Enzymy Struktura, názvosloví, třídění enzymů © Biochemický ústav JG, JD 2018 Enzymy = biokatalyzátory •zvyšují rychlost reakce •během reakce nejsou měněny •proteinové povahy s kovalentně vázanou prostetickou skupinou (kov) •oligomerní/ multienzymové komplexy / asociované s membránami atd. •tvoří izoformy - různá distribuce v těle i v buňce •specifické (typ reakce, substrát), vysoce účinné •fungují za mírných podmínek (pH optimum u intracelulárních enzymů většinou ~ 7, výjimky v GIT, pepsin 1–2, trypsin ~ 8) •in vivo - mohou být regulovány (aktivita enzymu, množství enzymu) •in vitro - citlivé na vnější podmínky (teplota – nad 50 °C denaturace, pH) •Ribozymy – RNA vykazující katalytickou aktivitu •Prinip účinku: snižují aktivační energii 2 Specifičnost enzymu je dvojího typu •Účinková •z možných reakcí substrátu katalyzují pouze jedinou • • •Substrátová •z možných substrátů pro určitou reakci si vybírají jediný (nebo jedinou skupinu substrátů) •často stereospecifické 3 Struktura enzymů • Bílkovina + neproteinová struktura = enzym •Neproteinová struktura: •Kofaktor = Zn2+; Mo2+; Fe2+; Mg2+ (kov) •Koenzym = malá organická molekula (často deriváty vitamínů B) •Apoenzym = samotná bílkovina, enzymově neúčinná •Kofaktor / koenzym sám o sobě není účinný • •Aktivní místo enzymu: •místo kam se napojuje substrát •Tvořeno AK zbytky ↔ je ovlivnitelné pH •Komplex enzym-substrát (ES) •Nevazebné interakce • • 4 Mechanismus účinku enzymu •substrát se musí navázat na aktivní místo enzymu •místo je skutečně aktivní •flexibilita proteinu umožňuje indukované přizpůsobení konformace, která odpovídá substrátu •vazba substrátu do aktivního místa vyvolá odpovídající konformační změnu molekuly enzymu (indukované přizpůsobení) •vytvoří se komplex enzym-substrát (ES) • 5 Katalytický mechanismus závisí na počtu substrátů •Monosubstrátové reakce • S + E ⇄ {ES.......EP} ⇄ P + E • •Dvousubstrátové reakce (častější) • E + SA + SB ⇄ {ESAB.......EPAB} ⇄ PA + PB + E • • Sekvenční reakce: • oba substráty se navážou na enzym a pak proběhne chemická přeměna a uvolnění produktů • Ping-pongové reakce: • typické pro aminotransferasy, jeden substrát se naváže, přemění a uvolní, pak totéž s druhým substrátem • 6 Názvosloví enzymů •Triviální název: • pepsin •trypsin •Obecný název: •laktátdehydrogenáza •Kreatinkináza •glukokináza •Systematický název: •Laktát:NAD+ oxidoreduktáza = laktátdehydrogenáza •L-alanin:2-oxoglutarát-aminotransferáza = alaninaminotransferáza 7 Klasifikace enzymů 8 EC1 Oxidoreduktázy •katalyzují oxidaci nebo redukci substrátu • podtřídy: •dehydrogenázy katalyzují transfer 2 H atomů •oxygenázy katalyzují zabudování jednoho nebo dvou O atomů do substrátu (monooxygenázy, dioxygenázy) •oxidázy katalyzují transfer elektronů mezi substráty • (cytochrom-c-oxidáza, ferroxidáza) •peroxidázy katalyzují rozklad peroxidů • 9 EC 2 Transferázy •katalyzují transfer skupiny za jednoho substrátu na druhý • Podtřídy: •aminotransferázy (alaninaminotransferáza – ALT, aspartátaminotransferáza – AST) •methyltransferázy •glukosyltransferázy •kinázy – fosforylace substrátů = transfer fosforylu PO32– z ATP na substrát • (hexokinázy, proteinkinázy) •DNA-polymeráza – účastní se replikace (prodloužení 3’-konce DNA) (DNA)n + dNTP ® (DNA)n+1 + PPi • 10 EC 3 Hydrolázy •katalyzují hydrolytické štěpení esterů, glykosidů, amidů, peptidů apod. • podtřídy: •esterázy (lipázy, fosfolipázy, ribonukleázy, fosfatázy) •glykosidázy (sacharáza, maltáza, laktáza, amyláza) •proteinázy a peptidázy (pepsin, trypsin, kathepsiny, kaspázy/apoptosa, dipeptidázy, karboxypeptidázy, aminopeptidázy) •amidázy (glutamináza, asparagináza) •ATPázy (štěpí anhydridové vazby v ATP), např. helikáza •nukleázy (štěpí nukleové kyseliny – fosfodiesterové vazby) • 11 EC 4 Lyázy •katalyzují nehydrolytické štěpení nebo vznik vazeb C–C, C–O, C–N, C–S odstraněním nebo přidáním malé molekuly jako H2O, CO2, NH3 •podtřídy: •amoniak lyázy (histidinamoniaklyáza: histidin ® urokanát + NH3) •dekarboxylázy aminokyselin (aminokyselina ® amin + CO2) •aldolázy (štěpení nebo vznik aldolu) •dehydratázy/hydratázy (karbonátdehydratáza: CO2 + H2O ⇄ H2CO3) • 12 EC 5 Isomerázy •katalyzují intramolekulární přesmyky, příklady: •epimerázy •racemázy •mutázy •topoisomeráza (replikace DNA) má dvě enzymové aktivity, nukleázovou a ligázovou (superstočená DNA ® relaxovaná DNA) • 13 EC 6 Ligázy •katalyzují vznik vazeb C–C, C–O, C–N za současného štěpení ATP •Potřídy: •karboxylázy •synthetázy • (glutaminsynthetáza: glutamát + ATP + NH3 ® glutamin + ADP + Pi) •DNA-ligáza: (dNMP)n + (dNMP)m + ATP ® (dNMP)n+m + AMP + PPi • dNMP = deoxyribonukleosidmonofosfát • 14 Kinetika enzymově katalyzovaných reakcí 15 •16 •16 •Rychlost enzymové reakce •reakce: S ¾® P (S = substrát, P = produkt) •definice reakční rychlosti: • •17 •17 •Z kinetické křivky se zjistí rychlost •18 Počáteční rychlost vo •rychlost změřená dříve než vznikne významnější množství produktu •nejvyšší hodnota rychlosti •není ovlivněna úbytkem substrátu ani vratnou přeměnou produktu •stanovuje se z kinetických křivek •19 Na čem závisí rychlost reakce? •na koncentraci substrátu [S] .... kinetická rovnice •na teplotě ... Arrheniova rovnice •u reaktantů v plynné fázi (g) na tlaku •na přítomnosti efektoru (katalyzátoru, inhibitoru) • katalyzátory snižují aktivační energii (EA) •U enzymových reakcí navíc: •koncentrace enzymu [E] •pH •20 Kinetická rovnice pro reakci 1. řádu •v = k [S] = k [S]1 Þ reakce 1. řádu • •k = rychlostní konstanta •21 •Kinetické křivky pro reakci 1. řádu •[P] •t •[S] •t •rovnováha •během reakce: koncentrace substrátu klesá koncentrace produktu vzrůstá •z kinetické křivky se zjišťuje rychlost •Okamžitá rychlost vx v čase tx se rovná směrnici tečny ke křivce v daném čase. substrát produkt •22 Kinetická rovnice pro reakci 0. řádu •rychlost reakce nezávisí na koncentraci substrátu •v = k [S]0 = k . 