Replikace a transkripce DNA •1 •Ó Biochemický ústav LF MU 2018 (ET, JG) •2 •Replikace DNA üReplikace (reduplikace) = zdvojování üKaždé ze dvou mateřských vláken DNA slouží jako templát pro syntézu komplementárních vláken üV nových řetězcích se báze řadí na principu komplementarity vůči bazím v templátovém řetězci üProbíhá v jádře Při replikaci vzniknou z jedné mateřské molekuly DNA dvě naprosto stejné dceřiné DNA – každá s jedním vláknem z původní DNA → jedná se tedy o semikonzervativní proces, kdy nově vzniklá dvoušroubovice má vždy jedno vlákno původní a druhé vlákno nově syntetizované. •3 üIniciace ü üElongace ü üSpojení a terminace •3 fáze replikace DNA •Obecné rysy replikace u prokaryontů a eukaryontů •4 •Látkové faktory potřebné k syntéze DNA • ü dATP, dCTP, dGTP, dTTP üMg2+ ü primer RNA ü templát DNA (mateřské vlákno) ü ü ü •5 •Enzymy potřebné pro syntézu DNA •(různé u prokaryontů a eukaryontů) üDNA-helikáza (rozplétací enzym) üRNA-polymeáza üDNA-dependentní DNA-polymeráza üDNA-ligáza üATP-áza ü(topoisomeráza) •6 •všechny DNA polymerázy navazují nukleotidy na 3´-konec primeru • nová DNA vzniká ve směru 5´®3´ •Chemická reakce syntézy DNA üVlastní syntéza je katalyzována DNA-polymerázami üDo reakcí s již vytvořenou DNA (nebo primerem RNA) vstupuje deoxyribonukleotidtrifosfát (dNTP) üOdštěpuje se difosfát a dNMP se připojí esterovou vazbou ü •7 •Připojení deoxynukleotidu při elongaci řetězce DNA •dNTP2 reaguje s 3´koncem primeru • •3´konec stávajícího řetězce •8 •prodlužování řetězce •dNTP3 •+ PPi •Vzniká esterová vazba mezi 3´-OH skupinou stávajícího řetězce a 5´-fosfátem vstupujícího nukleotidu •5´ •3´ •9 Soubor:DNA replication split.svg •Co se děje při zahájení replikace üiniciace replikace – dvoušroubovice DNA musí být rozpojena ü místo, kde je rozvíjení zahájeno, se nazývá počátek (origin) ü vytváří se replikační vidlice ü další rozvíjení provádí enzym helikáza ü reasociaci řetězců zabrání ssb-proteiny (single strain binding protein, replication protein A RPA u ekaryontů) ü podle matrice obou mateřských vláken probíhá syntéza vláken nových ü •10 •rozplétací protein (ATP-dependentní) (DNA-helikáza) •ATP •ADP • •proteiny stabilizující jednovláknovou strukturu •(ssb-proteiny = single strain binding) •3´ •5´ • • • K dalším proteinům, které se podílí na zahájení replikace patří: Helikasa – rozvíjí dvojitý helix, štěpí vodíkové vazby mezi bázemi. Spotřebovává přitom ATP. Tvoří strukturu nazývanou jako replikační vidlice. Ssb proteiny (single-stranded DNA-binding proteins) – vážou se k jednovláknové DNA uvolněné působením helikasy a dočasně ji stabilizují. Současně brání nukleasovému účinku enzymů na ss-DNA. U eukaryontů se označují jako RPA proteiny. •11 •K syntéze DNA je potřebný RNA primer üDNA polymeráza neumí iniciovat syntézu nových řetězců üPro svou funkci vyžaduje volnou 3´-OH skupinu üTuto skupinu zajišťuje RNA primer (10–20 bází) üRNA primer je syntetizován ve směru 5´®3´účinkem RNA polymerázy (primasy) üPrimer je kódován podle odpovídající sekvence templátu ü •3´ •RNA-DNA hybrid • • DNA-polymerasa neumí iniciovat syntézu nových řetězců. Pro svou funkci vyžaduje volnou 3´-OH skupinu, na