1
3 BIOLOGICKÝ	MATERIÁL	A	SPEKTROFOTOMETRIE	
Pro správné posouzení zdravotního stavu je potřeba získat co nejvíce informací. Zdrojem
validních informací, které v sobě odrážejí změnu metabolismu organismu a mohou být použity při
posuzování zdravotního stavu pacienta, jsou výsledky laboratorních vyšetření. Lékař v různých
fázích diagnostického a terapeutického procesu může využívat širokou škálu laboratorních
metod používaných v klinicko-biochemických laboratořích nebo přímo u lůžka pacienta (či
v ordinaci praktického lékaře) bez nutnosti analýzy v laboratoři (tzv. POCT-point of care testing).
Nejrozsáhlejší a nejvýznamnější část laboratorních vyšetření tvoří analýzy krve, krevního séra
nebo plazmy. Krev je poměrně snadno dostupným materiálem a v jejím složení se odráží řada
biochemických pochodů probíhajících v různých tkáních. Dalším poměrně často analyzovaným
materiálem je moč. Analýzy ostatních tělesných tekutin (žaludeční sekret, duodenální obsah,
plodová voda, mozkomíšní mok, sliny, pot aj.) jsou požadovány cíleně pouze u omezeného počtu
vyšetřovaných, jejich četnost je podstatně nižší, často se provádějí jen na specializovaných
pracovištích.
3.1 Odběr	krve		
Krev pro odběr se může získávat z žil, tepen nebo kapilár. Nejčastěji se odebírá žilní krev (většinou
z kubitální žíly), méně často kapilární (např. z prstu, ušního lalůčku nebo z prohřáté patičky u
novorozence). Arteriální krev se odebírá pouze výjimečně, hlavně pro analýzy krevních plynů.
Arteriální krev můžeme někdy nahradit arterializovanou kapilární krví, kterou získáme
dlouhodobým zahříváním místa odběru. Kapiláry se teplem rozšíří, tím se zvýší se průtok krve
kapilárami, z kterých provádíme odběr. Odběr se provádí do heparizovaných kapilár a odebraný
vzorek musí být bez bublin.
3.1.1 Odběr	žilní	krve	
Z hlediska postupu a vybavení při odběru žilní krve rozlišujeme dva způsoby odběru:
• otevřený	odběrový	systém – pracovník provádějící odběr je v přímém styku s biologickým
materiálem
Odběr se provádí:
- jehlou přímo do zkumavky
- do stříkačky natažením pomocí pístu; pro další zpracování přenesení krve do zkumavky
• uzavřený	odběrový	systém – manipulace se vzorkem po odběru se provádí přímo v odběrové
stříkačce/zkumavce. Pracovník je tak při odběru chráněn před kontaminací krví pacienta,
samotný biologický materiál je chráněn před možnou kontaminací zvenčí a proti případnému
rozbití během transportu a centrifugace. Jednotlivé uzavřené stříkačky/vakuované zkumavky
jsou barevně označeny podle druhu uvnitř přítomné preparační látky (akcelerátory
2
hemokoagulace, separační gel, heparin, EDTA, aj.). Separační gel umožňuje po centrifugaci
(vytvořením mezivrstvy) dokonalé oddělení séra od krevního koagula. Odběrovou
stříkačku/zkumavku je tak možné přímo nasadit do analyzátoru. Použitý materiál se snadno
likviduje spálením.
3.1.2 Zpracování	krve	
Krev odebraná bez použití protisrážlivých prostředků se po kratší době sráží, v důsledku přeměny
rozpustného fibrinogenu na vláknitou síť fibrinu.	Odstředěním sražené krve se získá	sérum.	Doba
srážení musí být dostatečná (při pokojové teplotě po 15–30 min). Předčasné oddělení séra od
krevních elementů může vést k dodatečné tvorbě fibrinu a koagulaci séra.
Pro některá klinicko-biochemická vyšetření je třeba získat nesrážlivou	krev. Krev je odebírána
do nádobek s přídavkem antikoagulačních (protisrážlivých) činidel. Odstředěním nesrážlivé krve
se získá plazma. Krev je možno odstředit ihned po odběru, čímž lze ušetřit čas u akutních stavů.
Plazma nebo sérum mají být odděleny co možná nejdříve, nejpozději však do 2 hodin od odběru
(pro stanovení draselných iontů do 1 hodiny od odběru).
K oddělení krevních elementů od plazmy, resp. krevní sraženiny od séra, se používají centrifugy
(odstředivky). K dokonalému odstředění plné či sražené krve se používá přetížení přibližně
1000krát větší než je zemská gravitace. Centrifugace krve se vždy provádí v uzavřených
zkumavkách (zamezení vzniku aerosolu, příp. kontaminace vzorku) po dobu asi 10–15 minut při
pokojové teplotě nebo při teplotě 4 °C. Delší doba centrifugace nebo zvýšení centrifugačního
přetížení vede často k částečné či úplné hemolýze.
