Syntéza a postranskripční úpravy RNA Ó Biochemický ústav LF MU (ET, JG) 2018 •2 •5´ •3´ •G G A T C •3´ •5´ •C C T A G •5´ •3´ •G G A U C •Kódující řetězec •Templátový řetězec •DNA •RNA •transkripce •DNA •Proces tvorby RNA na podkladu struktury DNA •Je přepisován pouze jeden řetězec dvoušroubovice DNA – templátový řetězec •Druhý řetězec se nazývá kódující (jeho sekvence bází odpovídá transkriptu, pouze místo U je T) •Syntéza RNA probíhá opět ve směru 5´® 3´ • •Transkripce Na rozdíl od replikace, transkripce probíhá neustále. Přepisují se jen určité úseky DNA. Geny mohou být transkribovány z obou řetězců; jako templát je na daném úseku DNA využíván obvykle jen jeden z retezců. •3 •K transkripci jsou nezbytné: üDvouvláknová DNA üRNA-polymeráza üATP, GTP, CTP, UTP üMg2+ ionty •Transkripce má tři fáze: üIniciace üElongace üTerminace •4 •Replikace x transkripce Replikace Transkripce Enzymy Lokalizace Zahájení Průběh Kontrola Nukleotidy DNA-polymerázy na chromosomu v S fázi vyžaduje RNA primer kopírována obě vlákna polymeráza má zpětnou kontrolu správného zařazení posledního nukleotidu dATP, dGTP, dCTP, dTTP RNA-polymerázy vybraný segment DNA nevyžaduje primer kopírováno pouze jedno vlákno polymeráza nemá zpětnou kontrolu správného zařazení posledního nukleotidu ATP, GTP, UTP, CTP •5 •Transkripce u prokaryontů a eukaryontů •Prokaryonty •Eukaryonty •6 •Enzym zodpovědný za transkripci je DNA-dependentní RNA polymerasa (transkriptasa – RNAPol) •Prokaryonty: üJedna polymeráza ü(5 podjednotek plus sigma faktor, který se zapojuje pouze do iniciace) üPřepisuje všechny formy RNA •Eukaryonty üČtyři různé RNA polymerázy: üRNA pol I – syntéza rRNA (45 S RNA v jadérku) üRNA pol II – syntéza mRNA, sn RNA (jádro) üRNA pol III – syntéza tRNA, 5S RNA (jádro) •Mají stejný mechanismus účinku, rozlišují různé promotory. •Většina genů u eukaryontů je přepisována RNA-polymerázou II •7 •Amanitin •Inhibitor eukaryontních RNA polymeráz (hlavně typu II) Strukt_vzorec_a-amanitin •8 •3 fáze transkripce ü ü Iniciace ü Elongace ü Terminace ü •9 •Účinek RNA polymeráz üSyntéza nové RNA probíhá ve směru 5´→3´ üK syntéze jsou potřebné ATP, GTP, CTP, UTP üKaždý nukleotid se páruje s komplementární bází na templátovém vlákně üPolymeráza tvoří fosfoesterovou vazbu mezi 3´-OH ribózy na rostoucím RNA vláknu a a-fosfátem navázaným na 5´OH ribózy vstupujícího nukleotidu ü Energie polymerace je kryta štěpením NTP ü Neexistuje zpětná kontrola řazení bází •+ PPi •OH •OH •10 •Rozpoznání templátu üRNA polymeráza (RNAP) vytvoří stabilní komplex s templátovou DNA v místě promotoru üV místě promotoru se nachází konvenční sekvence ü(sekvence, které se obecně najdou v určité oblasti mnoha zkoumaných genů) ü ü •11 •Promotor u prokaryontů üV pozici asi -10 b obsahuje Pribnowův box TATAAT üV pozici asi -35 b další sekvence TTGACA üTyto sekvence jsou rozeznány s -faktorem prokaryotické RNA polymerázy ü •Sekvence v promotoru prokaryontů •-35 •Pribn.box •~ 15 b •Start transkripce •~ 10b Počáteční místo transkripce odpovídá 5‘ nukleotidu DNA v kódujícím řetězci, který je označený +1. Číslování pokračuje jako +2,+3 atd. směrem k 3‘-konci. Nukleotid, který sousedí s počátkem transkripce směrem k 5‘-konci se značí -1. •12 •Transkripce