niž navazuje deoxyribonukleotid. Pro zahájení účinku DNA-polymerasy je nezbytný RNA primer ( cca10-200 bází). RNA primer je syntetizován ve směru 5´3´účinkem RNA polymerasy (primasy, DnaG). U eukaryontů má primasovou aktivitu jedna z podjednotek DNA polymerasy . Pro syntézu jsou potřebné ribonukleotidy Primer je kódován podle odpovídající sekvence templátu. Rozdílná schopnost RNA- a DNA-polymeráz zahájit de novo syntézu řetězce souvisí s tím, že DNA-polymerázy kontrolují a případně korigují párování posledního nukleotidu v řetězci, než ho prodlouží o další nukleotid ( viz proof-reading) •12 •Po vytvoření primeru se na 3´-konci RNA syntetizuje DNA působením DNA polymerázy • • •3´ •5´ •Primer RNA •Nová DNA •Elongace Po vytvoření primeru se na 3´-konci RNA může začít syntetizovat DNA působením DNA polymerasy. DNA polymerasa postupně připojuje deoxyribonukleotidy ke 3‘ konci rostoucího řetězce. Řetězec tak roste ve směru 5‘3‘. U prokaryontů se uplatňuje hlavně DNA polymerasa III, u eukaryontů nejprve DNA polymerasa  a dokončení DNA syntézy proběhne účinkem polymeras  a . Replikující DNA polymerasa je k replikované DNA připojena speciálním proteinem „svorkou“ (sliding clamp) Všechny deoxyribonukleotidy musí být v jádru dostupné, jinak se syntéza zastaví. •13 •Po ukončení syntézy DNA se primer RNA odbourá 5´®3´exonukleázovou aktivitou a vzniklá mezera je nahrazena DNA působením 5´®3´polymerázové aktivity •Odbouraná RNA •Oba úseky DNA se spojí DNA-ligázou • • •3´ •5´ DNA polymerasa pokračuje v syntéze DNA dokud není zastavena blízkostí RNA primeru. Jakmile tak nastane, RNA je odstraněna 5‘3‘exonukleasovým účinkem. U prokaryontů vykazuje tento exonukleasový účinek DNA polymerasa III, vzniklá mezera je zaplněna dosyntetizováním DNA řetěze ve směru 5‘3‘ DNA polymerasou I. U eukaryontů jsou RNA primery odstraněny speciálními RNAasami. •14 •Syntéza nové DNA probíhá vždy ve směru 5´® 3´ •Bez problému tedy proběhne podél mateřského řetězce A •3´ •Mateřský řetězec A •Mateřský řetězec B •Jak bude probíhat syntéza podél řetězce B ? •5´ •5´ •5´ •3´ •3´ •Syntetizuje se kontinuálně •vedoucí vlákno (leading strand) •opožďující se (otálející) vlákno (lagging strand) • Čtení DNA probíhá vždy od 3‘ k 5‘ a proto může během replikace docházet ke kontinuální replikaci jen jednoho z obou řetězců – tzv. vedoucího řetězce. Pro zpožďující se řetězec je směr čtení opačný k pohybu replikační vidlice. •15 • • • •Na otálejícím řetězci vznikají Okazakiho fragmenty • • • •Okazakiho fragmenty opožďujícího se řetězce •Okazakiho fragmenty se syntetizují ve směru 5´®3´ •Syntéza RNA primeru je katalyzována primázou, následuje účinek DNA polymerázy •3´ •5´ •5´ •3´ • •primer RNA •nová DNA •Vedoucí řetězec •Mateřský řetězec A •Mateřský řetězec B •5´ •5´ •3´ •5´ •3´ Nový řetězec na opožďujícím se vlákně se syntetizuje po částech, které se podle svého objevitele nazývají Okazakiho fragmenty. Každý z těchto fragmentů začíná na svém 5‘-konci primerem z přibližně 10 RNA-nukleotidů vytvořeným primasovou aktivitou. Primer slouží jako startovací sekvence pro DNA-polymerasu (DNA polymerasa III u prokaryontů, DNA polymerasa  a po té  u