3.1.3 Příprava	krevní	plazmy	
Při odběru se odebíraná krev ve zkumavce opatrným kroužením dobře smíchá s protisrážlivou
látkou (antikoagulačním	činidlem), která se v krvi rozpustí a udrží ji po určitý čas nesrážlivou
(objem krve se přitom nemění). Protisrážlivý prostředek se dává do zkumavky ve formě roztoku,
který se nechá odpařit. Nesrážlivou krev s heparinem lze získat také tak, že z ampulky nasajeme
roztok heparinu do stříkačky a opakovanými pohyby pístu vytvoříme na povrchu jemný
heparinový film. Do takto připravené stříkačky pak odebereme krev.
Uzavřené odběrové systémy jsou plněny antikoagulačními činidly již při výrobě.
Přibližné dávky antikoagulačního činidla zabraňující srážení 1 ml krve:
*na hematologická vyšetření se používá ve formě roztoku, který se mísí s krví v poměru 1:10, 1:5
+jedná se o heterogenní směs sulfonovaných mukopolysacharidů produkovanou žírnými buňkami ve tkáních savců.
Heparin vazbou na plazmatický antithrombin III zvyšuje jeho aktivitu – inaktivaci aktivovaných faktorů srážení,
především thrombinu a faktoru Xa. Množství heparinu závisí na materiálu, z něhož je zhotovená odběrová zkumavka
(sklo, plast).
Oxalát sodný (též lithný, draselný) 1–2 mg
Citrát trisodný* 3 mg
EDTA.Na2 (též K2, K3) 1–2 mg
Heparin+
4–6 IU (roztok), 40–60 IU (suchý)
3
Při použití antikoagulačních činidel je nutno počítat s tím, že může dojít ke změně složení
odebrané krve. Rovněž je nutno počítat s tím, že během koagulace se nejen aktivují koagulační
faktory, ale dochází též k uvolňování některých složek z rozpadlých trombocytů.
3.2 Fyzikální	a	chemické	vyšetření	moči	
Dalším snadno dostupným biologickým materiálem, který slouží k posuzování stavu pacienta je
moč.
3.2.1 Odběr	moči	
Pro základní chemické vyšetření moče se využívá první ranní moč (střední proud moči). Pro
kvantitativní stanovení se využívá vzorek moči sbírané určitý časový interval (obvykle3,6,12nebo24
hodin).
Pokud je to možné, je doporučeno pro kvantitativní stanovení využít kratší sběrný interval nebo
korigovat množství stanoveného analytu v první ranní moči na exkreci kreatininu (množství
analytu/mol kreatininu).
Pokud odběr moče provádí pacient sám, je nutné ho poučit a správné technice odběru moče a klást
důraz na jejich dodržovaní. Protože nedodržení správného postupu může vést k hrubým chybám,
které zcela znehodnotí analýzu.
Pokyny	pro	správný	sběr	moči	v	delším	časovém	intervalu:
Vyšetřovaný se vymočí např. v 7:00 h ráno a tato moč se vylije do odpadu. Od tohoto
okamžiku začíná sběrné období a shromažďuje se veškerá moč (v zakryté nádobě v temnu
a chladu, příp. s přídavkem konzervačního činidla). Poslední odběr je v okamžiku, kdy
končí sběrné období. Celý sběr moči se dobře promíchá, v odměrném válci změří objem a
poznamená do průvodky. Pak zpravidla postačí k vyšetření vzorek 10–20 ml.
3.2.2 Fyzikální	vyšetření	moči	
Mezi základní fyzikální vyšetření moče patří zhodnotit její objem, barvu, zápach a zákal. Důležitou
součástí fyzikálního vyšetření je stanovit pH moče, její osmolalitu a hustotu.
Objem	moči	
Denní diuréza představuje objem moči vyloučený za 24 hodin. Nejčastěji denní diuréza
představuje 1000 až 2000 ml/den (u dospělých).
Snížená	diuréza	(oligurie): pod 400 ml/den. (funkční nedostatečnost u ledvinových poruch,
nadměrné pocení, těžké průjmy). Závažná je anurie, diuréza pod 100 ml/den.
Zvýšená	 diuréza	 (polyurie): nad 2500 ml/den je běžná při nadměrném příjmu tekutin, po
podání diuretik, někdy i z psychických vlivů, neléčená porucha regulace vazopresinem (diabetes
insipidus) se projevuje diurézou až 10–20 litrů denně.
4
Barva	
Normální barva moči je podle její koncentrace světle až zlatě žlutá, velmi bledá moč je typická pro
polyurii, stáním moč tmavne,
Zbarvení působí buď přirozená močová barviva (urochrom, uroerythrin,stopy koproporfyrinu,
aj.), exogenní složky (léčiva), rostlinná barviva (červená řepa, borůvky) nebo patologické součásti
(bilirubin, biliverdin, hemoglobin).
