Enzymy II © Biochemický ústav LF MU 2018 (JG, JD) Katalytická aktivita enzymu •Udává jaké látkové množství substrátu bylo přeměněno na produkt za určitou časovou jednotku •SI Jednotka •kat = [mol/s] •μkat = 10-6 kat = μmol/s •nkat = 10-9 kat = mmol/s •Mezinárodní jednotka •U/IU … přeměna 1μmolu substrátu za 1 minutu •Přepočet … 1 μkat = 60 U • 1U = 16,6 nkat • 2 Katalytická koncentrace enzymu •Je katalytická aktivita vztažená na objem biologické tekutiny (krevní sérum/plazma) •SI jednotka •Kat/l … mol/l.s •Mezinárodní jednotka •U/I … μmol/min.l •Přepočet … 1U/I = 16,6 nkat/l • 3 Ovlivnění katalytické aktivity enzymu •Teplota •Teplotní optimum obvykle 37°C •Placentární isoenzym ALP je termostabilní až do 65°C, naopak kostní isoenzym ALP je při teplotě 56°C zcela inaktivován •pH •pH optimum • 4 Ovlivnění katalytické aktivity enzymu 5 Inhibice enzymů (snížení aktivity) •Ireverzibilní •nevratná •inhibitor pevně vázán na enzym (aktivní místo) •způůsobí: •organofosfáty •ionty těžkých kovů •kyanidy • • • •Reverzibilní •vratná •inhibitor volně vázán •rovnováha E + I ⇄ E-I •inhibitor lze odstranit (dialýza, gel. filtrace) •dva základní typy: •kompetitivní •nekompetitivní •6 Kompetitivní inhibice •inhibitor se váže do aktivního místa enzymu •strukturní podoba substrátu •soutěží s přirozeným substrátem o vazebné místo •komplex enzym-inhibitor se nepřemění na produkt •maximální rychlost je dosažena až za vyšších hodnot [S] •Vmax se nemění, Km se zvyšuje • •7 •8 •Malonát je kompetitivním inhibitorem sukcinátdehydrogenasy •Příklady kompetitivních inhibitorů • •methotrexát • •tetrahydrofolát •Methotrexát kompetitivně inhibuje aktivní místo pro tetrahydrofolát •Dihydrofolátreduktasy během syntézy purinových a pyrimidinových bází nukleových kyselin. Používá se jako cytostatikum. •malonát •sukcinát •COO– •CH2 •CH2 •COO– •COO– •CH2 •COO– •9 Otrava methanolem se léčí inhibicí alkoholdehydrogenasy • 1)Aktivní místo enzymu je přednostně obsazeno strukturně podobným substrátem – ethanolem (kompetice, inhibice vůči methanolu) 2)Aktivní místo enzymu obsahuje Zn2+ (chelatovaný 2x Cys a His), inhibice nastane vazbou fomepizolu na Zn2+ •10 •Nekompetitivní inhibice •inhibitor se váže jak na volný enzym (E), tak na komplex enzym-substrát (ES), ale mimo aktivní místo! •inhibice nemůže být překonána vysokou koncentrací substrátu •systém se chová jako zředěný roztok enzym •Km se nemění (aktivní místo je volné pro substrát) •Vmax se snižuje, protože klesá koncentrace funkčního komplexu E-S •11 Mnohá léčiva jsou inhibitory lidských/bakteriálních enzymů •Acetylsalicylová kyselina, ibuprofen (cyklooxygenasa) •Statiny (HMG-CoA reduktasa) – hypolipidemika, snižují syntézu cholesterolu (lovastatin) •Inhibitory ACE (angiotensin konvertující enzym) – léčba hypertenze (enalapril) •Reverzibilní inhibitory acetylcholinesterasy (neostigmin) – nervosvalové choroby, pooperační atonie střev •Selektivní inhibitory mozkové acetylcholinesterasy (rivastigmin, galantamin) - Alzheimerova choroba •Antibiotika inhibují enzymy nutné pro určitý životní děj bakterií •Peniciliny – inhibují transpeptidasy (výstavba buněčné stěny) •Tetracykliny, makrolidy, chloramfenikol – inhibice proteosyntézy •Fluorované chinolony (ciprofloxacin) – inhibice bakteriální gyrasy (topoisomerasy II) (rozplétání DNA během replikace) Ovlivnění katalytické aktivity enzymu •Koncentrace substrátu •rovnice Michaelise a Mentenové, pro jednosubstrátové reakce • 12 Jak se získá saturační křivka •sada pokusů při nichž je koncentrace enzymu konstantní •různé koncentrace substrátu, rozpětí 2-3 řády •z jednotlivých kinetických křivek se stanoví vo •vo se graficky vynesou proti příslušným [S] •vznikne hyperbolická saturační křivka 13 •14 •vo •[S] •[E1] • [E2] > [E1] •[E3] > [E2] •KM se nemění, Vmax se zvyšuje s koncentrací enzymu Koncentrace enzymu [E] také ovlivňuje rychlost •nasycený enzym: vo = k [E]t •[E]t je celková (totální) koncentrace enzymu •15 Množství enzymu v biologickém materiálu lze stanovit dvojím způsobem •Katalytická koncentrace •μkat/l •stanoví se produkt enzymové reakce •většina klinicky významných enzymů •Hmotnostní koncentrace •μg/l, ng/l, pg/l •stanoví se enzym (jako antigen, imunochemicky) •jen některé, např. tumorové markery substrát ® produkt E enzym (antigen) + protilátka ® imuno-komplex E Y Y E •16 Dvě metody pro zjištění katalytické koncentrace Charakteristika Kinetická metoda Metoda konstantního času Co se měří [S] nebo [P] [P] Jak kontinuálně (např. po 10 s) po urč. čase (např. 10 min) je reakce inhibována Kinetická křivka hodnocena ano ne Co se stanoví počáteční rychlost vo průměrná rychlost Metoda je přesná méně přesná •optimální podmínky (teplota, pH, kofaktory) •měří se D[S] nebo D[P] v určitém časovém intervalu •kinetika 0. řádu, [S] >> Km Þ nasycený enzym, rychlost se blíží Vmax Jak stanovíme aktivitu laktátdehydrogenázy LD? •18 •18 •optický test •LD •Laktát + NAD • •Pyruvát + •NADH •+ H • •při reakci klesá absorbance • •D •A •/D •t •Princip měření aktivity laktátdehydrogenasy LD •optimální podmínky (teplota, pH, kofaktory) •měří se D[S] nebo D[P] v určitém časovém intervalu •kinetika 0. řádu, [S] >> Km Þ nasycený enzym, rychlost se blíží Vmax •19 •Absorpční spektrum oxidované a redukované formy NAD+ (princip „Warburgova optického testu“) •Měřením změn absorbance při 340 nm lze sledovat přírůstek nebo úbytek NADH •Lze též měřit fluorescenci při 450 nm (pouze redukovaná forma). 260 340 •Oxidovaná forma NAD+ má jediné absorpční maximum při 260 nm •Redukovaná forma NADH má absorpční maxima při 260 a 340 nm •20 Dělení enzymů dle původu a funkce •Enzymy se specifickou funkcí v krvi •syntetizovány v játrech hlavně v játrech •mají svou funkci v krvi – koagulační faktory, cholinestráza •Buněčné (intracelulární) enzymy •mají svou funkci uvnitř buňky, v místě vzniku •při poškození buňky se uvolní a dostanou se do krve, kde lze zjistit jejich zvýšenou aktivitu •příklady: ALT, AST, CK, GMT, LD ... •Sekreční enzymy •působí jinde, např. v trávícím traktu •enzymy velkých žláz (pankreas) – lipáza, amyláza ... •21 Intracelulární lokalizace enzymů Organela Enzym Cytoplazma Mitochondrie