u prokaryontů •Iniciace: üVazba RNA-polymerázy do promotorové oblasti DNA prostřednictví sigma podjednotky üLokální rozvinutí vláken DNA RNA-polymerázou üPárování bází z ribonukleotidů s templátovým vláknem a tvorba fosfodiesterových vazeb mezi prvními ribonukleotidy • • •promotor •Počátek syntetizované RNA •Směr pohybu RNA polymerasy • •s Bakteriální RNA polymerasa se skládá z 5 podjednotek, které jsou asociovány se sigma faktorem. Samotný enzym nemá žádnou specifitu. Sigma podjednotka je DNA vázající element, který odpovídá za rozpoznání a navázání na specifickou nukleotidovou sekvenci promotoru. Transkripce je zahájena navázáním -faktoru do promotorové oblasti. To vyvolá rozvolnění dvojitého helixu DNA kolem místa startu transkripce (+1). Vzniká preinciační komplex. Jakmile se preiniciační komplex dostane k místu +1, váže se k templátové DNA první nukleotid a stává se 5‘ koncem řetězce mRNA. Po té se další báze ribonukleotidů párují s bázemi na DNA, nukleotidy jsou spojovány fosfodiesterovou vazbou účinkem RNA polymerasy. Po zahájení syntézy, jakmile délka polynukleotidového řetězce dosáhne cca 10-20 nukleotidů, se -podjednotka oddělí. mRNA u prokaryontů je multigenní. Slouží bezprostředně jako matrice pro syntézu proteinů a velmi rychle se rozkládá ribonukleázou. •13 •Transkripce u prokaryontů •Elongace: üUvolnění podjednotky sigma z RNA-polymerázy üPohyb RNA-polymerázy podél DNA ve směru transkripce, rozvíjení dvoušroubovice i opětné svinování (vytváření transkripční bubliny) üTvorba kovalentních vazeb mezi nukleotidy üVznikající RNA je vytěsňována z templátového vlákna • •Terminační signál – ukončení elongace Transkripce pokračuje, dokud RNA polymerasa nedosáhne terminačního signálu. U prokaryontů se nachází tzv. Rho faktor, který rozpozná specifické terminační signály a navazuje se na DNA za spotřeby ATP. RNA polymerase se nemůže dále posouvat, enzym se oddělí a následně se uvolní i nově syntetizovaná RNA. •14 •Transkripce u eukaryontů üMnohem složitější üVíce RNA polymeráz üVelké množství transkripčních faktorů üStruktura chromatinu musí být před transkripcí rozvolněna – euchromatin Živočišné RNA polymerasy se skládají z více podjednotek, např.RNA polymerasa ze 14ti. Transkripce probíhá rychlostí cca 20 nukleotidů/s •15 •Promotor u eukaryontů (RNA polymerasa II) • üTranskripce eukaryontních genů je mnohem komplikovanější üJe zapojena řada transkripčních faktorů, které se váží k různým úsekům DNA • üPromotor obsahuje TATA box analogický Pribnowově sekvenci (ATATAA) – určuje pravděpodobně místo startu – vazba bazálních transkripčních faktorů üV pozici asi -100–200 jsou 1–2 další regulační sekvence (CAAT box, GC box) – určuje pravděpodobně frekvenci startu (promotorové proximální sekvence) üVzdálené regulační sekvence (mimo promotor) – vážou specifické transkripční faktory ü •16 •Start transkripce •~ -25 b •~ -40 b •Některé sekvence v promotoru eukaryontů • •TATA • •CAAT •Promotor u eukaryontů •17 •Bazální transkripční faktory u eukaryontů üMusí být navázány na RNA-polymerázu před startem transkripce a jsou současně asociovány s promotorovými sekvencemi üSamotná RNA-polymeráza nemůže zahájit transkripci üJsou nezbytné pro rozpoznání promotoru a místa startu