Zápach	
Pach normální moči je svérázný, připomíná pach hovězí polévky nebo bujónových kostek.
Mění se použitím některých druhů potravin (např. chřest, česnek, káva), léků nebo vdechovaných
těkavých látek (chloroform, toluen); výrazný pach acetonu bývá při ketonurii, čpavkový při
infekcích močových cest (bakterie obsahující ureázu) nebo hnilobný (sulfan, methanthiol,
bakteriální rozklad při proteinurii, jaterní kóma). Zápach koňské stáje je při fenylketonurii
(fenyloctová kyselina).
Zákal	
Moč ihned po vymočení má být čirá. Zákal v teplé, čerstvě vymočené moči je patologickým
nálezem.
Zákal nebo větší sedlina však může vznikat při odstavení a chladnutí i v normální moči.
Nejběžnější je jemný obláčkový zákal (nubecula) tvořený glykoproteiny a větší sedlina
vyloučených solí (fosfáty v alkalických močích, močová kyselina nebo uráty v kyselých).
pH	moči	
Ledviny se podílejí na udržování acidobazické rovnováhy v organismu tím, že do moči vylučují
většinu H+ iontů pocházejících z některých kyselin vzniklých v metabolismu živin nebo přímo
přijatých potravou. Jen zanedbatelná část z nich jsou volné H+ ionty, projevující se aktuální
kyselostí (hodnotou pH moči nižší než pH krevní plazmy). Asi 2/3 H+ iontů vyloučených do moči
je vázáno v NH4+ iontech (30–50 mmol/den), zbytek na různé báze, zvláště na hydrogenfosfát
(10–30 mmol/den, tzv. titrační acidita moči).
Hodnota pH moči se pohybuje obvykle v rozmezí 5,5–6,5; s krajními mezemi 4,5–8,0.
Snížené pH moči (acidurie, pH < 5,5) způsobuje např. masitá strava (vyšší produkce fosfátů a
sulfátů, stoupá vylučování močové kyseliny), metabolická nebo respirační acidóza, hladovění
(současně ketonurie), dekompenzovaný diabetes (současně glukosurie a ketonurie).
Zvýšené pH moči (alkalurie, pH > 6,5) bývá zapříčiněno např. vegetariánskou stravou, infekcí
močových cest, metabolickou nebo respirační alkalózou.
Hodnota pH moči se určuje acidobazickými indikátory. Nelze použít ty, které vykazují proteinovou
chybu v přítomnosti proteinů. V praxi se ke stanovení pH moči užívá indikační zóny na
diagnostických proužcích albuPHAN, heptaPHAN, aj. Reakci moči určujeme co nejdříve po
5
vymočení. Není-li moč konzervována, dochází k rozmnožení mikroorganismů spojené s
hydrolýzou močoviny na NH3 a posunu pH k vyšším hodnotám.
Osmolality	moči	a	test	na	koncentrační	schopnost	ledvin	
Osmolalita moči závisí na koncentraci vylučovaných látek, obvykle je nepřímo úměrná diuréze.
Nejčastější hodnoty u zdravých jsou 500–850	mmol/kg	H2O, s extrémy 30–1200 mmol/kg.
Známkou dostatečné koncentrační schopnosti je při omezení příjmu tekutin osmolalita aspoň
600 mmol/kg, při ztrátě schopnosti koncentrovat nebo zřeďovat moč v nefronu se udržuje bez
větších výkyvů osmolalita moči na úrovni osmolality ultrafiltrátu krevní plazmy, cca
290 mmol/kg. Porucha koncentrační schopnosti ledvin patří k prvním známkám renálního
onemocnění.
Osmolalita moči se stanovuje osmometry založenými většinou na kryoskopickém principu, kdy se
měří snížení teploty tuhnutí vzorku (1 mol rozpuštěných látek sníží bod tuhnutí vodného roztoku
o 1,86 °C).
Vyšetření osmolality se provádí v několika vzorcích moči sbíraných během dne. Přesáhne-li
osmolalita v kterémkoli vzorku hodnotu 600 mmol/kg, je to známkou dobré koncentrační
schopnosti ledvin a vyšetření tím končí. V opačném případě je indikováno provedení
koncentračního pokusu.
Specifická	hmotnost	moči	(Hustota)	
Namísto měření osmolality lze pomocí diagnostických proužků stanovit specifickou hmotnost,
která dává informaci o iontové koncentraci moči (hmotnostní koncentrace všech rozpuštěných
látek vyloučených do moči). Na rozdíl od osmolality je závislá kromě počtu rozpuštěných částic
také na jejich molekulové hmotnosti. Vysokomolekulární látky ovlivňují hustotu ve větší míře než
elektrolyty. Referenční hodnoty jsou při běžném příjmu tekutin a potravin během dne mezi
1015–1030	g/l, což odpovídá osmolalitě asi 600–1100 mmol/kg.