eukaryontů). •16 • •Okazakiho fragmenty •3´ •5´ •5´ •3´ •Při pokračující replikaci jsou úseky RNA v Okazakiho fragmentech odstraněny exonukleázou, polymeráza vyplní prázdná místa a ligáza spojí fragmenty DNA •otálející řetězec – replikace probíhá diskontinuálně • Nové fragmenty DNA na opožďujícím se vlákně nejsou ještě spojeny a mají na svých 5‘ koncích RNA. Ta je postupně odštěpována exonukleasovými aktivitami enzymů (DNA polymerasa I u prokaryontů, speciální RNasy u eukaryontů). Mezery jsou následně vyplněny DNA (DNA polymerasa I u prokaryontů, DNA polymerasa  u eukaryontů). Spojení jednotlivých úseků zajistí DNA ligasa. Replikce eukaryontů je pomalejší (100bp/s) než replikace prokaryontů (1000bp/s •17 ü replikace je prekaryontů i eukaryontů vždy zahájena v počátku ü počátek je určitá specifická sekvence bází a váží se k němu specifické proteiny (předprimerové proteiny) ü replikace probíhá v obou směrech od každého počátku, vznikají dvě replikační vidlice, které se od sebe vzdalují ü vznikají replikační bubliny - replikony •5´ •3´ •3´ •5´ •Iniciace replikace •počátek •Rozdíly mezi eukaryonty a prokaryonty •18 •Iniciace replikace u prokaryontů •Ori-vážící proteiny • • • • •Počátek (bohatý na A,T sekvence) •Denaturace v A,T oblasti •Replikace začíná v počátku a pokračuje, dokud se obě vidlice nesetkají •19 ü eukaryotické chromozomy jsou tvořeny dlouhými molekulami DNA, které nemohou být replikovány kontinuálně. üProto replikace těchto velkých molekul vyžaduje zahájení na několika místech současně. üSekvence počátků u eukaryontů dosud podrobně nepopsány. ü ü počátek replikace až na 30 000 místech současně ü zahájení je řízeno prostorově i časově, nemusí být zahájeno na všech počátcích současně ü rychlost replikace je menší než u prokaryontů ü probíhá v S fázi ü •Iniciace replikace u eukaryontů •20 •Iniciace replikace u eukaryontů •3´ •5´ •zahájení replikace •směr replikace •replikační počátek •replikon •spojení replikonů •21 •Enzymy prokaryontní replikace Polymeráza Polymerázová aktivita (u všech 5´ → 3´) Exonukleázová aktivita DNA polymeráza I Vyplnění místa po RNA, opravy DNA, odstranění RNA primerů 5´→3´ i 3´→5´ DNA polymeráza II Opravy DNA 3´→5´ DNA polymeráza III Replikace 3´→5´ DNA polymeráza IV Replikace poškozené DNA DNA polymeráza V Replikace poškozené DNA •22 •Enzymy eukaryontní replikace* Polymeráza Polymerázová aktivita (u všech 5´ → 3´) Exonukleázová aktivita DNA polymeráza a Primáza, opravy DNA žádná DNA polymeráza b opravy DNA žádná DNA polymeráza g replikace v mitochondriích 3´→5´ DNA polymeráza d replikace, opravy DNA 3´→5´ DNA polymeráza e replikace 3´→5´ •* Je známo kolem 13 polymeráz •23 •Korekce struktury DNA üPřesnost duplikace struktury ~ 1 chyba/109 párů bází üZajištěno korekční aktivitou DNA-polymeráz (proofreading) a kontrolou správného párování (mismatch repair) . üKontrola konců vznikajících řetězců – srovnání nově zařazené báze na 3´konci s templátem. üPokud je zařazena chybná báze, pomocí 3´®5´ exonukleázové aktivity se chybně spárovaný nukleotid odštěpí ü • •DNA-polymerázy mají 5´®3´polymerázovou aktivitu a 3´®5´exonukleázovou aktivitu Pro zachování života každého organismu