1 = k = konstanta •nastává při velkém nadbytku S, takže jeho úbytek je prakticky zanedbatelný Kinetické křivky pro reakci 0. řádu 23 [S] substát S •24 Počáteční rychlost vo •rychlost změřená dříve než vznikne významnější množství produktu •nejvyšší hodnota rychlosti, protože není ovlivněna úbytkem substrátu ani vratnou přeměnou produktu •stanovuje se z kinetických křivek •25 Závislost vo na koncentraci substrátu •rovnice Michaelise a Mentenové, pro jednosubstrátové reakce • •Vmax = maximální rychlost (pro danou koncentraci enzymu) •Km = Michaelisova konstanta •Km je koncentrace substrátu, při níž reakce probíhá polovinou maximální rychlosti Vmax , při této koncentraci je enzym z 50 % nasycen •Km je nepřímo úměrná afinitě enzymu pro daný substrát •existuje-li více strukturně podobných substrátů, ten který má nejmenší Km se považuje za nejpřirozenější pro daný enzym •pro měření aktivity enzymu by měla být koncentrace substrátu > 100 Km • •26 Grafickým vyjádřením předchozí rovnice je saturační křivka Různé oblasti saturační křivky 27 [S] << Km [S] >> Km [S] = Km •28 Dvě oblasti v saturačním grafu •29 Rozlišujte •Kinetická křivka •časový záznam jedné reakce •závislost [P] nebo [S] na čase (t) •Saturační křivka •závislost získaná z mnoha stejných reakcí •závislost vo na [S] •30 Faktory ovlivňující rychlost enzymové reakce Teplota S rostoucí teplotou rychlost reakce vzrůstá, optimální je kolem 40 °C, při vyšších teplotách rychlost klesá – denaturace enzymu pH Ovlivňuje stav ionizace skupin v aktivním místě enzymu a jeho okolí konstatní pH v tělesných tekutinách udržují pufrační systémy každý enzym má pH optimum, intracelulární enzymy kolem pH 7 trávicí enzymy mají odlišné: pepsin pH 2 Aktivátory Umožňují nebo urychlují enzymovou reakci Často ionty dvojmocných kovů: Ca2+, Mg2+, Zn2+, Mn2+ Inhibitory Zpomalují nebo zastavují enzymovou reakci Kompetitivní: podobné substrátu, soutěží o aktivní místo Jiné: např. ionty těžkých kovů, pevně se vážou na důležité skupiny Koncentrace substrátu Při vysoké koncentraci substrátu je enzym nasycen, reakce probíhá maximální rychlostí, graficky vyjadřuje saturační křivka Kofaktory 31 •32 Kofaktory enzymů •nízkomolekulární neproteinové sloučeniny •mnohé odvozeny od vitaminů B komplexu •mnohé mají charakter nukleotidů •přenášejí 2 H nebo e- (spolupracují s oxidoreduktázami) •přenášejí skupiny (spolupracují s transferázami) •pevně (kovalentně) vázané se nazývají prostetické skupiny •volně vázané se nazývají kosubstráty •33 Tři různé složky v enzymové reakci •kofaktormodif •enzym •substrát •kofaktor •⇄ •produkt •+ •+ 1.substrát(y) 2.kofaktor 3.enzym katalyzuje (= koordinuje + urychluje) reakci • •přímo spolu reagují •Poznámky: • substrát může být jeden nebo dva (dehydrogenace × transaminace) • substrát může být nízko / vysokomolekulární (hexokinasa × proteinkinasa) • některé reakce probíhají bez kofaktoru (např. hydrolýzy) • reakce může vratná i nevratná (dehydrogenace × dekarboxylace) •34 Oxidovaná forma Redukovaná forma Funkce kofaktoru