3.2.3 Chemické	vyšetření	moči
K základnímu chemickému vyšetření moči náleží zjištění přítomnosti proteinů, krve resp.
hemoglobinu, glukosy, ketolátek, bilirubinu a urobilinogenu. Vyjmenované součásti se označují
též jako "patologické". Při analýze zvláště citlivými metodami je nalezneme v nepatrných
koncentracích i v moči zdravého člověka. Chemické vyšetření moči	 proto používá takové
kvalitativní zkoušky, jejichž výsledek je pozitivní teprve tehdy, přestoupí-li koncentrace hledané
látky jisté fyziologické rozmezí.	 Vyšetření se obvykle provádí pomocí diagnostických proužků.
Výhodné pro tento účel jsou kombinované diagnostické proužky, které umožňují současnou
detekci několika látek. Při pozitivitě těchto zkoušek teprve mluvíme o proteinurii, hematurii, atd.,
a je nutné nález korelovat s jinými faktory a případně žádat další vyšetření na potvrzení výsledku.
6
Kromě diagnostických proužků na zjištění „patologických“ součástí v moči jsou vyráběny různé
další screeningové testy založené většinou na imunochromatografických metodách, např. pro
průkaz drog nebo hormonů v moči.
3.2.3.1 Vyšetření	moči	polyfunkčními	diagnostickými	proužky	
Polyfunkční diagnostické proužky s několika indikačními zónami jsou založeny na principu suché
chemie. Tzn., že činidla použité pro průkaz analytu jsou naneseny na filtrační papír a následně
odpařeny. Po navlhčení indikačních zón ve vzorku moči je aktivována chemická reakce, která se
projeví zbarvením zóny. Vyhodnocení se provádí většinou vizuálně srovnáním indikačních zón s
barevnými stupnicemi na pouzdrech pro proužky. Intenzita zbarvení je úměrná množství analytu
v moči a při dodržení výrobcem předepsaného času je možné semikvantitativní stanovení
určovaných látek. Intenzitu zbarvení je též možné vyhodnotit u proužků k tomu určených
elektronicky, obvykle měřením reflektance. K tomuto účelu se využívají malé přístroje
(reflektanční fotometry různých výrobců, např. Laura Smart firmy Erba Lachema, Urisys firmy
Roche apod.)
Výhodou polyfunkčních proužků je možnost rychlého vyšetření moči kdekoli, i přímo u lůžka
pacienta, neobyčejně snadným a jednoduchým způsobem. Vždy je nutno mít na paměti, že
výsledek může být ovlivněn interferujícími léky nebo jejich metabolity. Mezi nevýhody lze počítat
omezenou skladovatelnost (všímejte si proto data exspirace uvedeného na obalu). Nutno je také
dodat, že semikvantitativní stanovení diagnostickými proužky není dostačující pro stanovení
diagnózy a následnou léčbu pacienta a vždy je nezbytné provést další vyšetření.
Při vyšetření moči pomocí proužků se vyšetřuje vždy jen čerstvá moč (nejpozději do 2 h po
odběru), sbíraná do zcela	čistých nádob, dobře promíchaná, necentrifugovaná.
Polyfunkční proužky obsahují různý počet indikačních zón. K parametrům, které lze v moči
vyšetřovat (jak bylo v předchozích kapitolách uvedeno), patří: pH,	glukóza,	proteiny,	ketony,	
bilirubin,	urobilinogen,	krev a specifická	hmotnost. Některé polyfunkční proužky obsahují též
indikační zóny na detekci dusitanů a leukocytů.	
Glukóza	
Indikační zóna proužku obsahuje enzymy (glukosaoxidázu a peroxidázu) a vhodný substrát, který
se v přítomnosti vzniklého peroxidu oxiduje na barevný produkt. Zkouška je dosti citlivá, výsledek
je zřetelně pozitivní přibližně od koncentrace 2 mmol/l. Zároveň je velmi specifická, jiné cukry
než D-glukosa nereagují.
Falešně negativní výsledky vznikají při vysokých koncentracích redukujících látek (askorbová
kyselina nebo některá spazmolytika zpomalují vývin zbarvení).
Falešně pozitivní výsledky může způsobit přítomnost substrátů peroxidázy v nádobách na moč
(běžný dezinfekční prostředek Persteril /peroxooctová kyselina/ nebo peroxid vodíku). Nádoby
se proto po dezinfekci musí důkladně vypláchnout čistou vodou.
7
Proteiny	
K důkazu se využívá tzv. proteinové chyby některých acidobazických indikátorů. Tyto indikátory
mění své zbarvení v přítomnosti proteinů a vykazují zdánlivě jinou hodnotu pH, než odpovídá
skutečnosti. Příkladem jsou indikátory sulfoftaleinového typu. Indikační zóna na konci proužku je
nasycena uvedeným indikátorem a kyselým pufrem o hodnotě pH 3. Po smočení v roztoku
obsahujícím proteiny indikátor nabude zbarvení odpovídající podstatně vyšší hodnotě pH, než
které v indikační zóně zajišťuje pufr (indikátor vykazuje proteinovou chybu).