Golgi komplex, ER Lyzosom Membrána LD, ALT, cAST (30 %) mAST (70 %) CHS, AMS ACP GMT, ALP •Různé typy poškození buňky vedou k tomu, že se do krve uvolňují jen enzymy z učité subcelulární struktury. •lehké poškození jater: AST/ALT < 1 •těžší poškození jater: AST/ALT > 1 •22 Trojí využití enzymů v lékařství 1.enzymy jako indikátory patologického stavu 2.enzymy jako analytická činidla v klinické biochemii 3.enzymy jako léčiva •23 Příklady enzymů v klinické diagnostice Enzym Referenční hodnoty Interpretace zvýšení ALT CK PSA do 0,9 mkat/l do 4 mkat/l do 4 μg/l hepatopatie myopatie, infarkt myokardu karcinom prostaty •ALT alaninaminotransferasa, CK kreatinkinasa, PSA prostatický specifický antigen •Při poškození buněk se zvyšuje aktivita intracelulárních enzymů v extracelulární tekutině •24 Enzymy jako analytická činidla Enzym Původ enzymu Stanovení Glukosaoxidasa Peroxidasa Lipasa Cholesteroloxidasa Urikasa Bilirubinoxidasa Ureasa Laktátdehydrogenasa Taq polymerasa Aspergillus niger křen (Armoracia sp.) Candida sp. Pseudomonas sp. Candida sp. Myrothecium sp. bob (Canavalia sp.) Pediocus sp. Thermus aquaticus glukosa glukosa triacylglyceroly cholesterol kyselina močová bilirubin močovina ALT, AST PCR metoda •25 Enzymové stanovení glukózy •bezbarvý chromogen •barevný produkt •(měří se absorbance) accu-check set Enzymy jako léčiva 26 Enzym Použití Pankreatické trávicí enzymy směs enzymů (lipasy, amylasy, proteasy) získaná z vepř. pankreatů, acidorezistentní tobolky indikace: sekreční nedostatečnost pankreatu různé etiologie, cystická fibróza, užívání: 3 × denně při jídle, řada přípravků volně prodejných Laktasa užívá se laktosové intoleranci Asparaginasa asparaginasa se nevyskytuje v lidském těle katalyzuje hydrolýzu deamidaci asparaginu :Asn + H2O ® Asp + NH3 L-asparagin je nezbytný pro proteosyntézu některých nádorových buněk, hydrolýza Asp vede k omezení proliferace, indikace: akutní lymfoblastické leukemie Urokinasa fibrinolytikum, rozpouští krevní sraženiny v cévách, proteasa, štěpí plazminogen na plazmin – ten vyvolá degradaci fibrinu a trombolýzu, indikace: žilní trombóza, plicní embolie, akutní IM Proteasy různého původu fibrinolyzin, chymotrypsin, kolagenasa, papain (papaya), bromelain (ananas), po lokální aplikaci vedou k lýze nekrotické tkáně, nepoškozují zdravé buňky, hnisavé rány, bércové vředy, diabetické gangrény, dekubity apod. celková aplikace: některé studie naznačují protizánětlivý účinek, ovlivnění imunity u autoimunitních onemocnění, indikace: pomocná léčiva při revmatoidní artritidě, traumatické záněty a otoky, lymfedémy aj. (Wobenzym, Phlogenzym) Nadstavbový materiál 27 Tři obecné způsoby regulace enzymů Princip regulace Komentář Změna koncentrace substrátu •rychlost enzymových reakcí závisí na koncentraci substrátu •enzymy vykazují saturační kinetiku •izoformy enzymů s různou Km jsou různě citlivé na koncentraci substrátu (hexokinasa ´ glukokinasa) •dostupnost substrátu v aktivním místě enzymu snižuje kompetitivní inhibitor •velmi důležitý faktor in vitro Změna koncentrace enzymu •regulace