NAD+ NADP+ FAD Dihydrobiopterin (BH2) Molybdopterinoxid Lipoát (-S-S-) Ubichinon (Q) Hem-Fe3+ Dehydroaskorbát Glutathionoxid (G-S-S-G) NADH+H+ NADPH+H+ FADH2 tetrahydrobiopterin (BH4) molybdopterinred dihydrolipoát (2 -SH) ubichinol (QH2) hem-Fe2+ askorbát glutathionred (GSH) NAD+ akceptor 2 H NADPH+H+ donor 2 H FAD akceptor 2 H BH4 donor 2 H přenos elektronů antioxidant / přenos acylu přenos 2 elektronů a 2 H+ přenos 1 elektronu přenos 2 elektronů a 2 H+ 2 GSH donorem 2 H •Kofaktory oxidoreduktas •35 NAD+ je dehydrogenační kofaktor, derivát nikotinamidu (vitamin B3) •nikotinamidadenindinukleotid •kofaktor dehydrogenas •odnímá 2H ze substrátu •jeden se jako hydridový anion H- aduje do p-polohy pyridiniového kruhu •NAD+ + H- = NADH = ekvivalent dvou elektronů •druhý se jako proton H+ váže na enzym •2 H = H– + H+ •36 Struktura NAD+ •37 •Redoxní pár kofaktoru •oxidovaná forma NAD+ redukovaná forma NADH •aromatický kruh aromaticita zcela porušena •čtyřvazný dusík trojvazný dusík •kladný náboj na dusíku neutrální sloučenina •UV absorpce při 260 nm UV absorpce při 260 a 340 nm • vysoký obsah energie • •! WARBUMCH •38 Dehydrogenace působením NAD+ •substrát ztrácí 2 atomy H ze skupin: •primární alkoholová skupina -CH2-OH •sekundární alkoholová skupina >CH-OH •sekundární aminová skupina >CH-NH2 •vzniká dvojná vazba (C=O, C=N) • Substrát Produkt primární alkohol sekundární alkohol aldehyd hydrát hemiacetal cyklický hemiacetal hydroxykyselina aminokyselina aldehyd keton karboxylová kyselina ester lakton oxokyselina iminokyselina •39 Dehydrogenace ethanolu (alkoholdehydrogenáza) •40 Redukovaný kofaktor NADPH+H+ je hydrogenační činidlo •donor 2H při hydrogenaci •kofaktor redukčních syntéz (MK, cholesterol) •regenerace glutathionu (GSH) v erytrocytech •kofaktor hydroxylačních reakcí: • cholesterol ® ® žlučové kyseliny • kalciol ® ® kalcitriol • xenobiotikum ® hydroxylované xenobiotikum •obecné schéma hydroxylace: •R-H + O2 + NADPH+H+ ® R-OH + H2O + NADP+ •41 FAD je dehydrogenační kofaktor derivát riboflavinu (vitamin B2) •flavinadenindinukleotid •kofaktor flavinových dehydrogenáz •dehydrogenace -CH2-CH2- skupiny •2H se vážou na dva dusíky riboflavinu •FAD + 2H ® FADH2 • •42 Struktura FAD •dimethylisoalloxazin = flavin •ribitol •adenin •ribosa •difosfát • • •43 •Redoxní pár kofaktoru •oxidovaná forma FAD redukovaná forma FADH2 •aromatický systém aromaticita částečně porušena •neutrální sloučenina neutrální sloučenina • vysoký obsah energie • •! •44 Tetrahydrobiopterin (BH4) je kofaktor hydroxylačních reakcí •fenylalanin •tyrosin Monoxygenázová reakce •45 Vitamin Kofaktor Přenášená skupina Pyridoxin (B6) --- --- Biotin (vitamin H) Pantothenová kys. (B5) --- --- Listová kys. (folát; B9) Kyanokobalamin (B12) Thiamin (B1) pyridoxalfosfát ATP PAPS karboxybiotin CoA-SH dihydrolipoát SAM tetrahydrofolát methylkobalamin thiamindifosfát -NH2 (transaminace) -PO32- (fosforyl) -SO32- CO2 acyl acyl -CH3 C1 skupiny (z