Vyšetření proteinurie se provádí v náhodném vzorku moče, nejlépe v prvním ranním vzorku
moče. Testovací proužky detekují bílkovinu v moči pouze tehdy, je-li její koncentrace vyšší než
0,1–0,3 g/l (záleží na výrobci proužku, na kvalitě barevné stupnice) a vykazují mnohem vyšší
citlivost na albumin než na globuliny, glykoproteiny a Benceův Jonesův protein.
Ketony	
Princip stanovení spočívá v reakci ketonových látek s nitroprusidem sodným
v alkalickém prostředí za vzniku fialového zbarvení. Zkouška dokazuje v čerstvé moči zvláště
acetoacetát, který při delším stání spontánně dekarboxyluje na aceton (na něj je zkouška méně
citlivá).
Za normálních okolností je vylučování ketolátek nepatrné, nedosahuje hodnoty 0,5 mmol/den. Ke
zvýšené produkci ketolátek dochází v důsledku zvýšené utilizace tuků a při současné poruše
nedostatečnosti utilizace glukózy (např. při vyčerpávající fyzické námaze bez dodávky glycidů,
několikadenním hladovění, redukční dietě s převahou proteinů, u diabetes mellitus). V těchto
případech se zvyšuje koncentrace ketolátek v krvi nad 200 µmol/l a močí se jich vylučuje i více
než 100 mmol/den. Aceton je poměrně těkavý a je poměrně rychle vylučován exspirací.
Bilirubin	
Moč k důkazům bilirubinu musí být čerstvá, bilirubin se na vzduchu snadno oxiduje. K důkazu se
využívá kopulační reakce bilirubinu s vhodnou diazoniovou solí v kyselém prostředí za vzniku
azobarviva. V moči zdravého člověka se může vyskytovat nepatrné množství konjugovaného
bilirubinu (až 0,5 µmol/l), které běžnými zkouškami není prokazatelné. Zkoušky na bilirubin
v moči jsou pozitivní, zvýší-li se koncentrace konjugovaného	bilirubinu v krevní plazmě asi nad
30 µmol/l. Nekonjugovaný bilirubin je v plazmě vázán na albumin a do glomerulárního filtrátu
proto neproniká. Zjištění bilirubinu v moči je tedy známkou neschopnosti hepatocytů vyloučit
konjugovaný bilirubin do žluče nebo známkou uzávěru žlučových cest, patří proto k příznakům
hyperbilirubinemie hepatocelulární nebo obstrukční. Při déletrvajících poruchách však nemusí
být v moči prokazatelný ani konjugovaný bilirubin, neboť se v séru přeměňuje na delta formu.
Urobilinogen	
Zvýšené množství těchto látek je velmi citlivou známkou funkčního zatížení nebo nedostatečnosti
hepatocytů, výrazem neschopnosti vychytat z krve a přeměnit většinu z urobilinogenů
resorbovaných v tlustém střevě. Jednoduchost zkoušky již při orientačním vyšetření moči je
cenná, pozitivní nález může být první objektivní známkou funkčního zatížení jater (značná fyzická
8
zátěž, jednorázové požití větší dávky etanolu, nadměrná hemolýza) nebo poškození jaterních
buněk, např. při virovém zánětu, toxickém poškození (též u horečnatých stavů) nebo u nádorů
jater. Nález je nutno zpřesnit rozbory krevního séra – jaterními testy.
Průkazem urobilinogenů je specifická barevná kopulační reakce urobilinogenů s vhodnou
diazoniovou solí v kyselém prostředí. Srovnání s barevnou stupnicí umožní semikvantitativní
vyhodnocení. Slabě růžové zabarvení zóny, odpovídající prvnímu políčku srovnávací stupnice
(přibližně 17 µmol/l), lze považovat za horní mez fyziologických koncentrací urobilinogenů
v moči v průběhu dne. Z vyšetření moči je naprosto nezbytné provést zkoušky na bilirubin.
Krev	
Močí zcela zdravých lidí se vyloučí až milión erytrocytů za den. Toto velmi malé množství nelze
prokázat běžnými chemickými zkouškami. Výskyt většího množství erytrocytů (hematurie) nebo
průnik volného hemoglobinu, příp. svalového myoglobinu, do definitivní moči (hemoglobinurie,
resp. myoglobinurie) je téměř vždy patologickým nálezem. Moč s nadměrnou příměsí
hemoglobinu má narůžovělé až masové zbarvení a spektroskopicky v ní lze prokázat hemoglobin;
u masivní hemoglobinurie může nabýt až zbarvení černého piva (degradace hemoglobinu na
hematin).