syntézy enzymu (indukce ´ represe) •regulace degradace enzymu (selektivní ´ neselektivní) Změna konformace aktivního místa enzymu •štěpení proenzymů (nevratný děj) •fosforylace enzymu •allosterické regulátory •protein-protein interakce •nekompetitivní inhibitory 28 pomalá změna rychlá změna •29 Regulace množství enzymu •Řízená proteosyntéza enzymu konstitutivní a induková exprese genů, regulace rychlosti transkripce, posttranskripčních úprav RNA, regulace rychlosti translace a posttranslačních úprav • •Řízená degradace enzymu specifické intracelulární proteinasy – určují rozdílné biologické poločasy enzymů •30 Aktivace enzymu částečnou proteolýzou •aktivní enzym vzniká nevratným odštěpením určité sekvence (propeptidu) z molekuly proenzymu •obecně: proenzym + H2O ® enzym + propeptid •nastane změna konformace molekuly, která exponuje aktivní místo, takže je připraveno navázat substrát •Proteinasy v GIT (pepsinogen ® pepsin) •Faktory krevního srážení •Proteinasy (kaspasy) aktivované v průběhu apoptózy •31 Fosforylace/defosforylace enzymu •kovalentní modifikace, katalyzují proteinkinasy •přenos fosforylu -PO32- z ATP na -OH skupinu enzymu (Ser, Thr, Tyr) •v zásadě vratný děj •defosforylaci katalyzují fosfatázy, hydrolýza esterově vázaného fosfátu • •32 Fosforylace a defosforylace enzymu mění jeho aktivitu •protein-serin-OH • protein-serin •proteinkináza •fosfoproteinfosfatáza •proteinkinasy jsou aktivovány •druhým poslem •(cAMP, kalcium-kalmodulin komplex) •33 Příklad důsledků fosforylace/defosforylace dvou enzymů Charakteristika Glykogenfosforylasa Glykogensynthasa Enzym je aktivován glukagonem inzulinem Enzym katalyzuje štěpení energeticky bohatého glykogenu energeticky chudým fosfátem (Pi) = transfer glukosylu z (Glc)n na Pi (= transferasa) syntézu energeticky bohatého glykogenu z energeticky bohaté UDP-glukosy = transfer glukosylu z UDP-Glc na (Glc)n (= transferasa) Katalyzovaná reakce (Glc)n + Pi ® (Glc)n-1 + Glc-1-P (Glc)n + UDP-Glc ® (Glc)n+1 + UDP Fosforylace enzym aktivuje inhibuje Defosforylace enzym inhibuje aktivuje •34 Allosterické enzymy jsou oligomerní •více podjednotek, často regulační a katalytická •na enzym se váže efektor strukturně odlišný od substrátu, často produkt •váže se do allosterického místa – jiné než aktivní místo •vazba vyvolá změnu konformace enzymu Þ změna aktivity - allosterická aktivace nebo inhibice • •35 Allosterické enzymy jsou oligomerní allosteric enzyme •36 Saturační křivka allosterických enzymů je sigmoidní •bez •efektoru •37 Kooperativní efekt •u oligomerních enzymů a proteinů (např. Hb) •více podjednotek Þ více vazebných míst •navázání substrátu (nebo O2 na Hb) na jednu podjednotku indukuje změny konformace u ostatních, že se další molekuly substrátu (nebo O2) vážou snadněji (obtížněji) •příklad: hemoglobin (tetramer) × myoglobin (monomer) • •38 Srovnejte •Saturace enzymu substrátem •Saturace hemoglobinu kyslíkem •vo •[S] •pO2 •Saturace •(%) • • •myoglobin (monomer) •hemoglobin (tetramer) •allosterický enzym (oligomerní) •jednoduchý enzym (vyhovující M.-M. kinetice)