•1 Hemoglobin © Biochemický ústav LF MU (MK, ET) 2018 •2 Hemoglobin •Složená bílkovina - hemoprotein • • bílkovina = globin • • nebílkovinná část = hem: • tetrapyrolové jádro • Fe2+ • •! •Koncentrace hemoglobinu v krvi: 120 – 175 g/l •HOOC •HOOC •3 •Sekundární a terciární struktura globinů •A •H •His E7 •His F8 •4 •Struktura hemu •Prostetická skupina řady hemoproteinů (hemoglobin, myoglobin, cytochromy, hemové enzymy) •Hem je chelát protoporfyrinu (cyklického tetrapyrrolu) a kationtu železa •Čtyři pyrrolové kruhy jsou spojeny methinovými -CH= můstky •Hemoglobin: na pyrrolech jsou různé substituenty: 4x methyl, 2x vinyl, 2x propionát (hemy jiných hemoproteinů mají jiné substituenty) •Protože celý skelet obsahuje systém konjugovaných dvojných vazeb, hem je sloučenina planární a intenzivně červená •Hem je vázán na globin pomocí His F8, oxyHb má jako šestý ligand dikyslík, His E7 napomáhá koordinaci dikyslíku •Hem je v hydrofobní kapse – ochrana před oxidací Fe2+ • Hem je pevnou součástí řady hemoproteinů. Různé hemoproteiny mají různé hemy (odlišné substituenty) a různé oxidační stavy iontu železa, podle toho jakou mají funkci (přenos kyslíku či přenos elektronů, tedy účast v redoxní reakci). Z chemického hlediska je hem chelát (cyklický komplex) protoporfyrinu (cyklického tetrapyrrolu) s iontem železa. Čtyři pyrrolové kruhy jsou spojeny jednouhlíkatými methinovými (-CH=) skupinami (můstky). Pyrrolové kruhy nesou celkem osm substituentů (4x nepolární methyl, 2x nepolární vinyl, 2x polární ionizovaný propionát). Disociované skupiny propionátu (-COO^) jsou orientovány na povrch molekuly. Kation železnatý je vázán uprostřed systému na čtyři heteroatomy dusíku (= čtyři ligandy komplexu). V důsledku dokonalé konjugace všech dvojných vazeb v cyklickém skeletu je hem sloučenina planární (rovinná) a intenzivně barevná. Hem je tedy příčinou červené barvy hemoglobinu, globinový řetězec je bezbarvý. Planární hem je zasunut do úzké hydrofobní kapsy vymodelované zejména dvěma helikálními úseky E a F, a je připojen ke globinovému řetězci pomocí histidinu F8 (= pátý ligand železa). Je známou zkušeností, že vodné roztoky železnatých solí se na vzduchu snadno a rychle oxidují na železité. Totéž platí o volném hemu. Pokud bychom nechali volný hem ve vodném roztoku v kontaktu se vzdušným kyslíkem, ion železnatý se zoxiduje na železitý. Pokud je hem zabudován do terciární struktury hemoglobinu, hydrofobní prostředí vytváří ochranu před oxidací. Syntéza a katabolismus hemu •Syntéza •70-80 % kostní dřeň (hemoglobin), 15 % játra (cytochrom P450 aj.) •glycin + sukcinyl-CoA ®® porfobilinogen (= substituovaný pyrrol) •4 porfobilinogen ®® protoporfyrin ®® hem • • •Katabolismus •RES (slezina, kostní dřeň, Kupferovy buňky v játrech) •oxidační rozštěpení cyklického tetrapyrrolu na lineární tetrapyrrol •hem ®® biliverdin + CO + Fe2+ (katalyzuje: hemoxygenasa) •biliverdin ®® bilirubin (žlučové barvivo) • • •5 Syntéza hemu vychází z glycinu a energeticky bohatého meziproduktu citrátového cyklu (sukcinyl-CoA), vznikne aminokyselina zvaná aminolevulát. Kondenzací a cyklizací dvou molekul aminolevulátu vznikne derivát pyrrolu porfobilinogen. Čtyři molekuly porfobilinogenu