Principem chemického zjištění hemoglobinu nebo erytrocytů v moči je tzv. pseudoperoxidázový
účinek hemoglobinu. Některé látky, jako např. hemoglobin, hem a jeho deriváty (i chlorofyl), méně
též ionty Fe3+, katalyzují neenzymovou oxidaci (dehydrogenaci) vhodných organických sloučenin
peroxidem vodíku:
Výhodné je ke sledování reakce použít chromogenní substrát, tj. látku poskytující dehydrogenací
výrazně zbarvený produkt (zde aminofenazon, často též benzidin nebo jeho nekancerogenní
deriváty). Diagnostické proužky hemoPHAN obsahují v indikační zóně o-tolidin
(3,3'-dimethylbenzidin) a kumenhydroperoxid v kysele pufrované směsi.
Stejnou reakci katalyzují enzymy – peroxidázy, které slouží k odstraňování peroxidu vodíku
vznikajícího v průběhu některých oxidoredukčních dějů v buňkách. Z poznaných krevních
elementů mají vysokou peroxidázovou aktivitu leukocyty. Katalytická aktivita enzymu se ztrácí
jeho tepelnou denaturací.
Pozitivita zkoušky na pseudoperoxidázový účinek hemoglobinu v moči může tedy být způsobena
i peroxidázami leukocytů nebo některých bakterií. V tomto případě opakování zkoušky
s povařeným vzorkem dá negativní výsledek, zatímco pseudoperoxidázová aktivita
neenzymových katalyzátorů zůstává i po povaření vzorku zachována.
Při negativní reakci zůstává indikační zóna žlutá, v přítomnosti hemoglobinu (nebo četnějších
leukocytů) se barví žlutě zeleně až modře. Jsou-li v moči intaktní erytrocyty, může být zbarvení
zóny nerovnoměrné. Hematurii potvrdí nález četných erytrocytů v močovém sedimentu.
9
Citlivost důkazu se snižuje, je-li v moči přítomno větší množství redukujících látek (např.
askorbátu po vysokých dávkách vitaminu C, urátu v příliš koncentrovaných močích, gentisátu).
Falešně pozitivní výsledek může vzniknout za přítomnosti železitých solí, jodidů nebo stop silných
oxidačních činidel (dezinfekčních prostředků obsahujících chlor, chlornan, chloramin).
Dusitany	
Detekce dusitanů slouží pro průkaz bakteriurie. Princip detekce dusitanů v moči je stejný jako při
stanovení dusitanů v pitné vodě. Indikační zóna obsahuje aromatickou aminosloučeninu (např.
sulfanilovou kyselinu) a pufr udržující silně kyselé pH. V přítomnosti NO2− vzniká diazoniová sůl,
která následně reaguje s vhodnou aromatickou sloučeninou za vzniku azobarviva. Detekce
dusitanů v moči slouží jako rychlá metoda na odhalení asymptomatické infekce močových cest. V
přítomnosti některých patogenních bakterií v močovém systému dochází k redukci dusičnanů
(normální složka moči) na dusitany. Aby tato redukce mohla proběhnout, musí být splněny další
předpoklady:
• dostatečné množství dusičnanů v moči (předchozí den je dodržena normální dieta
zahrnující zeleninu),
• dostatečně dlouhá doba retence moči v močovém měchýři (aspoň 4 h),
• vyloučení možné antibakteriální léčby (inhibice bakteriálních enzymů).
Při pozitivním nálezu dusitanů je v čerstvé moči přítomno kolem 107 zárodků/ml. Negativní nález
dusitanů však nevylučuje bakteriurii (možná infekce mikroorganismy neredukující dusičnany).
Snížené hodnoty nebo falešně	 negativní	 výsledky mohou být získány při polyurii a častém
močení, nadměrném lačnění či hladovění, nadměrných dávkách vitaminu C.
Falešně	pozitivní	nález je způsoben bakteriální kontaminací vzorku.
Leukocyty	
Chemické potvrzení leukocyturie diagnostickými proužky je založeno na průkazu esteráz, které
se hojně vyskytují v granulocytech a histiocytech. Indikační zóna proužku obsahuje indoxylester,
který je hydrolyzován indoxylesterázou na indoxyl (3-hydroxyindol). Tento je u některých typů
proužků oxidován vzdušným kyslíkem na indigo (modř) nebo reaguje v následné reakci
s diazoniovou solí za tvorby azobarviva (béžově-fialové zbarvení). Test zachytí jak intaktní,
tak rovněž lyzované leukocyty, které unikají mikroskopickému vyšetření.
Symptomem zánětlivého onemocnění ledvin (pyelonefritidy) a dolních močových cest (cystitida,
uretritida) je zvýšená exkrece leukocytů močí. Zatím není standardizována hranice mezi normální
a patologickou exkrecí leukocytů. Jako patologický nález se hodnotí > 20 leukocytů/µl moči; při
nálezu 10–20 leukocytů/µl je nutné provést další vyšetření s novou čerstvou močí.