je nesmírně důležité zachování správné sekvence replikované DNA. Aby byla zajištěna maximální shoda v sekvenci bází probíhá při každém zařazení nového nukleotidu do struktury DNA zpětná kontrola správného spárování s bází v templátovém řetězci. Tato kontrola se označuje jako zpětné čtení (proofreading) a je zajišťována DNA polymerasami (u prokaryontů je to DNA polymerasa III, u eukaryontů polymerasy  a ). Tyto enzymy nejprve zkontrolují správnost zařazení poslední báze v řetězci DNA a v případě detekce chyby, je zahájena 3‘5‘ exonukleasová aktivita, pomocí které je nesprávně zařazený nukleotid hydrolyticky odštěpen. •24 •Další enzymy podílející se na replikaci Helikáza Oddělují vlákna DNA SSB-proteiny Zabraňují reasociaci vláken DNA Topoisomerázy Uvolňují pnutí vyvolané superstáčením Enzymy odstraňující primer (RNA-sy) Hydrolyzují RNA z RNA-DNA hybridů DNA ligázy Telomerázy Sliding clamp (klouzavá svorka) Spojují úseky DNA fosfodiesterovou vazbou úprava 3´konce templátu Udržuje DNA polymerasu ve vazbě na DNA •25 •Topoisomerázy •(Topologie DNA = trojrozměrná struktura DNA) üU dvojité DNA dochází často k superstáčení üSuperstáčení může být pozitivní (ve stejném směru jako stočení helixu, doleva) nebo negativní (v opačném směru jako helix, doprava) üSuperstáčení může být odstraněno topoisomerázami üDNA topoisomerázy mají řadu funkcí (při replikaci, transkripci, ukládání DNA do buněk, při opravách) •26 •Reversibilně přerušuje fosfoesterovou vazbu v jednom řetězci, umožní otáčení kolem jednoho řetězce (uvolnění superstočení) a katalyzuje opětné spojení řetězců – integruje nukleázovou a ligázovou aktivitu. •Nevyžaduje energii (mezi koncem přerušeného řetězce a enzymem vzniká dočasně vysokoenergetická kovalentní vazba). •Je u prokaryontů i eukaryontů. • •Topoisomerázy třídy I • •Topoisomerázy třídy II •Může relaxovat superstočenou DNA nebo superstáčení zavádět. •Štěpí oba řetězce. • •Je u prokaryontů (DNA gyráza) i eukaryontů, má různou specifitu. • •Pro spojení řetězců vyžaduje ATP. •Topoisomerázy Topoisomerasy jsou ubikvitární enzymy nacházející se ve všech buňkách, umožňující přechod dvouřetězcové DNA z jednoho prostorového uspořádání do druhého, a to tak, že přeruší vlákno DNA, umožní daný přechod a vlákno opět spojí. DNA topoisomerasy mají řadu funkcí (při replikaci, transkripci, ukládání DNA do buněk, při opravách). DNA-topoisomerasy typu I přerušují pouze jeden řetězec, DNA-topoisomerasy typu II (tzv. gyrasy) přerušují oba řetězce a spojují je za účasti ATP. •27 •Účinek topoisomerázy I •Přerušení fosfoesterové vazby následované rotací kolem druhého vlákna a opětným spojením •28 •Inhibitory lidské topoisomerázy = zabraňují replikaci •protinádorové léky Typ inhibitoru Inhibitory topoisomerázy I Topotecan, irinotecan Inhibitory topoisomerázy II Etoposid Inhibitory topoisomerázy II s interkalační aktivitou Antracykliny (Doxorubicin, Epirubicin) Inhibitory bakteriální gyrázy Fluorochinolony (Norfloxacin, Ciprofloxacin, Nalidixin) Snímek uvádí příklady inhbitorů topoisomeras, které našly uplatnění v klinické praxi jako protinádorové látky (viz též Biologie). Topotecan a irinotecan jsou synteticky