aminokyselin) -CH3 zbytek některých oxokyselin •Vitaminy a kofaktory transferas •46 Pyridoxalfosfát je kofaktor transaminace a dekarboxylace AK •aldimin •(Schiffova báze) •- H2O •transaminace •dekarboxylace •47 ATP je kofaktor kináz – fosforylační činidlo •N-glykosidová • vazba •ester •anhydrid •48 Fosforylace substrátu •49 Karboxybiotin je kofaktor karboxylačních reakcí •+ •50 Koenzym A •pantoová kyselina • •pantothenová kyselina • •3’-fosfoADP •přenáší acyly vázané na atom síry •thioesterová vazba •acyl-CoA je aktivovaný acyl •51 S-Adenosylmethionin (SAM) •„aktivní methyl“, trojvazná síra Þ sulfoniový kation •kofaktor methylačních reakcí: • ethanolamin → cholin (trojnásobná methylace) • guanidinacetát → kreatin • noradrenalin → adrenalin ..... a řada dalších •z methioninu vzniká homocystein •pro remethylaci homocysteinu je nutný methyl-FH4 a B12 kofaktor •52 Tetrahydrofolát H4F •amid •5 •6 •7 •8 •Přenáší 1C zbytky •Přijímána ve formě kyseliny listové, která je v těle je hydrogenována na 5,6,7,8-tetrahydrofolát (H4F) Kyselina listová Tetrahydrofolát •53 C1 skupiny přenášené tetrahydrofolátem Oxid. č. C Vzorec Název Metabolický původ / Využití -III -CH3 methyl redukce methylen-H4F (ze serinu, glycinu) (N-CH2-N)H4F + NADPH+H+ ® HN(H4F)N-CH3 + NADP+ methyl-H4F spolupracuje s B12 při methylaci homocysteinu -II -CH2- methylen katabolismus serinu a glycinu syntéza dTMP ® DNA dUMP + methylen-H4F ® dTMP + H2F (thymidylátsynthasa) H2F + NADPH+H+ ® H4F + NADP+ (dihydrofolátreduktasa) -I -CH= methenyl (methin) meziprodukt, deaminace formimino-H4F (z histidinu) konverze na formyl-H4F, syntéza purinových bází +I -CH=O formyl katabolismus tryptofanu ® formiát ® formyl-H4F syntéza purinových bází +I -CH=NH iminoformyl katabolismus histidinu (FIGLU – formiminoglutamát) •54 b12 •B12 vitamin je kyano nebo hydroxokobalamin •R = CN nebo OH •korinový cyklus •hydroxokobalamin - terapie otravy kyanidy •váže kyanidové anionty na netoxický •kyanokobalamin •55 B12 kofaktor je methyl nebo deoxyadenosylkobalamin 1.homocystein ® methionin 2. 2.homocystein ® ® propionyl-CoA ® ® sukcinyl-CoA 3. •B12 •H4F / B12 •je nutný pro dvě reakce v těle: •56 Thiamindifosfát (TDP) je kofaktor •Oxidační dekarboxylace některých 2-oxokyselin •pyruvát ® acetyl-CoA •2-oxoglutarát ® sukcinyl-CoA (CC) •2-oxokyseliny z katabolismu Val, Leu, Ile • • • • • •Transketolasové reakce v pentosovém cyklu •ribosa-5-P + xylulosa-5-P ⇄ glyceraldehyd-3-P + sedoheptulosa-7-P •xylulosa-5-P + erythrosa-4-P ⇄ fruktosa-6-P + glyceraldehyd-3-P • •přenos na •lipoát a CoA •57 Kreatinkinasa (CK) je dimer a tvoří tři izoenzymy Izoenzym Výskyt Procento celk. aktivity Zvýšení CK-MM CK-MB CK-BB svaly srdce mozek 94-96 % do 6 % stopy svalové trauma infarkt poranění mozku •Izoenzymy/Izoformy •katalyzují stejnou reakci •liší se primární strukturou a tedy fyzikálně-chemickými a kinetickými vlastnostmi •mají často různou tkáňovou distribuci •stanovují se elektroforézou nebo imunochemicky •