postupně kondenzují na lineární tetrapyrrol, ten cyklizuje na cyklický tetrapyrrol a dalšími úpravami postranních substituentů nakonec vznikne červený protoporfyrin. V posledním kroku vznikne hem - chelát s dvojmocným kationtem železa (protoporfyrin + Fe^2+  hem). (Podrobněji bude syntéza hemu v přednášce Přeměny aminokyselin) Katabolismus hemu spočívá v oxidačním rozštěpení cyklického tetrapyrrolu na lineární tetrapyrrol. Jeden methinový můstek se oxidačně vyštěpí ve formě oxidu uhelnatého (CO) a vznikne biliverdin (zelený). Redukcí biliverdinu vznikne oranžový bilirubin, který se vylučuje žlučí. (Podrobněji bude katabolismus hemu v Biochemii II) •6 • a •b b • a • Hemoglobin je tetramer Hemoglobin •4 podjednotky globinu: podjednotky a a b • • • • • •HBA - složení a2b2 •(hlavní hemoglobin dospělých) •Genetická informace: řetězce a, b, g, d •Typy hemoglobinu: HbA2 (a2d2) • HbF (a2g2) Transportní funkce hemoglobinu •Transport O2 z plic do tkání •Transport H+ a malého množství CO2 ze tkání do plic •7 • •tkáně •Hb-O2 •O2 ve vzduchu: 21% •pO2 ve vzduchu: 21 kPa •pO2 v alveolech: 13-15 kPa Využití O2 ve tkáních: •Dýchací řetězec •Hydroxylace •Produkce ROS •Hb-2H+ •Hb-NH-COOH Hemoglobin (Hb) je protein erytrocytů, který vykazuje komplexní, vícenásobnou transportní funkci. Primární funkcí je transport dikyslíku (O[2]) z plic do tkání. Deoxygenovaný Hb na cestě zpět ze tkání do plic transportuje malé množství kovalentně vázaného oxidu uhličitého (tzv. karbamino-hemoglobin) a též určité množství protonů (H^+). Tato poslední akce je současně vyjádřením pufrační role hemoglobinu, respektive tzv. Bohrova efektu (viz dále, též fyziologie). Všechny tři transportní aspekty spolu úzce souvisejí. Elementární dikyslík je plyn, který je nepolární a proto velmi málo rozpustný ve vodě, tedy i v krevní plazmě. Koncentrace kyslíku v krvi prakticky odpovídá množství O[2] vázanému na Hb. Fyzikálně rozpuštěný kyslík představuje jen asi 1 % celkového kyslíku v krvi. Buňky potřebují kyslík především pro průběh dýchacího řetězce v mitochondriích a též pro specializované děje (hydroxylační reakce, produkce kyslíkových radikálů). Je vhodné zdůraznit, že všechny přeměny molekulárního dikyslíku ve tkáních jsou redukce (viz přednáška 1a). •8 •Transport kyslíku •vazba O2 na hemoglobin - na Fe2+ •Peptidový řetězec globinu •Fe2+ váže 6 ligandů: čtyři vazby na N pyrrolů • pátá vazba na His globinu • šestá vazba na dikyslík •9 •Vazba kyslíku v plicích – transport – uvolnění kyslíku v tkáních •oxyhemoglobin deoxyhemoglobin • HbO2 Hb • •Plíce - vysoký pO2 • - nasycení Hb kyslíkem •Tkáně - nízký pO2 • - uvolnění kyslíku z Hb • • •10 • • • plíce krev tkáň • • • • • • Hb Hb • • • • • HbO2 HbO2 • • •Zjednodušené schéma transportu O2 a CO2 mezi plícemi a tkáněmi •O2 •O2 •CO2+H2O • H2CO3 • HCO3- + H+ • H+ + HCO3- • HCO3- • H2CO3 •CO2+H2O • • •vydýchání •Uvolnění O2 z HbO2 v tkáních je podporováno 2,3-bisfosfoglycerátem •CC •11 • • • • • • • plíce krev tkáň •Zjednodušené schéma transportu CO2 mezi plícemi a tkáněmi •O2 •O2 •CO2+H2O • H2CO3 • HCO3- + H+ • H+ + HCO3- • HCO3- • H2CO3 •CO2+H2O • •vydýchání •HbO2 uvolňuje H+ , které reagují s HCO3- •Hb váže H+ , které se uvolnily disociací H2CO3 •Hb •Hb •HbO2 •HbO2 •Hb funguje také jako pufr. •12 •transport O2 transport CO2 • •HbO2 ve formě HCO3- 85 % • vázaný na bílkoviny (karbaminoHb) 10 % • fyzikálně rozpuštěný 5 % •Transport plynů krví Deriváty hemoglobinu •Karbaminohemoglobin (Hb-NH-COOH) •Glykovaný hemoglobin (HbA1c) •Karbonylhemoglobin (Hb-CO) •Methemoglobin (Hb-Fe3+) • •Vznikají fyziologicky v malém množství.