Při pozitivním nálezu je třeba další vyšetření na proteinurii, hematurii, nitriturii, pH
a mikroskopické vyšetření močového sedimentu.
Při zánětech způsobených toxickými látkami, infekcích trichomonadami, viry, plísněmi můžeme
nalézt tzv. „abakteriální“ leukocyturii.
10
Kyselina	askorbová	
Při stanovení některých látek (glukosa, krev, nitrity) interferuje askorbová kyselina, která může
být v moči přítomna ve velkých koncentracích. Proto některé polyfunkční proužky obsahují zónu
pro stanovení kyseliny askorbové. Indikační zóna pro askorbovou kyselinu obsahuje kyselinu
fosfomolybdenovou, která je redukována askorbovou kyselinou na molybdenovou modř. Test
není specifický pro askorbovou kyselinu, protože pozitivní reakce (šedozelenomodré až zelené
zbarvení) vzniká i při působení dalších redukujících látek přítomných v moči (např. gentisové
kyseliny a dalších metabolitů salicylové kyseliny).
11
3.3 Spektrofotometrie	
Metody kvantitativní analýzy se často zakládají na určení absorpce elektromagnetického záření
z oblasti ultrafialové (vlnová délka λ < 380 nm) nebo viditelné části spektra (λ = 380–780 nm)
stanovovanou látkou. Molekuly absorbují elektromagnetické záření pouze takové energie
(kvantum energie), která je přivede do vyššího (excitovaného) energetického stavu. Tuto energii
lze vyjádřit pomocí vztahu:
ΔE = h ν = h c / λ
kde h je Planckova konstanta, ν frekvence absorbovaného záření, c rychlost světla ve vakuu, λ vlnová délka absorbovaného
záření.
Vlnová délka absorbovaného elektromagnetického záření je tedy určena vzdáleností dvou
sousedních energetických hladin (ΔE) molekul dané látky, mezi kterými elektrony přechází.
Pokud monochromatické záření o intenzitě I0 prochází vrstvou absorbující látky l, dochází
k částečné absorpci záření, takže vycházející elektromagnetické záření má intenzitu I nižší než I0.
Množství absorbovaného záření může být vyjádřeno dvojím způsobem:
- jako transmitance	(propustnost): T = I / I0
- často se udává jako procento prošlého záření T (%) = 100 · I/ I0 	
- jako absorbance: A = log (I0 / I) = log (1 / T) = −log T
- zastaralé pojmy jsou optická hustota (OD, angl. optical density), extinkce (E)
Vztah mezi transmitancí a absorbancí vyjadřuje následující schéma:
Pokud nedochází k absorpci záření při jeho průchodu látkou, tak transmitance je rovna 100 % a
absorbance je nulová. Pokud veškeré záření je pohlceno roztokem, tak transmitance je nulová a
absorbance je nekonečno.
Velikost absorpce elektromagnetického záření závisí na třech faktorech: na vlnové délce záření,
koncentraci absorbující látky v roztoku a na tloušťce měřené vrstvy.
Při dané vlnové délce záření existuje mezi koncentrací absorbující látky a absorbancí přímá
úměra. Tuto závislost vyjadřuje Lambertův-Beerův	 zákon	 (někdy označovaný pouze jako
Beerův zákon):
Aλ	=	ελlc
II0
l
%Transmitance
Absorbance
12
Kde ελ je molární	absorpční	koeficient (neboli molární absorptivita), jehož hodnota odpovídá absorbanci látky o
koncentraci 1 mol l−1 a tloušťce měřené vrstvy l = 1 cm, c je látková koncentrace (mol l−1) a l tloušťka měřené vrstvy
(cm).
Absorbance je aditivní veličina, tj. pokud je v roztoku přítomno více látek, které absorbují při dané
vlnové délce, tak celková absorbance roztoku je dána vztahem:
Acelková = A1 + A2 + ...= ε1 l c1 + ε2 l c2 + ...
Lambertův-Beerův zákon platí pouze pro:
• monochromatické záření
• zředěné roztoky (< 10−2 mol l−1)
• homogenní roztoky (nedochází k rozptylu záření na částicích vzorku)
• vzorky, které nefluoreskují ani nefosforeskují při dané vlnové délce
• monomerní látky, které v roztoku neasociují
Závislost absorbance na vlnové délce nazýváme absorpční	 spektrum	 (absorpční křivka).
Absorpční spektrum je charakteristické pro danou sloučeninu. Praktický význam mají absorpční
maxima křivky a jim příslušející vlnové délky. Ke stanovení koncentrací absorbujících látek se volí
zpravidla vlnové délky těchto maxim, poněvadž stanovení je nejpřesnější (viz obrázek) a současně
i nejcitlivější (viz Lambertův-Beerův zákon).