odvozené deriváty alkaloidu kamtothecinu z kůry rostlinného druhu Camptotheca acuminata. Antracykliny jsou bakteriální produkty. Antibakteriální léky na bázi chinolonů (norfloxacin) inhibují bakteriální gyrasu – nepůsobí však na humání topoisomerasu. Etoposid je syntetickým derivátem přírodního lignanu podophyllotoxinu. •29 •podofyllotoxin •kamptothecin Camptotheca acuminata Podophyllum peltatum ad. •N •N •O •O •O •H •H •5 •C •2 •O •H •O •O •C •H •3 •O •O •C •H •3 •O •C •H •3 •O •O •30 •Telomery üzvláštní sekvence DNA na koncích chromosomů ütandemy druhově specifických oligonukleotidů, bohatých na G ü(u člověka TTAGGG až 1000x) ümají ochrannou funkci (před působením enzymů) üPři syntéze opožďujícího řetězce vyžaduje replikační aparát přítomnost určité délky templátové DNA za sekvencí, která má být kopírována. üSyntéza opožďující se DNA by se zastavila před koncem templátu. Telomery jsou komplexy nekódující DNA s proteiny (shelteriny), které se nacházejí na koncích lineárních (eukaryontních) chromozomů. Udržují strukturní integritu chromozomů, zabraňují jejich napadení nukleasami a umožňují reparačním systémům odlišit „pravé konce“ DNA od zlomů v dsDNA. U člověka se telomerní DNA skládá z několika tisíc tandemových repetic s nekódující hexamerní sekvencí AGGGTT, které jsou komplementárně párovány s TCCCAA na paralením vláknu DNA. U většiny somatických buněk se telomery nemohou během replikace úplně zdvojit, protože syntéza nové DNA na 5‘ konci opožďujícího se řetězce je nekompletní. Proto se při každém buněčném dělení zkracují, až se konečně replikace zastaví. Jednobuněční živočichové, embryonální, kmenové i nádorové buňky obsahují enzym telomerasu, který telomery opět doplňuje. •31 •Telomerasa ü nachází se např. v buňkách zárodečné linie, kmenových buňkách kostní dřeně, stimulovaných T a B lymfocytech a v buňkách nádorově transformovaných. üdokončení syntézy DNA na opožďujícím se vlákně ü je reverzní transkriptáza – ve své struktuře nese RNA templát, ten prodlouží 3´konec templátové DNA na základě syntézy DNA přepisem z RNA üHexanukleotid AGGGTT se procesem reverzní transkripce opakovaně připojuje na 3´-konec templátového vlákna • •http://faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/Telomerase.html • •RNA templát je součástí telomerázy •Vlákno templátového řetězce B je prodlouženo na základě reverzní transkripce z templátu RNA •TTAGGG •Směr pohybu telomerázy •5´ •3´ •Templátové vlákno B Telomerasa je proteinový komplex, který funguje jako reversní transkriptasa a současně nese krátký úsek RNA, který funguje jako templát pro reverzní transkripci. Telomerasa se připojí k 3‘ konci dsDNA a s využitím tempátu RNA a reversní transkriptasové aktivity postupně prodloužuje 3‘-konec. Nepotřebuje k tomu DNA templát. •32 •Dokončení syntézy DNA na 3´-koncích chromozomů •replikující se vedoucí řetězec není zakreslen • • • • • • •5´- •3´- •pol e •Templátový řetězec •Telomerní DNA •RNA-primer •Účinek telomerázy •DNA-polymeráza dosyntetizuje opožďující se řetězec •opožďující se řetězec Po té co byl 3‘-konec prodloužen reversní transkriptasou, může být dosyntetizován opožďující se řetězec pomocí DNA