í •13 Glykovaný hemoglobin vzniká neenzymovou reakcí •14 •al-D-glukosa •(aldehydová forma) •- H2O •aldimin •(Schiffova báze) •ketoamin •(fruktosamin) •izomerace •hemoglobin •glykovaný hemoglobin •. Schéma ukazuje kovalentní navázání glukosy na globinový řetězec hemoglobinu. Glukosa reaguje ve svém acyklické aldehydové formě. Dojde k adici aminoskupiny na aldehydovou skupinu glukosy, eliminaci vody a vzniku aldiminu (Schiffova báze). Dalším krokem je izomerace = přesun dvojné vazby a dvou atomů H, vznikne derivát fruktosy (fruktosamin). Podle toho, na kterou aminoskupinu a na který řetězec tetrameru se glukosa naváže, rozlišujeme různé frakce glykovaného hemoglobinu. Glykovaný hemoglobin jako analyt •HbA1c – nejdůležitější frakce glykovaného hemoglobinu A • •Význam stanovení HbA1c •Množství HbA1c odráží koncentraci glukosy v krvi po celou dobu existence erytrocytu, tj. asi 120 dní, a využívá se proto k posouzení úspěšnosti léčby/kompenzace diabetu v období přibližně 8 týdnů před vyšetřením. •Výhoda: není nutné lačnění, odběr lze provést kdykoliv (na rozdíl od FPG, fasting plasma glucose, nebo oGTT). • •Referenční interval (dospělí) • • •15 HbA1c (mmol/mol) Interpretace 20 – 42 fyziologické hodnoty 43 – 53 kompenzovaný diabetes > 53 dekompenzovaný diabetes, nutná změna léčby Glykovaný hemoglobin (HbA[1c]) vzniká neenzymovou reakcí volné glukosy s aminoskupinou Hb. Je to cenný analyt v klinické biochemii. Jeho hladina v krvi poskytuje informaci o kompenzaci diabetu za posledních cca 8 týdnů před vyšetřením. Stanovení HbA[1c] se provádí u diabetiků zpravidla čtyřikrát ročně. Používá se následující terminologie: Glykovaný hemoglobin – suma sacharidových aduktů na N-terminálním konci nebo -aminoskupinách lysinu v hemoglobinu. HbA[1] – suma různých minoritních frakcí hemoglobinu A (glykovaných). HbA[1c] – glukosový adukt valinu na N-terminálním konci β-globinu; odpovídá tzv. stabilnímu ketoaminu (deoxyfruktosylhemoglobin). Množství HbA[1c] odráží koncentraci glukosy v krvi po celou dobu existence erytrocytu, tj. asi 120 dní, a využívá se proto k posouzení úspěšnosti léčby/kompenzace diabetu v období cca 8 týdnů před vyšetřením. Glykovaný a neglykovaný hemoglobin mají rozdílný náboj, čehož se často využívá pro jeho stanovení. Glykovaný hemoglobin je stanovován pomocí HPLC, případně se používají ELISA nebo elektroforetické techniky Podíl látkové koncentrace HbA[1c] na celkovém hemoglobinu krve (mmol/mol Hb) je v současné době pokládán za rutinní a nejvíce efektivní nástroj sledování průběhu DM. Představuje nejlepší způsob kontroly koncentrace glukosy u diabetika, neboť je považován za její vážený průměr. •16 •• karbonylhemoglobin - HbCO • vazba CO na hemoglobin • •• methemoglobin • oxidovaná forma hemoglobinu (obsahuje Fe3+) • •Zábrana transportu kyslíku •CO •globin •17 •• vazba CO na hemoglobin (na Fe2+) • CO se váže pevněji než O2 (až 200x) • karmínově červené zbarvení • otrava CO • prostředí obsahující 0,1% CO – smrtelná koncentrace • • • terapie – ventilace s vysokým pO2, hyperbarická léčba •Karbonylhemoglobin • HbCO •! dum-pozar-hasici-aktu vyfukove-plyny •18 •Příznaky otravy CO Hodnoty HbCO v % (*) Příznaky 10 Při větší námaze dušnost 20 - 40 Bolesti hlavy, dušnost, únava, zvracení 40 - 60 Hyperventilace, tachykardie, křeče 60 - 80 Kóma, smrt •* - hodnoty HbCO v % z celkového Hb •19 •Karbonylhemoglobin v krvi Jedinec HbCO (%) * Novorozenec 0,4 Dospělý (venkov) 1-2 Dospělý (město) 4-5 Kuřák 10-12 Dopravní policista 12-15 •* - % HbCO z celkového hemoglobinu (Hb) •20 • • oxidovaná forma hemoglobinu (obsahuje Fe3+) • nepřenáší O2 • vznik: působení - chlorečnanů, dusitanů, dusičnanů • odstranění methemoglobinu: enzymaticky (methemoglobinreduktasa) • methemoglobinemie: ohroženi jsou především kojenci • (limit pro NO3- v pitné vodě = 50 mg/l) • • •Methemoglobin Methemoglobin v krvi •21 Hb-Fe3+ (%) Komentář Pod 15 % většinou bez obtíží 15 – 20 % cyanóza, mírné obtíže, bolest hlavy, dušnost 20 – 45 % výrazná cyanóza 45 – 70 % tmavě čokoládová cyanóza, pod nehty, na rtech, ušních boltcích Nad 70 % letální průběh •(Procenta z celkového hemoglobinu) Hemoglobinopathie a další choroby •22 Porucha Biochemická podstata Sideropenická anémie nedostatečný příjem nebo ztráty Fe, nejčastější anémie Megaloblastická anémie •snížená absorpce vitaminu B12 (nejčastěji deficit vnitřního faktoru) •deficit folátu (snížený příjem, absorpce, zvýšená potřeba) Srpková anémie bodová mutace, abnormální hemoglobin S Methemoglobinemie zvýšená koncentrace methemoglobinu, vrozená nebo získaná Thalasemie mutace v genu pro α/β-řetězec Anemie z nedostatku železa (sideropenická). Nedostatek Fe může mít různé příčiny. Důsledkem je snížená tvorba hemoglobinu v erytroblastech. Vznikající erytrocyty jsou menší a chudší na hemoglobin, jejich membrána je méně stabilní a ve slezině dochází k jejich předčasné eliminaci, též zvaná mikrocytární anemie. Megaloblastická (makrocytární) anemie. Anemie spojená s nálezem zvětšených erytrocytů (makrocytů) v krvi a dřeni. Je změněna morfologie normoblastů, mění se na megaloblasty. Příčinou je nedostatečná syntéza DNA v prekurzorech erytrocytů způsobená nedostatkem vitaminu B[12] nebo kyseliny listové. Oba vitamíny jsou potřebné pro syntézu purinových a pyrimidinových nukleotidů. Nedostatečná syntéza DNA způsobuje, že prekurzory erytrocytů nemohou přejít z G2 fáze k mitóze. Syntéza RNA bílkovin včetně hemoglobinu není porušena. V důsledku toho buňky rostou bez mitózy a stávají se z nich makrocyty. Thalasemie zahrnuje heterogenní skupinu chorob s poruchou syntézy α-globinového řetězce (α-thalasemie) nebo β-globinového řetězce (β-thalasemie). Druhý řetězec se syntetizuje v normálním množství a protože je v relativním nadbytku, precipituje v erytrocytech a způsobuje jejich předčasnou destrukci a prohlubuje hypochromní anemii. Heterozygoti thalasemie jsou odolnější vůči malárii. Hemoglobin jako analyt •23 Muži 135 – 175 g/l 2,1 – 2,7 mmol/l Ženy 120 – 160 g/l 1,9 – 2,5 mmol/l Snížené hodnoty •nadměrný rozpad erytrocytů (hemolytická anémie, hemoglobinopatie) •snížená produkce hemoglobinu (např. thalasemie) •krvácení do zažívacího traktu (vředová choroba aj.) •poruchy výživy jako nedostatek železa, kys. listové a vitaminu B12 •poškození nebo onemocnění kostní dřeně •selhání ledvin (nedostatečná produkce erytropoetinu) Zvýšené hodnoty •polycytemia vera (nadměrná tvorba erytrocytů) •nádory ledvin produkující nadbytek erytropoetinu •pobyt ve vysokých nadmořských výškách (kompenzace nízkého pO2) •dehydratace •M (tetramer) = 64 000 g/mol Koncentrace hemoglobinu v krvi se vyjadřuje v g/l nebo v mmol/l (tetramer). Všimněte si zřetelné genderové diference, muži mají v průměru vyšší koncentraci hemoglobinu v krvi. To souvisí s tělesnou konstitucí a obecně vyšším metabolickým obratem u mužů. Vyšetření hemoglobinu je zpravidla součástí vyšetření krevního obrazu, které může být indikováno v rámci pravidelných preventivních prohlídek, případně při dlouhodobém sledování zdravotního stavu pacienta. Tabulka uvádí přehled nejdůležitějších stavů, při kterých jsou hodnoty hemoglobinu snížené a zvýšené. •24 •Myoglobin •• monomer • 1 globin, 1 hem • (Fe2+) •• vazba kyslíku •• svaly, srdce • •25 • • •Odbourání hemoglobinu • probíhá v retikuloendotelovém systému (RES): • slezina, kostní dřeň, játra • erytrocyty: doba života 120 dní • rozpad ery, uvolňuje hemoglobin • odbourání hemoglobinu • •Hemoglobin hem bilirubin do žluče • • do střeva přeměny bilirubinu stolice • •Základní schéma odbourání •játra •střevo •26 •Přeměna hemoglobinu na bilirubin •hemoglobin •globin •hem •bilirubin •CO • Fe2+ • z hemoglobinu se odštěpuje: • globin, CO, Fe2+ • uvolňuje se hem • degradace hemu: • biliverdin – zelený → • bilirubin - oranžový (nekonjugovaný) •nekonjugovaný bilirubin – • transport do jater (ve vazbě na albumin) •27 •Tvorba konjugovaného bilirubinu •nekonj. bilirubin •Játra • nekonj. bilirubin vstupuje do jater • játra: • - vznik konjugovaného bilirubinu • konjugace bilirubinu s kyselinou glukuronovou • - vylučuje se do žluče •žluč •konjugovaný bilirubin •28 • •Vylučování a přeměny konjugovaného bilirubinu •konjugovaný bilirubin •játra • konjugovaný bilirubin se dostává do žluče a pak do střeva • střevo: • - přeměna na urobilinogen a pak na další produkty • - vyloučení degradačních produktů bilirubinu (urobilinogenu) stolicí • - část urobilinogenu zpět do jater, poté opět do žluče • - malé množství urobilinogenu přechází do krve •konjugovaný bilirubin •urobilinogen •stolice •žluč •krev •střevo •moč •ledviny •29 •Hyperbilirubinemie •Ikterus - žloutenka • Příčina Typ hyperbilirubinemie • zvýšené odbourání hemoglobinu …….. .hemolytický • nekonjugovaný bilirubin ↑ • porucha ve funkci jater ………………… .hepatocelulární • konjugovaný i nekonjug bilirubin ↑ • snížená propustnost žlučovodů ………….obstrukční • konjugovaný bilirubin ↑ •Zvýšená koncentrace celkového bilirubinu v séru ANd9GcQvZyIOArhUqZFV80GobbH4WAAenkn8thKHet_Lg4yJ7gNYF6zCjA •Referenční hodnota celkového bilirubinu v séru: 5-20 mmol/l •30 •Novorozenecká žloutenka - nezralost jaterního systému - zvýšená hladina nekonjugovaného bilirubinu - fototerapie - https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/0/09/Phototherapy.jpg