Z absorpční křivky lze též vypočítat hodnoty molárních absorpčních koeficientů, známe-li
koncentraci absorbující látky, pro kterou byla absorpční křivka sestrojena:
ελmax
= Amax / (l*c)
Protože hodnota molárního absorpčního koeficientu závisí na konkrétních experimentálních
podmínkách, tak se téměř vždy při spektrofotometrických stanoveních koncentrace vychází
z kalibračního grafu. K jeho zhotovení se připraví z nejčistšího preparátu stanovované látky
(standardu) standardní roztok a jeho ředěním řada kalibračních roztoků. Každý kalibrační roztok
se zpracuje stejným postupem jako vzorky s neznámou koncentrací. Poté se změří jejich
absorbance proti rozpouštědlu nebo činidlu bez měřené látky (slepému vzorku/pokusu, angl.
blank). Naměřené hodnoty se vynesou do grafu jako závislost absorbance kalibračních roztoků na
a
b
Absorbance
Koncentrace
A
λλmax
Amax
a
b
13
jejich koncentraci. Závislost je lineární pro rozsah koncentrací, ve kterém platí Lambertův-Beerův
zákon. Odchylky od přímky jsou běžné u vysokých koncentrací. Body ležícími v lineární části grafu
se proloží přímka (jejíž obecná rovnice je y = k x + q).
Pokud se měří absorbance proti slepému vzorku, tak kalibrační přímka prochází počátkem
souřadnic:
A = k c
k je směrnice přímky (tj. tangenta úhlu, který
svírá přímka s osou x):
k = ∆A/∆c
Převrácená hodnota směrnice přímky 1/k se
nazývá	kalibrační	faktor (F):
F = 1/k = ∆c/∆A
Pro výpočet koncentrace analytu v neznámém
vzorku potom platí:
cx	=	Ax F	
Poněvadž standard i analyzovaná látka mají za daných experimentálních podmínek stejnou
hodnotu molárního absorpčního koeficientu, tj. εstd = εx, získáme po dosazení z LambertovaBeerova
vztahu za ε rovnici Astd/(l cstd) = Ax/(l cx), z které pro koncentraci analytu v neznámém
vzorku vyplývá:
std
std
x
x c
A
A
c = 	
Koncentraci analyzované látky cx lze vypočítat ze změřených absorbancí analyzovaného vzorku
Ax a kalibračního roztoku Astd o koncentraci cstd, která je blízká koncentraci analytu v neznámém
vzorku cx. Absorbance jsou měřeny proti slepému vzorku.
Látky barevné (tj. látky výrazně absorbující viditelné záření) lze spektrofotometricky stanovit
přímo. Látky bez výrazného absorpčního maxima ve VIS/UV oblasti je třeba nejprve reakcí
s vhodným činidlem (derivatizací) převést na zbarvený produkt. Podmínkou je, aby množství
barevného produktu bylo úměrné koncentraci stanovované látky. Intenzita zabarvení roztoku
tímto barevným produktem je pak přímo úměrná koncentraci analytu v původním analyzovaném
roztoku a lze ji změřit spektrofotometrem.
Schopnost substrátu nebo produktu absorbovat světelné záření se využívá také ke stanovení
aktivity enzymů v biologickém materiálu. Používají se 2 základní metody měření enzymové
aktivity:
a) kinetická metoda
b) metoda konstantního času („end point“)
∆c
A
∆A
c
°
°
Ax
cx
×
°
°
°
14
Kinetická	metoda se používá častěji a je založena na kontinuálním sledování změny absorbance
roztoku v kyvetě spektrofotometru v absorpčním maximu substrátu nebo produktu. Rychlost
nárůstu nebo poklesu absorbance je pak úměrná enzymové aktivitě. Při metodě konstantního
času se enzym inkubuje se substrátem po předem určený čas, po jehož uplynutí je reakce
zastavena přídavkem inhibitoru a koncentrace produktu nebo substrátu je stanovena
fotometricky.
Při stanovení aktivity enzymů se často používá tzv. optického (Warburgova) testu, který je založen
na tom, že redukované kofaktory NADH a NADPH absorbují UV záření při 340 nm, zatímco
oxidované formy NAD(P)+ při této vlnové délce neabsorbují. Nárůst nebo pokles absorbance při
340 nm ukazuje na zvýšení nebo snížení koncentrace NADH a tím i na rychlost enzymové reakce.
Optického testu lze využít i ke stanovení aktivity enzymů, které nepatří mezi NAD(P)-dependentní
oxidoreduktasy. V tomto případě je produkt první reakce přeměněn v následné enzymové reakci,
která je katalyzována NAD(P)-dependentní oxidoreduktasou.
Např. enzymová aktivita alaninaminotransferasy (ALT) se stanovuje pomocí dvou spřažených
reakcí, kdy produkt první reakce pyruvát je v následné reakci katalyzované laktatdehydrogenasou
(LD) redukován pomocí NADH na laktát.