polymerasy . Délka telomer koreluje se stářím a replikační kapacitou buňky buňky získané od mladších jedinců mají delší telomery a mohou podléhat většímu počtu dělení většina diferencovaných somatických buněk nemá telomerasu – pokud jsou pěstovány v kulturách, přežijí určitý počet cyklů, pak odumírají zkrácení telomer chromosomů buněk může vyvolat změnu struktury nebo počtu chromozomů, které vedou k apoptóze nebo nádorovému bujení buňky, které se často dělí (zárodečné, kmenové a nádorové) mají vyšší hladinu telomerasy inhibitory telomerasy mohou být užitečné v terapii nádorů •33 •Délka telomer koreluje se stářím a replikační kapacitou buňky ? übuňky získané od mladších jedinců mají delší telomery a mohou podléhat většímu počtu dělení üvětšina somatických buněk nemá telomerázu – pokud jsou pěstovány v kulturách, přežijí určitý počet cyklů, pak odumírají ü snížená aktivita telomerázy pravděpodobně souvisí se stářím organismu ü buňky, které se často dělí (zárodečné, kmenové a nádorové) mají vyšší hladinu telomerázy ü inhibitory telomerázy mohou být užitečné v terapii nádorů •34 •Poškození a opravy DNA •Hrubý odhad počtu poškozujících zásahů do DNA v lidské buňce: cca104-106 bází /den •Þ u dospělého člověka (1012 buněk) se jedná o 1016-1018 opravných kroků za den. üPřes důkladný proofreading uplatňovaný během syntézy a mismatch repair se mohou ve struktuře DNA objevit chyby. ü üNavíc je DNA permanentně poškozována vnějšími vlivy jako jsou chemikálie (mutageny), nebo různé typy záření. ü ü DNA může být poškozena mnoha endogenními i exogenními vlivy, které vyvolají modifikaci nukleotidů, delece, inserce, transpozice, zmšěny sekvence atd. Některé změny vznikají sekundárně po chemické modifikaci DNA alkylačními činidly, reaktivními kyslíkovými radikály nebo ionizačním zářením. Mohou být poškozeny jak cukerné složky, tak báze. •35 •Poškození a opravy DNA Typ poškození Příčina Chybějící báze Depurinace (104purinů za den) Změněná báze Ionizační záření, alkylační činidla Nepřesná báze Spontánní deaminace Delece-inserce Interkalační činidla (akridiny) Formace dimerů UV záření Zlomy řetězců Ionizační záření, chemikálie (bleomycin) Meziřetězové vazby Chemické látky (deriváty psoralenu, mitomycin c) Tvorba tautomerů Spontánní a dočasná •36 •Poškozená DNA je v buňkách opravována reparačními enzymy •Buňky mají k dispozici opravné systémy : ü přímá oprava (zvratem – jen u bakterií) ü vystřižení porušené báze („base excision repair“) ü vystřižení porušeného nukleotidu („nukleotide excision repair“) ü oprava chybného párování („mismatch repair“) ü opravy dvojitých zlomů – homologní rekombinace, nehomologní spájení konců üprevence inkorporace porušeného nukleotidu do DNA • •Mutace, které vzniknou během DNA replikace jsou opravovány zpětnou kontrolu správného zařazení posledního nukleotidu (3´®5´proofreading) •37 •Příklady oprav vystřižením báze •5´-ATGCUGCATTGA •3´-TACGGCGTAACT • •5´-ATGC GCATTGA •3´-TACGGCGTAACT •5´-ATGC GCATTGA •3´-TACGGCGTAACT •5´-ATGCCGCATTGA •3´-TACGGCGTAACT •5´-ATGCCGCATTGA •3´-TACGGCGTAACT •Deaminace cytosinu na uracil •Uracil-N-glykosylasa odstraní bázi, vznik AP míst (apyrimidinové místo) •AP