Imunoblot
Imunoblot
• používá se pro detekci specif. protilátek v séru pacienta (např.
autoprotilátek, specifických protilátek proti patogenům)
• v klasickém imunoblotu (westernblot) se nejprve antigeny
rozdělí pomocí elektroforézy v gelu (SDS PAGE)
• poté se přesají (blotting) na nitrocelulózovou membránu (také
pomocí migrace v elektrickém poli)
• následuje vlastní vyšetření séra na přítomnost protilátek:
- k antigenům na nitrocelulózové membráně se přidá sérum
pacienta, pokud jsou přítomny protilátky, naváží se na příslušné
antigeny
- k vizualizaci pozitivního výsledku se využívá sekundární
protilátka proti lidským imunoglobulinům s navázanou značkou
(nejčasteji enzymem – barevná reakce)
Imunodot, line assay
• modifikací klasického imunoblotu (westernblotu) jsou
imunodot (dot blot) a line assay, kdy jsou na určená místa
nitrocelulózové membrány naneseny jednotlivé antigeny v
rovnoměrných vzdálenostech v podobě teček nebo proužků
• antigeny jsou v tomto případě izolované a přečištěné nativní
proteiny nebo rekombinantní proteiny
• ve všech případech se jedná o multiplexové techniky, kdy se
při jednom vyšetření testuje přítomnost více různých
protilátek
Postup pro imunoblot
• výrobce dodává nitrocelulózové stripy s nanesenými antigeny
• vaničku se stripy vložit do přístroje AutoBlot
• přidat blokovací roztok, inkubace – zabránění nespecifických
vazeb
• promytí
• do příslušných žlábků přidat sérum pacienta, inkubace
• promytí
• přidat konjugát (sek. protilátka značená enzymem)
• promytí
• inkubace se substrátem (u pozitivních vzorků dojde ke zbarvení)
• stop činidlo
• stripy osušit
http://www.wieslab.se/diagnostic-
services/index.php?langId=1&headId=72&subId=92&pageId=126
AutoBlot 3000
Vyhodnocení vyšetření
anti- nukleárních
protilátek programem
AID Western Blot
Scanner (Autoimmun
Diagnostika GmbH)
Na obrázku vidíme
pacienta se silnou
pozitivitou anti-SS-A
a pozitivitou anti-SS-B
protilátek.