ü üBazální = jsou potřebné pro transkripci všech genů •18 •Bazální transkripční faktory üTFIID – největší z bazálních faktorů transkripce üMá celkem 11 podjednotek üJednou podjednotkou je TBP (TATA box binding protein) üTBP se váže k TATA boxu, na ni nasedají další podjednotky TXIID üPo té se navazují další TF (TFIIA,B,F,E,H) a RNA-polymeráza •http://www.youtube.com/watch?v=WsofH466lqk Zatímco boxy leží na stejné DNA jako přepisovaný gen a označují se jako cis-aktivní elementy, transkripční faktory (proteiny) jsou produkty jiných genů a nazývají se trans-aktivní faktory. •19 •Genově specifické regulační proteiny üSpecifické transkripční faktory jsou proteiny, které se vážou v regulačních sekvencích mimo promotor, často velmi vzdálených. üPůsobí jako aktivátory nebo represory transkripce příslušného genu. üSpecifické transkripční faktory interagují s mediátorovými proteiny (koaktivátory, korepresory), které jsou v kontaktu s bazálními transkripčními faktory. üTypický gen kódující syntézu proteinu u eukaryontů má na DNA vazebná místa pro řadu specifických transkripčních faktorů Jejich prostřednictvím je genová exprese přizpůsobována potřebám buňky či celého organismu (např. hormony, hypoxie mohou stimulovat expresi – transkripci určitých genů). Toto přizpůsobení může být značně rychlé, během hodiny může vzniknout až několik tisíc transkriptů jednoho úseku DNA. Některé TF musí být nejdříve aktivovány např. fosforylací nebo odstraněním inhibitoru. •20 •Specifické regulační sekvence (enhancery, silencery, HRE, HSRE) ü Jsou na stejném chromosomu jako daný gen ü Ale mohou být vzdáleny „upstream“ nebo „downstream“ od místa transkripce ü Mohou blízko promotoru, ale také několik tisíc bází vzdáleny üK interakci mezi transkripčními faktory vážícími se ve vzdálené oblasti a bazálními transkripčními faktory dochází díky tvorbě smyček ve struktuře DNA a účinku mediátorových proteinů ü •21 • •TF IID • •Pol II • •CTD •~ 2 000 bp • • • • • •Mediatorové proteiny • •TF IID • •Pol II • •CTD •Regulační sekvence •~ 2 000 bp • •promotor •Specifický transkripční faktor •Bazální transkripční komplex •(Pol II a bazální faktory) • •upstream •Specifické transkripční faktory Specifický transkripční faktor je bílkovina, která má několik domén ve své struktuře. DNA-vázající doména se váže na specifické regulační sekvence DNA (viz též dále) Trans-aktivační doména - obsahuje vazebná místa pro další proteiny fungující jako koregulátory transkripce Ligand vázající doména - nemusí být přítomna (je u jaderných receptorů) Mohou být přítomny i další domény •22 •Jaderné receptory hormonů jsou specifické transkripční faktory ü Receptory hormonů se nachází v neaktivní formě v jádře nebo v cytoplazmě. üV neaktivní formě vážou inhibiční protein (např. heat shock protein). ü Hormon pronikne cytoplazmatickou membránou do buňky a specificky se váže k receptoru v cytoplazmě nebo jádře. ü Inhibiční protein se oddělí, vzniká komplex hormon-receptor, konformace receptorové bílkoviny se mění. ü Cytoplazmatický komplex hormon receptor je translokován do jádra. ü V jádře působí komplex hormon-receptor jako specifický transkripční faktor a váže se na DNA v místě specifické regulační sekvence ( = hormon response element