endonukleasa štěpí fosfodiesterovou vazbu v místě chybějící báze, zbylá ribosa je vyštěpena exonukleasou •Mezera je vyplněna inzercí cytidin fosfátu účinkem DNA polymerasy b •Spojení ligasou •38 •Příklady oprav vystřižením nukleotidu •5´-ATGCCGCATTGATAG •3´-TACGGCGTAACTATC • •5´-ATGCCGCATTGATAG •3´-TACGGCGTAACTATC • •5´-AT AG •3´-TACGGCGTAACTATC •5´-ATGCCGCATTGATAG •3´-TACGGCGTAACTATC •5´-ATGCCGCATTGATAG •3´-TACGGCGTAACTATC •Vznik thyminového dimeru radiací •Zlom vyvolaný dimerem je rozpoznán komplexem endonukleasy nazývané excinukleasa. Ta vystřihne defektní oblast zahrnující kolem 30 nukleotidů (endonukleasový a exonukleasový účinek • •Nahrazení vystřižených bází působením DNA polymerázy a. •Opětné spojení řetězce ligázou •39 •Mutace mitochondriální DNA ümitochondrie jsou 10x náchylnější na poškození DNA více než DNA jaderná ünemá takové množství opravných systémů jako jaderná DNA ümitochondrií je v buňce mnoho a jejich DNA se musí dělit stejně často jako se dělí buňka sama, nedělí se však jen jedna mitochondrie, nýbrž všechny mitochondrie v buňce přítomné, tím stoupá pravděpodobnost vzniku chyby ümitochondriální DNA nemá histony, ümitochondriální DNA je velice blízko dýchacímu řetězci a tedy i radikálům, které se při reakcích v dýchacím řetězci tvoří Mutace mitochondriální DNA vyvolávají mitochondriální dysfunkce Mutace v mtDNA vznikají daleko častěji než v jaderné DNA, hlavně v důsledku působení volných kyslíkových radikálů, které vznikají v dýchacím řetězci. Navíc systém na ochranu a opravy mitochondriální DNA není tak „přísný“ jako u jaderné DNA. Mutace může být přítomná ve všech molekulách mtDNA, pak je označována jako homoplazmická, je-li mutací postižena pouze část molekul mtDNA, označuje se jako heteroplazmická. Poměr mezi mutovanými a nemutovanými kopiemi mtDNA v dané tkání se pohybuje od 0 do 100% a označuje se jako hladina heteroplazmie. K funkčním projevům mutace v mtDNA dojde pouze tehdy, když podíl molekul mtDNA dosáhne určité kritické prahové hodnoty. Náhodné přerozdělení nemutované a mutované mtDNA během buněčného dělení vede k situaci, kdy se různá hladina heteroplazmie vyskytuje v jednotlivých mitochondriích, v jednotlivých buňkách nebo tkáních. Rozdílné zastoupení mutovaných a nemutovaných molekul mtDNA v jednotlivých tkáních nemocného je ovlivněno i rozdílnou rychlostí buněčného dělení. •40 • •40 •Protein p53 – strážce genomu •Gen p53 koduje protein, který brání buňce s poškozenou DNA vstoupit do S-fáze. •Protein p53 je transkripční faktor aktivovaný fosforylací •Je aktivován při poškození DNA •Fosforylovaný p53 působí jako transkripční faktor a indukuje syntézu proteinu p21, příp.PUMA a NOXA •p21 působí jako Cdk-inhibitor •Zprostředkuje dočasné zastavení b. cyklu v G1/S kontrolním bodě •zvyšuje expresi proteinů potřebných pro reparaci DNA • pokud není oprava úspěšná, zvyšuje se exprese Bax ® apoptóza • •Ztráta nebo poškození p53 je spojena s více než 50 % nádorových onemocnění •Poškození DNA, oxidační stres •Proteinkinasy ATM, ATR • •p53 •p53 •P •ATP •ADP • •p21 •Zástava cyklu, opravy •apoptóza •PUMANOXA •BAX P53 je tumorsupresorový protein o molekulové hmotnosti 53 kDa.