  Významná role „damage associated molecular patterns“ (DAMPs): na základě buněčné aktivace nebo smrti hemopoetických a parenchymálních buněk dochází k uvolnění extracelulární volné DNA a proteinů, které se váží na DNA (např. histonů a „high mobility group box 1 proteinů“ [HMGB1]) do cirkulace. Tento proces je vysoce regulován mimo jiné serin proteázami, jako je „factor VII-activating protease“ (FSAP) a DNase1. DIC - etiopatogeneze  Circulující cell-free DNA je schopna indukovat destičkovou agregaci, podporovat aktivaci sekundární hemostázy, inhibovat fibrinolýzu a přímo interferovat se stabilitou trombů.  Cell-free DNA ve tkáni nebo uvolňovaná do cirkulace po aktivaci neutrofilů ve formě neutrofilních extracelulárních „traps“ (NETs) jsou silně cytotoxické a prokoagulační.  Také na DNA se vážící proteiny jako histony a HMGB1 jsou silně prokoagulační a účastní se v patogeneze DIC. Diagnóza DIC  BT (bleeding time=krvácivost): prolonged  Platelet count: decreased  PT (prothrombin time): prolonged  PTT (partial prothrombin time): prolonged  TT (thrombin time): prolonged  Fibrinogen level: reduced  FDPs (D dimer): increased  Red cell fragmentation in the blood film BT PT PTT Platelet count Platelet function Other tests ITP P N N Glanzman P N N N Defect agreg Hemof A N N P N FVIII assay Hemof B N N P N FIX assay vWD P N P N Defect agreg FVIII, vWF DIC P P P Fibrinogen FDPs Díky za pozornost