HRE) üReceptor s hormonem navázaný na DNA reaguje rovněž s koaktivátorem (mediátorový protein), který je v kontaktu s bazálním transkripčním komplexem. Tím se vypíná nebo zapíná proces transkripce. ü Steroidní hormony, thyroidní hormony, retinoidy a vitamin D jsou lipofilní látky a v plazmě jsou transportovány ve vazbě na bílkoviny. Mohou přecházet přes plazmatickou membránu a v cytoplazmě nebo v jádře se vážou na intracelulární receptory a vytváří komplex hormon-receptor (H-R). Komplex hormon-receptor působí v jádře, kde se váže na hormon response element (HRE) v regulační sekvenci DNA. Slouží tedy jako transkripční faktor. Některé komplexy H-R tvoří před vazbou na DNA dimery buď asociací dvou stejných receptorových molekul (homodimery) nebo asociací s jiným receptorem, nejčastěji s retinoidovým receptorem RXR (heterodimery). Navázání komplexu hormon-receptor současně aktivuje navázání koaktivátorů, jejichž prostřednictvím se aktivuje zahájení transkripce v místě promotoru. Steroidní hormony se vážou k receptorům v cytoplazmě a tvoří homodimery (viz příklad kortisolu), receptory nesteroidních ligandů se vážou ve formě homodimerů nebo heterodimerů v jádře (viz příklad trojodthyroninu) . •23 • •TF IID • •Pol II • •CTD •> 1 000 bp • • • •mediatorové proteiny • • •GRE • • • •kortisol-GR •promotor • •basalní •transkripční •komplex •Účinek kortizolu •GRE – glukokortikoid response elememnt Po difuzi přes cytoplazmatickou membránu se kortisol váže na glukortikoidní receptor GR. Před vazbou kortisolu tvoří receptor v cytoplazmě komplex s dimerem heat shock proteinu Hsp90 (chaperon) a dalšími proteiny, které pomáhají udržet receptoru správné prostorové uspořádání. Po navázání kortisolu se Hsp90 s ostatními proteiny oddělí, komplex kortisol-receptor dimerizuje a je translokován do jádra. Zde se váže na glukortikoidní response element GRE a za spoluúčasti mediátorových proteinů a koaktivátorů aktivuje transkripci genu. •24 •Transkripční faktory a zahájení transkripce u eukaryontů üTranskripce je zahájena teprve po navázání všech transkripčních faktorů üRNA-polymeráza se váže k transkripčním faktorům a DNA üDvojitý helix DNA se rozvíjí a polymeráza je „sunuta“ k místu startu üJe zahájena transkripce üPo zahájení transkripce se většina transkripčních faktorů oddělí •25 •Elongace a terminace üRNA-polymeráza se pohybuje po DNA, rozvíjí dvoušroubovicovou strukturu üVznikající RNA nezůstává spojena s DNA vodíkovými můstky üHned za místem, kde byl přidán nový nukleotid dochází k obnovení dvoušroubovice a vytěsnění vlákna RNA üUvolňování RNA z templátového řetězce umožňuje vznik dalších kopií ještě před ukončením syntézy první RNA üPodle jednoho genu může být současně transkribováno několik tisíc molekul RNA üO terminaci u eukaryontů je známo jen velmi málo. •Capping hned po uvolnění RNA – CE(capping enzyme), MT-methyltransferase • •RNA-DNA hybrid •26 • • • • • •5´ •5´ • •H •N •N •O •N •H •2 •N •N •O •O •H •O •H •C •H •2 •C •H •3 •+ •O •P •P •P •C •H •2 •O •P •O •C •H •2 •O •O •C •H •3 •base •base • •5´-5´ trifosfátová vazba •Tvorba čepičky u hnRNA- capping üProbíhá hned na počátku elongace na 5´-konci pomocí specifických enzymů. üČapka i polyA sekvence jsou důležité pro zahájení translace v cytoplazmě. •Navázání 7-methylguanosinu (z GTP) 5´-5´fosfátovou vazbou – na čapku se váže komplex proteinů, které chrání RNA před působením 5´-exonukleáz a pomáhají při zavádění mRNA přes nukleární póry do cytoplazmy •5´-konec RNA •27 •Terminace üProces elongace je ukončen při dosažení terminačního signálu. üTranskripčnéí komplex se rozpadá a uvolňuje vzniklou molekulu BNA üU prokaryontů je terminace üzávislá na r faktoru ünezávislá na r faktoru üU eukaryontů je o terminaci málo známo •28 •Syntéza DNA - 1chyba/1010 nukleotidů •Syntéza RNA – 1 chyba/104 nukleotidů •U transkripce chybí proofreeding üRNA polymerázy nevlastní nukleolytickou korigující (proofreading) aktivitu. ü üToto chybění korekce (proofreading) odráží skutečnost, že transkripce nemusí být tak přesná jako DNA replikace, protože RNA není používána jako trvalá zásobní forma genetické informace. ü •29 •Úprava primárních transkriptů üPrimární transkript je přesnou kopií transkripční jednotky üPrimární transkripty tRNA a rRNA u prokaryontů i eukaryontů jsou posttranskripčně modifikovány ribonukleázami üProkaryontní mRNA je prakticky identická s primárním transkriptem (k translaci slouží ještě před ukončením syntézy) üEukaryontní RNA podléhá rozsáhlým následným modifikacím – probíhají kotranskripčně •30 •Úprava eukaryontní mRNA üPrimární transkript je hnRNA üJe přepisem strukturního genu, v němž jsou kódující sekvence (exony) střídány sekvencemi nekódujícími (introny nebo intervenujícími sekvencemi) • • • • •Exon •1 • • •Exon •2 •Exon •3 •Exon •4 •Intron •1 •Intron •2 •Intron •3 ünekódující sekvence musí být odstraněny z primární RNA během úprav (processingu) • •31 üChemická modifikace (navázání 7-methylquanosinu 5´-5´fosfátovou vazbou) üna ni se váže komplex proteinů, které chrání před působením 5´exonukleáz a pomáhají při zavádění RNA přes nukleární póry do cytoplasmy ü üSestřih (odstranění sekvencí odpovídajích intronům) ü üPolyadenylace (adice 3´ polyA ) – brání účinku 3´exonukleáz •Úprava hnRNA v jádře •32 •Sestřih hnRNA - splicing üProbíhá působením jaderných enzymových komplexů – splicesomů üSplicesomy obsahují pět malých RNA (U1, U2,U4,U5 a U6) üJsou asociovány s proteiny a tvoří snRNPs (small nuclear ribonucleoprotein particles). üSekvence AGGU určují hranice mezi intronem a exonem. üTyto sekvence jsou rozpoznány snRNPs. •5´-----AGGU-------AGGU------3´ • • •exon •exon •intron •33 •Alternativní sestřih üPři typickém sestřihu jsou všechny exony primárního RNA transkriptu spojeny dohromady za vzniku mRNA pro syntézu specifického proteinu üAlternativní sestřih – různé skupiny exonů z jednoho genu tvoří různé mRNA vedoucí k syntéze různých proteinů • • • • • • • •Exon 1 •Exon 4 •Exon 3 •Exon 2 • • • • • • • •Primární transkript •Alternativní sestřih • •Exon 1 Exon 2 Exon 3 • •Exon 1 Exon 2 Exon 4 •Protein A •Protein B •34 •Gen pro a-tropomyosin •Alternativní sestřih m RNA •Transkripce, sestřih •exony •introny •mRNA - kosterní sval •mRNA - hladký sval •mRNA - fibroblast •35 •Poruchy sestřihu üVedou ke genetickým chorobám üPř. b - thalasemie: üb -podjednotka hemoglobinu se netvoří v normálním množství üG na 5´sekvenci sestřihu je mutován na A a proto je primární transkript sestřižen nesprávně